李琪，莫家祺，王藝，邱洋，杜蕾蕾，范剛

藏藥四數(shù)獐牙菜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李琪1，莫家祺2，王藝2，邱洋2，杜蕾蕾2，范剛2

目的：建立藏藥四數(shù)獐牙菜藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用《中國(guó)藥典》方法測(cè)定水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的含量，采用顯微、薄層色譜法建立藥材鑒別方法，采用HPLC法測(cè)定藥材中龍膽苦苷的含量。結(jié)果：確定了四數(shù)獐牙菜藥材的顯微鑒別特征，建立了以龍膽苦苷為指標(biāo)的薄層鑒別及含量測(cè)定方法。四數(shù)獐牙菜藥材中龍膽苦苷的平均含量為3.11%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可用于藏藥四數(shù)獐牙菜藥材的質(zhì)量控制。

藏藥；四數(shù)獐牙菜；龍膽苦苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

四數(shù)獐牙菜Swertia tetraptera Maxim為龍膽科獐牙菜屬植物，主要生長(zhǎng)于西藏、青海、四川、甘肅等高海拔地區(qū)。四數(shù)獐牙菜為藏藥“蒂達(dá)”基原植物之一，具有清肝利膽之功效，主要用于治療黃疸型肝炎、膽囊炎等肝膽疾病[1]?，F(xiàn)代研究表明，四數(shù)獐牙菜含有龍膽苦苷、獐牙菜苦苷及齊墩果酸等化學(xué)成分[2,3]，這些成分具有鎮(zhèn)痛、保肝利膽、抗炎和抗菌等生物活性[4～6]。目前，已有文獻(xiàn)采用HPLC法測(cè)定了四數(shù)獐牙菜中龍膽苦苷等成分的含量[2,3]，但四數(shù)獐牙菜藥材規(guī)范化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為了提高藏藥四數(shù)獐牙菜的質(zhì)量控制水平，本研究首次建立了四數(shù)獐牙菜藥材完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，包括水分、總灰分及酸不溶性灰分檢查，浸出物測(cè)定，顯微鑒別和薄層鑒別，并且采用HPLC法測(cè)定了四數(shù)獐牙菜藥材中主要有效成分龍膽苦苷的含量，為其開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀；Sartorius BP121s電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CQ-250超聲波清洗器（上海必能信有限公司）。龍膽苦苷對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)110770-200308），乙腈為色譜純（Fisher），水為超純水，其余試劑均為分析純。本研究共收集6批四數(shù)獐牙菜藥材樣品，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)范剛副研究員鑒定為龍膽科獐牙菜屬植物四數(shù)獐牙菜Swertia tetraptera，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分的測(cè)定

水分測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0832第二法；總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2302。6批樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。水分的平均值為9.03%，總灰分的平均值為5.34%，酸不溶性灰分的平均值為3.22%。

2.2 浸出物的測(cè)定

取各批次小檗皮藥材粉末約2 g，精密稱定，以30%乙醇作為提取溶劑，參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。浸出物的平均值為25.87%。

表2 四數(shù)獐牙菜中水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及龍膽苦苷含量測(cè)定結(jié)果

2.3 顯微鑒別

取6批四數(shù)獐牙菜藥材樣品，分別粉碎，按照顯微鑒別法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2001），觀察其粉末的顯微特征。本品粉末灰綠色至黃棕色。纖維單個(gè)散在或成束，直徑10～18 μm。氣孔多見(jiàn)或少見(jiàn)，保衛(wèi)細(xì)胞腎形或半月形，多未見(jiàn)副衛(wèi)細(xì)胞。薄壁細(xì)胞類方形。木栓細(xì)胞長(zhǎng)方形，排列緊密?；ǚ哿５S色，多見(jiàn)，呈類圓形，有三個(gè)萌發(fā)孔，表面有細(xì)小雕紋，直徑25～30 μm。導(dǎo)管多為螺紋，可見(jiàn)具緣紋孔導(dǎo)管及網(wǎng)紋導(dǎo)管，直徑12～20 μm。見(jiàn)圖1。

圖1 四數(shù)獐牙菜藥材粉末的顯微特征圖

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.4.3 薄層色譜條件及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版第四部通則0502)試驗(yàn)，吸取對(duì)照品和供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(10:2:1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 四數(shù)獐牙菜藥材中龍膽苦苷的薄層色譜鑒別圖譜

2.5 四數(shù)獐牙菜藥材中龍膽苦苷的HPLC含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 InertSustain? C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（20:80），恒度洗脫。在此色譜條件下，龍膽苦苷與其他色譜峰分離度良好。對(duì)照品溶液和供試品溶液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配置成濃度為1.048mg/mL的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別取龍膽苦苷對(duì)照品溶液（1.048 mg/mL）2、5、8、12、15、20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，以對(duì)照品峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得龍膽苦苷的回歸方程為Y=1268.5X+151.29，r2=0.9999，龍膽苦苷在2.096～20.96 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取四數(shù)獐牙菜藥材粉末約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，按“2.5.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果龍膽苦苷含量的RSD值為0.18%，RSD＜3%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取四數(shù)獐牙菜藥材粉末約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，分別精密吸取該供試品溶液10 μL，于0、1、2、4、6、12、24 h時(shí)測(cè)定其峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果龍膽苦苷含量的RSD值為0.32%，RSD＜3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取四數(shù)獐牙菜藥材粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下，分別精密吸取該供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果表明六份樣品中龍膽苦苷含量的RSD為1.90%，RSD＜3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的四數(shù)獐牙菜藥材粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，置不同的錐形瓶中，按已知含量的100%加入龍膽苦苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備，依次測(cè)定龍膽苦苷的含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。龍膽苦苷的加樣回收率在95～105%之間，平均回收率為96.82%，RSD為1.36%。

表3 龍膽苦苷加樣回收率結(jié)果

2.5.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取不同批次四數(shù)獐牙菜藥材粉末，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下依次測(cè)定，計(jì)算龍膽苦苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

四數(shù)獐牙菜主要含有龍膽苦苷、獐牙菜苦苷及齊墩果酸等有效成分[2,3]?，F(xiàn)代研究表明[4]，龍膽苦苷具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝利膽等作用，這與四數(shù)獐牙菜的臨床功能主治相吻合。因此，本文選擇龍膽苦苷作為四數(shù)獐牙菜藥材的薄層鑒別及含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

3.2 浸出物的測(cè)定

在浸出物測(cè)定試驗(yàn)中，本文考察了冷浸法與熱浸法對(duì)提取效率的影響，結(jié)果熱浸法測(cè)得的浸出物含量較高。此外，分別考察了4種提取溶劑(水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇)對(duì)浸出物提取的影響，結(jié)果以30%乙醇所得的浸出物含量最高，因此選擇30%乙醇作為四數(shù)獐牙菜浸出物測(cè)定的提取溶劑。

3.3 含量測(cè)定

本研究采用常規(guī)的高效液相色譜法，測(cè)定了不同產(chǎn)地四數(shù)獐牙菜藥材中龍膽苦苷的含量，結(jié)果6批藥材的龍膽苦苷平均含量（以干燥品計(jì)）為3.11%。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地四數(shù)獐牙菜藥材的龍膽苦苷含量有較大的差異，其中四川省阿壩州紅原縣刷經(jīng)寺的藥材中龍膽苦苷含量最高(5.26%)，甘肅省卓尼縣申藏鄉(xiāng)次之(4.58%)，而青海省黃南州同仁縣的四數(shù)獐牙菜藥材中龍膽苦苷含量最低(1.42%)，這可能是由于土壤、氣候等生態(tài)因子的不同影響了藥材中龍膽苦苷成分的形成和積累。

3.4 限量標(biāo)準(zhǔn)制定建議

本研究收集的6批樣品來(lái)自四川、青海、甘肅等高原藏族地區(qū)，樣品具有代表性，研究結(jié)果能充分反映四數(shù)獐牙菜藥材的實(shí)際情況。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，按照《中國(guó)藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，并參考《中國(guó)藥典》2015年版中龍膽、秦艽等龍膽科類藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建議規(guī)定四數(shù)獐牙菜藥材的水分不得過(guò)11.0%，總灰分不得過(guò)7.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)4.0%；照醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用30%乙醇作溶劑，浸出物不得少于20.0%；按干燥品計(jì)算，本品含龍膽苦苷（C16H20O9）不得少于1.50%。

[1] 西藏、青海、四川、甘肅、云南、新疆衛(wèi)生局. 藏藥標(biāo)準(zhǔn)[S]. 西寧: 青海人民出版社,1979: 82.

[2] 梁永欣, 林鵬程,盧永昌,等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定四數(shù)獐牙菜中4種有效成分含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,(10):2163-2164.

[3] 王延花,孫菁, 周國(guó)英, 等. 三種獐牙菜屬植物中6種苷類成分的HPLC法測(cè)定[C]. 第五屆色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)暨甘肅省第十屆色譜年會(huì)論文集, 2008, 159-163.

[4] 王焱, 曾文雪, 宋小玲, 等. 龍膽苦苷藥學(xué)研究進(jìn)展及其臨床配伍應(yīng)用[J]. 西北藥學(xué)雜志, 2012,(5):502-505.

[5] 李宏亮, 白敏, 宋秋艷, 等. 天然活性成分獐芽菜苦苷的研究進(jìn)展[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, (4):66-70.

[6] 昌盛, 李龍. 齊墩果酸藥理作用研究進(jìn)展[J]. 廣州化工, 2011,(14):30-32.

Study on the quality standard of Tibetan medicine Swertia tetraptera Maxim.

/LI Qi1, MO Jia-qi2, WANG Yi2, QIU Yang2,DU Lei-lei2, FAN Gang2//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To establish the quality standard of Swertia tetraptera Maxim.(S.tetraptera).Method:The moisture,total ash, acid-insoluble ash and alcohol-soluble extract were detected according to the procedures recorded in Chinese Pharmacopoeia (2015 edition). The medicinal material was identified by microscopy and thin-layer chromatography (TLC)methods, and gentiopicroside was detected by HPLC method.Result:Microscopic characteristics of S. tetraptera were clarified.TLC and quantitative analysis method were established with gentiopicroside as index. The average content of gentiopicroside in S.tetraptera was 3.11%.Conclusion:The established method is simple to operate, having good stability and reproducibility, and can be used for quality control of S. tetraptera in the future.

Tibetan medicine; Swertia tetraptera Maxim.; gentiopicroside; quality standard

R 282

A

1674-926X(2017)05-004-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金(ZRQN1637).

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137。

李琪，碩士研究生，研究方向?yàn)槊褡逅庂|(zhì)量評(píng)價(jià)研究 Email: nikki777@qq.com

范剛，博士，副研究員，研究方向?yàn)槊褡逅庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究Tel:(028)61800160 Email:fangang1111@163.com

2017-03-09

（責(zé)任編輯：）