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·綜述講座·

Wilson病非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅研究進(jìn)展

汪世靖程楠韓詠竹

[關(guān)鍵詞]Wilosn病；非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅；作用機(jī)制；研究進(jìn)展

Wilson’s病(Wilson disease,WD)是一種遺傳因素導(dǎo)致的銅代謝障礙疾病，以肝臟和腦損傷為主要臨床表現(xiàn)[1]；WD最早在1912年由Samuel Kinnier Wilson首次詳細(xì)報(bào)道[2]，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是一種罕見的家族性疾病以進(jìn)展性的豆?fàn)詈俗冃院透斡不癁橹饕卣鳎珜?duì)其發(fā)病原因尚不清楚。1928年Hall首先提出基因致病的可能，1993年WD的致病基因ATP7B基因被定位在13號(hào)常染色體[3, 4]，由于該基因編碼的ATP7B蛋白的減少，導(dǎo)致WD患者體內(nèi)銅的排出障礙而在體內(nèi)蓄積，最終引起肝臟損傷和以錐體外系為主的臨床癥狀。因此，驅(qū)銅治療自Walshe[5]首次使用青霉胺開始就一直作為WD的主要治療手段。而體內(nèi)大多數(shù)銅是與銅藍(lán)蛋白穩(wěn)定結(jié)合，不能被驅(qū)銅藥物絡(luò)合而排出體外，對(duì)WD的病理?yè)p傷相對(duì)較??；而非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅則對(duì)WD的發(fā)病、治療具有重要意義?，F(xiàn)將國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道綜述如下。

1非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅

銅藍(lán)蛋白是一種α-1-酸性糖蛋白，90%的WD患者銅藍(lán)蛋白水平低于正常人；一般來(lái)說(shuō)，銅作為體內(nèi)重要的微量元素，主要以兩種形式存在，結(jié)合銅和離子銅，結(jié)合銅又包括與銅藍(lán)蛋白穩(wěn)定和非銅藍(lán)蛋白結(jié)合的銅；結(jié)合銅和游離銅之間可以迅速交換。這種氧化還原屬性必須在其酶活性銅的作用下完成。然而，未結(jié)合或游離銅可以快速生成活性氧和對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生有害影響[6]。Walshe等[7]研究發(fā)現(xiàn)正常人血清中游離銅總量約占10%，而WD患者由于體內(nèi)銅藍(lán)蛋白含量的下降則導(dǎo)致了游離銅總量的升高。但隨后其發(fā)現(xiàn)游離銅的概念不能精確的說(shuō)明這種非結(jié)合狀態(tài)下的銅，因此提出非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的概念。為說(shuō)明血清游離銅和WD患者之間的關(guān)系，Walshe[8]對(duì)320位WD患者的血清游離銅和尿銅之間的進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，WD患者血清游離銅和尿銅之間的比率從治療前的7 ∶1下降致治療后的5 ∶1，且結(jié)果相對(duì)分散并無(wú)直接的線性關(guān)系。因此，Walshe提出將游離銅的說(shuō)法更改為更復(fù)雜的非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的概念，并且說(shuō)明了非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅中大多數(shù)是與白蛋白結(jié)合，在腎臟出現(xiàn)損傷時(shí)，這部分銅可通過(guò)腎臟排出體外。

2非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的分離和檢測(cè)方法

由于WD患者非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅含量較低，如何精確的分離和檢測(cè)非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅，尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。Bohrer等[9]比較了超濾法和固相萃取法分離血清游離銅和蛋白結(jié)合銅在WD診斷中的應(yīng)用，應(yīng)用石墨爐法對(duì)兩組樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明固相萃取法相比與超濾法具有需要的血清標(biāo)本量少、分離時(shí)間短、精確度和準(zhǔn)確度更高的優(yōu)點(diǎn)。張?jiān)吹萚10]應(yīng)用石墨爐法測(cè)定乙醇-EDTA法分離的血清中不同形態(tài)的銅和鋅，其中銅檢測(cè)限為1.2 μg/L，回收率為92.3%～104.0%；正常人血清樣品非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅約占總銅含量的8%，WD患者的血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅約占總銅含量的20%；因此提出該方法可作為檢測(cè)血清中蛋白質(zhì)緊密結(jié)合和疏松結(jié)合的銅含量。

作者單位： 230038合肥安徽中醫(yī)藥大學(xué)(汪世靖)

230061合肥安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院(汪世靖，程楠，韓詠竹)

雖然上述兩種方法均可很好的分離WD患者血清中非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅和銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅，但所應(yīng)用的均為未進(jìn)行驅(qū)銅治療前的WD患者血清標(biāo)本，而很多WD患者在經(jīng)驅(qū)銅治療后體內(nèi)總銅含量均會(huì)降至較低水平，此時(shí)上述石墨爐法檢測(cè)血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的檢測(cè)精密度如何尚不可知。因此，仍需探討檢測(cè)精密度更高的檢測(cè)法對(duì)驅(qū)銅治療后WD患者血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的檢測(cè)限。

3非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅在WD發(fā)病機(jī)制中的作用

由于非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅約占體內(nèi)銅總量的10%，且這部分銅是處于不穩(wěn)定結(jié)合狀態(tài)，能夠被銅絡(luò)合劑絡(luò)合而排出體外。因此，非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅在WD發(fā)病機(jī)制中是否占據(jù)一定地位成為研究探討的熱點(diǎn)。

銅在WD發(fā)病的過(guò)程中占據(jù)重要地位，WD主要的發(fā)病機(jī)制是由于遺傳因素導(dǎo)致的銅代謝障礙，使得銅在體內(nèi)大量蓄積而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。關(guān)于WD病因?qū)W的研究認(rèn)為[11]，基因遺傳因素是導(dǎo)致WD患者體內(nèi)銅過(guò)量蓄積的主要因素。Purchase[12]認(rèn)為WD患者體內(nèi)銅過(guò)量的原因是膽道排銅功能損傷引起的，銅作為重要的微量元素參與了紅細(xì)胞生成、合成線粒體氧化呼吸作用重要酶的輔助因子以及神經(jīng)遞質(zhì)的合成等等，不僅銅缺乏將導(dǎo)致生理活動(dòng)中很多重要的酶缺乏，而且過(guò)量的銅則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害。近年來(lái)相關(guān)研究[13]表明神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)包膜上的銅轉(zhuǎn)運(yùn)體Ctr1蛋白將銅轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)，其中絕大部分與還原性谷胱甘肽、金屬巰蛋白等結(jié)合；而在胞內(nèi)的銅則由Cox17蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，參與細(xì)胞色素C氧化酶的合成；過(guò)量的銅則與Atox1蛋白結(jié)合被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體與ATP7B蛋白結(jié)合排出細(xì)胞。但WD患者由于ATP7B蛋白的缺乏，致使過(guò)量的銅在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，引起銅相關(guān)蛋白的功能異常，線粒體酶Cytox功能受損，誘發(fā)凋亡信號(hào)的釋放，觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[14]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明高銅誘導(dǎo)的神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激-凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有：銅導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，線粒體功能失調(diào)，激活c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinaes,JNK)[15]和Caspase-3信號(hào)傳導(dǎo)通路[16]；蛋白激酶p38通路的激活和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路的抑制，非JNK通路的激活[17]；Brewer[18]發(fā)現(xiàn)銅誘導(dǎo)激活的酸性鞘磷脂水解酶分泌和神經(jīng)酰胺釋放；后者可以激活p38/SAPK、JNK等細(xì)胞信號(hào)通路；促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，與凋亡蛋白酶活化因子-1結(jié)合，導(dǎo)致Capase-9活化而激活caspase-3、6、7，引起神經(jīng)元凋亡[19]。而銅與銅藍(lán)蛋白結(jié)合較為緊密，不易分離，因此，有研究提出，非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅可能與WD的發(fā)病存在一定的聯(lián)系[20]，且WD患者體內(nèi)非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的含量較正常人水平高，而非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅與白蛋白、金屬巰蛋白等結(jié)合較為疏松，容易發(fā)生解離通過(guò)線粒體氧化應(yīng)激作用產(chǎn)生細(xì)胞損傷，但目前尚無(wú)實(shí)驗(yàn)依據(jù)證明。因此，非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅是否通過(guò)上述途徑對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

4非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅與WD驅(qū)銅治療后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重

周香雪等[21]使用青霉胺治療的40例WD患者，15例(46.9%)患者出現(xiàn)神經(jīng)癥狀加重，且癥狀加重的患者腦脊液銅含量較治療前升高，血清銅較治療前降低，而尿銅排出量則顯著低于治療前。因此，青霉胺治療引起WD患者神經(jīng)癥狀加重的原因可能是腦銅的增加引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)；WD患者銅藍(lán)蛋白水平較正常人低，患者腦銅總量增加時(shí)非銅藍(lán)蛋白增加則更為明顯；因而新近出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷則可能是由非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅通過(guò)氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生。Chen等[22]對(duì)WD病模型TX小鼠采用青霉胺灌胃的方式，發(fā)現(xiàn)TX小鼠血清、腦游離銅在青霉胺治療后的第3天開始升高，到第14天降低至治療前水平，血清和腦中蛋白結(jié)合銅呈逐漸下降；氧化物前體丙二醛雖然在青霉胺治療后第3天開始升高，但與正常對(duì)照組并無(wú)區(qū)別，而還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比率在治療后的第3天開始下降，而正常對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)任何變化。該項(xiàng)研究表明腦中游離銅的升高可能來(lái)源于腦實(shí)質(zhì)而不是血清，且氧化力的升高很可能與新近神經(jīng)元損傷有直接關(guān)系。

現(xiàn)階段對(duì)WD驅(qū)銅治療過(guò)程中出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重的機(jī)制的假設(shè)主要包括驅(qū)銅治療引起的原先組織中沉積的銅重新分布，新近產(chǎn)生的神經(jīng)元損傷，繼而引起相應(yīng)的臨床癥狀等；周香雪等[23]認(rèn)為血清游離銅的升高可能并不直接與神經(jīng)癥狀加重相關(guān)，但快速控制血清游離銅的變化，是WD治療中阻止神經(jīng)癥狀惡化的關(guān)鍵。如果在驅(qū)銅治療期間有可以提供患者是否出現(xiàn)癥狀加重的血清學(xué)非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅指標(biāo)，這將有利于臨床醫(yī)師直觀的判斷患者是否會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重，而盡早的采取干預(yù)措施，使得患者可以獲得更好的臨床療效。因此，探索在應(yīng)用銅絡(luò)合劑治療的WD患者在最初的治療時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重與血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅含量的相關(guān)性，將對(duì)于臨床治療具有很好的指導(dǎo)意義。

5展望

目前，血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅在臨床中尚未能成為常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)，原因包括檢測(cè)儀器的精密性以及檢測(cè)費(fèi)用的昂貴等等而常規(guī)使用的原子火焰吸收法由于檢測(cè)靈敏度較差，無(wú)法精確的檢測(cè)出非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的含量。且血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅對(duì)WD患者驅(qū)銅治療的預(yù)后評(píng)價(jià)具有一定的指導(dǎo)意義，而與患者驅(qū)銅治療期間的臨床表現(xiàn)變化的相關(guān)性尚未明確。因此，血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅對(duì)WD治療的臨床意義尚需要臨床大樣本試驗(yàn)證明，同時(shí)尚需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅參與神經(jīng)元損傷相關(guān)作用途徑及作用機(jī)制。對(duì)此，有關(guān)血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅的研究仍將致力于對(duì)選擇更合適、合理、方便的檢測(cè)方法的探索以及作用途徑和作用機(jī)制驗(yàn)證；并通過(guò)明確其對(duì)臨床治療的指導(dǎo)價(jià)值，來(lái)豐富臨床醫(yī)師的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Loudianos G,Lepori MB,Mameli E,et al.Wilson’s disease[J].Prilozi,2014,35(1):93-98.

[2]Trocello JM,Broussolle E,Girardot-Tinant N,et al.Wilson’s disease,100 years later[J].Rev Neurol,2013,169(12):936-943.

[3]Tanzi RE,Petrukhin K,Chernov I.The Wilson disease geneis a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene[J].Nat Genet,1993,5(4):344-350.

[4]Bull PC,Thomas GR,Rommens JM,et al.The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene[J].Nat Genet,1993,5(4):327-337.

[5]Walshe JM.Penicillamine,a new oral therapy for Wilson’s disease[J].Am JMed,1956,21(4):487-495.

[6]Rosencrantz R,Schilsky M.Wilson disease: pathogenesis and clinical considerations in diagnosis and treatment[J].Semin liver Dis,2011,31(3):245-259.

[7]Walshe JM.Wilson's disease: the importance of measuring serum ceruloplasmin non-immunologically[J].Ann Clin Biochem,2003,40(2):115-121.

[8]Walshe JM.Serum 'free' copper in Wilson disease[J].QJM,2012,105(5):419-423.

[9]Bohrer D,Do Nascimento PC,Ramirez AG, et al.Comparison of ultrafiltration and solid phase extraction for the separation of free and protein-bound serum copper for the Wilson's disease diagnosis[J].Clin Chim Acta,2004,345(1-2):113-121.

[10] 張?jiān)?林哲絢,李慧,等.GFAAS測(cè)定乙醇-EDTA法分離血清中不同形態(tài)的銅和鋅[J].光譜學(xué)與光譜分析,2010,30(3):816-819.

[11] Dalvi A,Padmanaban M.Wilson's disease: etiology, diagnosis, and treatment[J].Dis Mon,2014,60(9):450-459.

[12] Purchase R.The link between copper and Wilson’s disea-se[J].Science Progress,2013,96(3):213-223.

[13] Palumaa P,Copper chaperones.The concept of conformational control in the metabolism of copper[J].FEBS Lett,2013,587(13):1902-1910.

[14] Lutsenko S.Human copper homeostasis: a network of interconnected pathways[J].Curr Opin Chem Biol,2010,14(2):211-217.

[15] 丁超,王訓(xùn),程楠.c-jun氨基末端激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在神經(jīng)元損傷中作用[J].安徽醫(yī)學(xué),2014,35(3):397-399.

[16] Chen X,Lan X,Mo S,et al.p38 and ERK, but not JNK, are involved in copper-induced apoptosis in cultured cerebellar granule neurons[J].Biochem Bioph Res Co,2009,379(4):944-948.

[17] Chen SH,Lin JK,Liu SH,et al.Apoptosis of cultured astrocytes induced by the copper and neocuproine complex through oxidative stress and JNK activation[J].Toxicol Sci,2008,102(1):138-149.

[18] Brewer GJ.A brand new mechanism for copper toxicity[J].J Hepatol,2007,47(4):621-622.

[19] Arboleda G,Morales LC,Benítez B,et al.Regulation of ceramide-induced neuronal death:cell metabolism meets neurodegeneration[J].Brain Res Rev,2009,59(2):333-346.

[20] Bruha R,Marecek Z,Pospisilova L,et al.Long-term follow-up of Wilson disease: natural history, treatment, mutations analysis and phenotypic correlation[J].Liver Lnt,2011,31(1):83-91.

[21] 周香雪,李洵樺,梁秀齡,等.青霉胺治療引起肝豆?fàn)詈俗冃陨窠?jīng)癥狀加重[J].中華神經(jīng)科雜志,2008,41(10):674-677.

[22] Chen DB,Feng L,Lin XP,et al.Penicillamine increases free copper and enhances oxidative stress in the brain of toxic milk mice[J].PloS One,2012,7(5): e37709.

[23] 周香雪,李洵樺,黃海成,等.血清銅及血清游離銅對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃曰颊呒皵y帶者的診斷及治療監(jiān)測(cè)意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2011,91(39):2757-2760.

(2015-05-07收稿2015-08-01 修回)

通信作者：韓詠竹，hyz89722@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：81473535)

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.11.033