段慶寧

【摘要】 目的：探索Th17細(xì)胞及IL-17、IL-21在牛奶蛋白過(guò)敏（CMA）嬰兒發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：采集病例組治療前后和健康對(duì)照組各25例患者的空腹外周靜脈血，用流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)定Th17細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的占比，用ELISA法檢測(cè)上清IL-17、IL-21水平，比較兩組的各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果：病例組治療前Th17細(xì)胞占比（8.97±2.81）%，治療后（3.72±2.52）%，對(duì)照組（1.92±1.38）%，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IL-17在對(duì)照組、病例組治療前、病例組治療后分別為（3.05±1.61）、（25.58±7.89）、（13.07±9.63）ng/mL，IL-21在對(duì)照組、病例組治療前、病例組治療后分別為（1.88±1.62）、（13.43±4.3）、（9.13±4.67）ng/mL，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：Th17細(xì)胞、IL-17和IL-21可能為CMA的研究及治療提供了靶向依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 牛奶蛋白過(guò)敏（CMA）； Th17細(xì)胞； IL-17； IL-21

【Abstract】 Objective：To explore the role of Th17 cells，IL-17 and IL-21 in the pathogenesis of cows milk allergy（CMA）.Method：The fasting peripheral venous blood in control group of 25 cases and before and after treatment in case group of 25 cases were collected，the percentage of Th17 cells in CD4+ T cells was measured by flow cytometry，the levels of IL-17 and IL-21 in supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），those indicators of two groups were compared.Result：The proportion of Th17 cells was （8.97±2.81）% before treatment，（3.72±2.52）% after treatment and （1.92±1.38）% in the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.In the control group，the case group before treatment and after treatment IL-17 were respectively （3.05±1.61），（25.58±7.89）and （13.07±9.63）ng/mL；IL-21 were respectively （1.88±1.62），（13.43±4.3） and （9.13±4.67）ng/mL， compared of those，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Th17 cells，IL-17 and IL-21 may provide potential targets for the study and therapy of CMA.

【Key words】 Cows milk allergy（CMA）； Th17 cells； IL-17； IL-21

First-authors address：Nantong University Affiliated Taizhou Peoples Hospital，Taizhou 225300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.28.012

牛奶蛋白過(guò)敏（Cows milk allerge，CMA）是嬰兒最常見(jiàn)的食物過(guò)敏，在歐洲發(fā)病率2%～3%[1]。國(guó)內(nèi)尚無(wú)CMA的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)，但有關(guān)我國(guó)兩歲以下兒童一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，食物過(guò)敏的發(fā)生率為5.5%～7.3%[2]。CMA可涉及各個(gè)系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)多樣，以胃腸道及皮膚癥狀為主，如胃食管反流、嘔吐、腹脹、腹瀉、便血、便秘、濕疹、蕁麻疹等，還可表現(xiàn)為缺鐵性貧血、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、喘息、慢性咳嗽等[3]。目前已發(fā)現(xiàn)多種免疫細(xì)胞及因子參與其中，但具體機(jī)制尚不明確。治療方法包括療效確切的飲食回避法和結(jié)論不一的口服益生菌法等[4]。Th17是近幾年發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群，由初始T細(xì)胞在TGF-β、IL-6、IL-1β和IL-23刺激后分化而來(lái)[5]，并通過(guò)其特征性細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22發(fā)揮生物學(xué)作用。已證實(shí)Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子廣泛參與到多種炎癥、風(fēng)濕性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病中[6-10]，但尚無(wú)與CMA有關(guān)的報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)CMA嬰兒及健康嬰兒外周血Th17比例，IL-17、IL-21水平的測(cè)定，探索其在CMA發(fā)病機(jī)制中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 參照文獻(xiàn)[11-12]選取2016年1-10月泰州市人醫(yī)院門(mén)診就診的疑診為CMA的嬰兒40例。所有患兒經(jīng)食物回避3周，剔除不遵醫(yī)囑者4例，結(jié)果臨床癥狀無(wú)明顯改善者4例，明顯改善者32例。選擇癥狀明顯改善者32例行開(kāi)放性口服食物激發(fā)試驗(yàn)（OFC），1周內(nèi)觀察反應(yīng)，最終確診CMA共計(jì)25例進(jìn)入病例組。選擇同期本院兒童保健科健康體檢嬰兒25例作為對(duì)照組。病例組25例患兒就診時(shí)主要癥狀以腹瀉、皮疹（反復(fù)、嚴(yán)重的濕疹）、便血為主，另外還有少數(shù)表現(xiàn)腹脹、易激惹、生長(zhǎng)發(fā)育落后、貧血等。對(duì)照組25例健康兒童中9例表現(xiàn)為輕度濕疹。兩組患兒年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在先天性免疫功能異常；（2）存在先天性腸道結(jié)構(gòu)異常；（3）入組前3個(gè)月及入組后存在嚴(yán)重感染，如敗血癥、膿毒血癥、重癥肺炎等；（4）入組前3個(gè)月及入組后使用靜脈人血丙種球蛋白、口服或靜脈糖皮質(zhì)激素；（5）其他可能影響機(jī)體免疫功能、腸道正常功能的情況。本研究取得了泰州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)。endprint

1.2 方法

1.2.1 病例組患兒干預(yù)方法 病例組CMA患兒飲食上采取營(yíng)養(yǎng)干預(yù)為主，（1）純母乳喂養(yǎng)者7例：繼續(xù)鼓勵(lì)母乳喂養(yǎng)，乳母回避牛奶及奶制品、堅(jiān)果、海鮮以及其他食用后引起患兒癥狀反復(fù)的食物。（2）混合喂養(yǎng)者16例：乳母回避可疑食物，同時(shí)根據(jù)患兒病情選用不同配方奶粉。深度水解配方奶粉15例，氨基酸配方奶粉1例。（3）配方奶喂養(yǎng)者2例，均改為深度水解配方奶粉喂養(yǎng)。另外，有胃腸道癥狀者加用培菲康散劑或者媽咪愛(ài)口服，有嚴(yán)重濕疹者局部使用氫化可的松霜?jiǎng)?∶1混合維生素E霜短期外用，并且堅(jiān)持補(bǔ)充維生素D3。由本科經(jīng)驗(yàn)豐富的2名護(hù)理人員跟蹤指導(dǎo)CMA患兒日常護(hù)理方法，密切隨訪，監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育情況，6個(gè)月后所有CMA患兒再次行激發(fā)試驗(yàn)，所有研究對(duì)象均無(wú)病例失訪。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17比例 兩組患兒均采集晨空腹頸靜脈血3 mL，置肝素抗凝管中，6個(gè)月后行激發(fā)試驗(yàn)前所有CMA患兒再次采集晨空腹頸靜脈血3 mL。向新鮮肝素化外周血中加入等體積淋巴細(xì)胞分離液，離心后獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）懸液，以12孔板培養(yǎng)，加入補(bǔ)充10%胎牛血清的RPMI-1640、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯、離子霉素，室溫孵育4 h，前1 h內(nèi)加入莫能菌素。再加入人CD4抗體，4 ℃避光孵育30 min。加入PE標(biāo)記的IL-17單抗，4 ℃避光孵育20 min。離心后以PBS液洗滌2遍，以流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）檢測(cè)Th17比例。除PE標(biāo)記的IL-17單抗購(gòu)自上海研盟生物科技有限公司，余試劑及抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血漿IL-17、IL-21水平 試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物股份有限公司，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或Fishers精確概率法，流式分析數(shù)據(jù)以Th17細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞中的百分比表示，率的比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒Th17比例、IL-17及IL-21水平比較 病例組治療前Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞比例（8.97±2.81）%，治療后占比（3.72±2.52）%，對(duì)照組占比（1.92±1.38）%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。兩組患兒IL-17及IL-21水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.2 病例組患兒營(yíng)養(yǎng)干預(yù)處理后耐受情況比較 根據(jù)療效判定標(biāo)準(zhǔn)分為耐受者（顯效和有效）22例，耐受失敗者（無(wú)效）3例[13]，干預(yù)有效率達(dá)88.0%。單獨(dú)分析耐受失敗的3例患兒發(fā)現(xiàn)其三組指標(biāo)治療前后比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

食物過(guò)敏是嬰兒常見(jiàn)的過(guò)敏性疾病，由多種因素、多個(gè)系統(tǒng)、多種機(jī)制共同參與，常分為IgE介導(dǎo)（速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)）、非IgE介導(dǎo)（遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)）、IgE和非IgE混合介導(dǎo)三種類(lèi)型。常見(jiàn)的過(guò)敏原包括牛奶、雞蛋白、見(jiàn)過(guò)、貝殼類(lèi)、海鮮等，牛奶蛋白過(guò)敏是常見(jiàn)的食物過(guò)敏，可能與腸道黏膜屏障破壞、腸道通透性增加、口服不耐受等有關(guān)[14]。以胃腸道為主要表現(xiàn)的牛奶過(guò)敏通常是非IgE介導(dǎo)和混合介導(dǎo)型。牛奶蛋白性直腸炎是最常見(jiàn)的CMA性消化道疾病，主要表現(xiàn)為腹瀉及血便，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是牛奶蛋白激發(fā)試驗(yàn)[15]。

CMA治療的關(guān)鍵是牛奶蛋白回避，并進(jìn)行飲食替代，目前治療CMA的配方奶主要有豆奶粉、部分及深度水解配方奶粉、游離氨基酸配方奶粉。使用替代治療干預(yù)后，患兒臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)可有明顯改善，孫燦等[16]發(fā)現(xiàn)干預(yù)治療后6個(gè)月患兒的總有效率可達(dá)到97.6%。本研究結(jié)果有效率88.0%，也說(shuō)明了飲食替代治療的有效性。豆奶粉生物利用度低，長(zhǎng)期使用可引起生長(zhǎng)發(fā)育不良，故不被大多營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸配方奶粉在治療效果方面優(yōu)于水解配方奶粉，建議有條件的家庭建議使用游離氨基酸配方奶粉[17-18]。但對(duì)CMA患兒來(lái)說(shuō)，由于治療過(guò)程中奶制品、母乳的剝離，會(huì)有較多心理及生理的遠(yuǎn)期影響。有研究發(fā)現(xiàn)，CMA兒童到了學(xué)齡期，會(huì)有嚴(yán)重而頻繁的精神障礙[19]，且CMA與哮喘、過(guò)敏性鼻炎等變應(yīng)性疾病關(guān)系密切。所以探索CMA發(fā)病機(jī)制，找出有效的治療方法顯得尤為重要。

謝廣清等[20]對(duì)IgE及非IgE介導(dǎo)的CMA患兒行胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)，他們的胃黏膜病理均呈慢性炎癥性改變，伴部分病例的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，提示炎癥反應(yīng)在CMA中的普遍存在。Th17活化是促進(jìn)炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，主要介導(dǎo)中性粒細(xì)胞性炎癥反應(yīng)[21]。本研究中，病例組Th17在CD4+T細(xì)胞中的占比明顯高于對(duì)照組，且治療前后Th17比例也有明顯改變，支持了上述觀點(diǎn)。

IL-17是Th17代表性細(xì)胞因子，在哮喘的研究中發(fā)現(xiàn)其通過(guò)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6等炎性介質(zhì)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞成熟和活化[22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IL-17單抗后可抑制肺部中性粒細(xì)胞的募集[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在病例組（包括治療前和治療后）均比對(duì)照組明顯增高，提示CMA患兒體內(nèi)可能存在炎癥反應(yīng)的失衡。

IL-21由活化的各亞型CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)多種免疫細(xì)胞有重要調(diào)節(jié)作用，Korn等[24]發(fā)現(xiàn)IL-21能協(xié)同TGF-β通過(guò)非IL-6依賴(lài)途徑使Th17細(xì)胞分化，而且能抑制Treg細(xì)胞的表達(dá)和活性[25]。Treg細(xì)胞能維持免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分的耐受，使機(jī)體保持免疫穩(wěn)態(tài)。楊希晨等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有助于減少牛奶蛋白過(guò)敏的發(fā)生，并幫助誘導(dǎo)免疫耐受。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-21在病例組水平比對(duì)照組明顯增高，提示其可能通過(guò)活化Th17和抑制Treg細(xì)胞造成CMA患兒炎癥狀態(tài)。此外，單獨(dú)分析耐受失敗的3例患兒發(fā)現(xiàn)，其治療前后IL-17、IL-21水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），推測(cè)還有其他因素參與到CMA發(fā)病機(jī)制中。endprint

綜上所述，Th17細(xì)胞比例及IL-17、IL21水平在CMA患兒及健康對(duì)照組中存在差異，可能為CMA研究及治療提供了靶向依據(jù)。但是本研究病例數(shù)少，且未對(duì)Th17細(xì)胞上游及下游具體機(jī)制進(jìn)行研究，存在局限性，有待進(jìn)一步的研究。

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