夏小婷,馬志杰,張成福,藍(lán)賢勇,陳 宏,雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧810016;3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,西藏 拉薩 850000)

西藏牛Y染色體USP9Y基因與mtDNA D-loop區(qū)遺傳多態(tài)性研究

夏小婷1,馬志杰2,張成福3,藍(lán)賢勇1,陳 宏1,雷初朝1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧810016;3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,西藏 拉薩 850000)

本研究旨在探究西藏牛的Y染色體與mtDNA D-loop區(qū)的遺傳多態(tài)性和起源.采用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切的方法測定30頭西藏牛Y染色體USP9Y基因的多態(tài)性;采用PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)測定30頭西藏牛的mtDNA D-loop區(qū)序列,利用生物信息學(xué)的方法對西藏牛44條D-loop序列(其中14條從GenBank下載)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析.對30頭西藏牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,共檢測到471 bp和552 bp 2個(gè)片段,且552 bp片段不能被限制性內(nèi)切酶Ssp I切開,說明西藏牛具有普通牛Y1和Y2 2種單倍型組,其頻率分別為0.067和0.933.通過對44條西藏牛mtDNA D-loop全序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)本研究測定的30條西藏牛mtDNA D-loop全序列中,有8條為牦牛序列,說明西藏牛群體中有牦牛的基因滲入.對36條西藏牛mtDNA D-loop全序列進(jìn)行分析,共檢測到62個(gè)變異位點(diǎn),界定了21個(gè)mtDNA單倍型,單倍型多樣度為0.956 0,核苷酸多樣度為0.006 4,表明西藏牛具有豐富的母系遺傳多態(tài)性.系統(tǒng)發(fā)育樹顯示, 西藏牛具有普通牛和瘤?；旌夏赶灯鹪?且普通牛的單倍型在西藏牛群體中占絕對優(yōu)勢(95.24%).西藏牛具有豐富的母系遺傳多態(tài)性,由2個(gè)普通牛父系單倍型組構(gòu)成,應(yīng)歸于普通牛一類,且群體中存在牦牛和瘤牛的基因滲入現(xiàn)象.

西藏牛;Y染色體;USP9Y;mtDNA D-loop;遺傳多態(tài)性;起源

黃牛是指除牦牛和水牛之外的家牛的總稱. 家牛屬包括歐洲普通牛(Bos taurus)和瘤牛(Bos indicus)2個(gè)牛種.西藏牛主要分布在西藏農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū),是世界上適應(yīng)高海拔地區(qū)的普通牛種之一,具有體型小、耐寒、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[1].目前,對西藏牛品種的起源和遺傳多態(tài)性研究,研究者已在蛋白多態(tài)性[2]、染色體[3]及體型外貌[4]等多個(gè)不同層面開展了大量研究工作.

Y染色體分子遺傳多態(tài)性和線粒體DNA(mtDNA)的研究結(jié)果,均支持中國地方黃牛屬于普通牛和瘤牛的混合起源,提出北方黃牛受普通牛影響大,南方黃牛受瘤牛的影響大,中原黃牛同時(shí)受到普通牛和瘤牛影響的觀點(diǎn)[5-11].基于Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)的研究,提出普通牛起源的家牛具有Y1和Y2單倍型組,瘤牛起源的家牛具有Y3單倍型組[6-7].Bonfiglio等[7]首次利用PCR技術(shù)對家牛Y染色體上USP9Y基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,僅通過瓊脂糖凝膠電泳和限制性內(nèi)切酶處理該基因的PCR產(chǎn)物,即可有效地區(qū)分家牛的3種Y染色體單倍型組.mtDNA因其遺傳過程遵循嚴(yán)格的母系遺傳方式,不受公畜雜交改良的影響,可真實(shí)地反映家畜的母系起源,近10年來一直是研究家畜起源進(jìn)化的重要分子標(biāo)記[8-11].

由于西藏牛是比較特殊的一支,分布在高海拔地區(qū),其父系和母系遺傳多態(tài)性的研究尚未見大量報(bào)道.本研究利用USP9Y標(biāo)記對西藏牛進(jìn)行Y染色體單倍型組分析,并測定其mtDNA D-loop全序列,分別探究西藏牛的父系和母系起源及分子遺傳多態(tài)性,為西藏牛的保種和改良提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA的提取 從西藏自治區(qū)昌都地區(qū)采集30頭西藏牛耳組織樣本,于-80℃保存.采用基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆?

1.2 USP9Y基因PCR擴(kuò)增與酶切分析 引用Bonfiglio等[7]發(fā)表的家牛Y染色體的USP9Y基因的1對引物,上游引物:5′-AAACCCTTCAAGGT AATAAAACAAAA-3′,下游引物:5′-CACAGCTC CTCAAAACCAGA-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.PCR反應(yīng)體系為12.5 μL,其中上、下游引物各0.25 μL(10 pmol/L),2XTaq MasterMix 6.25 μL, 模 板 DNA 1 μL,ddH2O 5.25 μL.擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,57℃退火45 s,72℃延伸30 s,36個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存.

用1%的瓊脂糖凝膠對西藏牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,根據(jù)擴(kuò)增條帶對單倍型做出初步分析.再用Ssp I限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切.Ssp I酶切體系為8 μL,其中Ssp I酶(10 units/μL)(TaKaRa)0.4 μL,10XSsp I Buffer 0.8 μL,PCR 產(chǎn)物 2.4 μL,ddH2O 4.4 μL.置于37℃條件下酶切2~3 h后,用1%瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,再根據(jù)條帶大小進(jìn)行單倍型分析和統(tǒng)計(jì).

1.3 mtDNA D-loop的擴(kuò)增、序列測定與數(shù)據(jù)處理 根據(jù)雷初朝等[12]發(fā)表的黃牛mtDNA D-loop全序列的引物序列合成正反向引物.正向引物:5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′,反向引物:5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′.PCR 反應(yīng)體系為20 μL.擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,59℃退火60 s,72℃延伸90 s,40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存.采用1.0% 瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物,將符合要求的PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測序.

在本研究中,44條西藏牛mtDNA D-loop序列被用于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析,其中30條序列是本研究所測序,其余14條是從GenBank下載的( 登 陸 號:AY378114 ~ AY378120、EU281505 ~EU281511).所測序列利用DNASTAR軟件進(jìn)行同源序列比對和編輯,以確保所測序列的準(zhǔn)確性.利用MEGA5.0和DnaSP5.0軟件統(tǒng)計(jì)單倍型及變異位點(diǎn),并構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-Joining Tree).

圖1 西藏牛USP9Y基因PCR產(chǎn)物酶切后電泳圖譜

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏牛USP9Y基因擴(kuò)增多態(tài)性與Y染色體單倍型組頻率 通過對西藏牛USP9Y基因部分片段擴(kuò)增結(jié)果顯示,在30個(gè)樣本中,有2頭牛的PCR產(chǎn)物為471 bp,其余28頭牛的PCR產(chǎn)物均為552 bp,且不能被Ssp I酶切開(圖1).根據(jù)Bonfiglio等[7]的判定標(biāo)準(zhǔn),Y1單倍型組的PCR產(chǎn)物(471 bp)可直接通過瓊脂糖凝膠電泳與Y2、Y3單倍型組(552 bp)區(qū)分開;而Y3單倍型組的PCR產(chǎn)物能被Ssp I酶切成2條帶(215、338 bp),Y2單倍型組不能被Ssp I酶切開,以此進(jìn)行Y2和Y3的鑒別.依據(jù)以上判定標(biāo)準(zhǔn),30頭西藏牛中,有2頭屬于普通牛Y1單倍型組,另外28頭均為普通牛Y2單倍型組.對30頭西藏牛個(gè)體進(jìn)行Y1和Y2單倍型組頻率統(tǒng)計(jì)表明,30頭西藏牛中,Y1單倍型組個(gè)體數(shù)為2頭,所占頻率為0.067;Y2單倍型組的個(gè)體數(shù)為28頭,所占頻率為0.933.

2.2 西藏牛mtDNA D-loop區(qū)核苷酸變異與單倍型多樣度 對測定的30條西藏牛mtDNA D-loop區(qū)序列以及從GenBank下載的14條西藏牛mtDNA D-loop區(qū)序列分析表明,本研究測得的30頭西藏牛中有8個(gè)個(gè)體顯示為牦牛序列,比對時(shí)將其排除在外.由于堿基插入與缺失的存在,其余36個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)全長為909~911 bp(圖2).共檢測到多態(tài)位點(diǎn)62個(gè),占全序列的6.81%(62/910),其中轉(zhuǎn)換59個(gè)(A/G轉(zhuǎn)換22個(gè),C/T轉(zhuǎn)換37個(gè)),顛換2個(gè)(C/G顛換),在16 057 bp處發(fā)現(xiàn)G/C/A轉(zhuǎn)換與顛換共存.

以Anderson等[13]測定的歐洲牛mtDNA D-loop全序列(GenBank登錄號:V00654)為標(biāo)準(zhǔn),利用DnaSP5.0軟件對西藏牛36個(gè)個(gè)體的mtDNA單倍型進(jìn)行多樣性分析(圖2),結(jié)果表明,西藏牛共有21種單倍型,單倍型多樣度(Hd)為0.956 0,平均核苷酸多樣度(Pi)為0.006 4,表明西藏牛的遺傳多態(tài)性非常豐富.對比檢測到的21種單倍型,只有1種屬于瘤牛單倍型,其包含個(gè)體數(shù)為1;其余20種都是普通牛單倍型,共包含35個(gè)個(gè)體,說明普通牛的mtDNA D-loop單倍型在西藏牛群體中占絕對優(yōu)勢(95.24%).

2.3 西藏牛mtDNA單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以Anderson等[13]測定的歐洲普通牛(GenBank登錄號:V00654)和Loftus等[8]測定的印度瘤牛(GenBank登錄號:L27733)為標(biāo)準(zhǔn)序列,用MEGA軟件采用Kimura(1980)雙參數(shù)模型計(jì)算西藏牛mtDNA單倍型間的遺傳距離,構(gòu)建各單倍型間的鄰接樹(NJ-Tree)(圖3).結(jié)果顯示,西藏牛明顯分為普通牛和瘤牛兩大支系,普通牛單倍型所占比例為20/21,只有1個(gè)單倍型屬于瘤牛單倍型(1/21),提示西藏牛為普通牛和瘤?；旌夏赶灯鹪?

3 討 論

圖2 西藏牛36個(gè)mtDNA D-loop單倍型及其多態(tài)位點(diǎn)

圖3 西藏牛21個(gè)mtDNA D-loop單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹

通過Y-SNPs和Y-STRs的研究,表明家牛有Y1、Y2、Y3 3種單倍型組[5~7,14].Bonfiglio等[7]發(fā)現(xiàn),利用Y染色體USP9Y基因內(nèi)含子26上的1個(gè)81 bp的插入和1個(gè)限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行瓊脂糖電泳能夠直接對這3種Y染色體單倍型組進(jìn)行分型,不需要測序,既分型方便又大大降低了研究成本.本研究利用這一方法對西藏牛30個(gè)個(gè)體進(jìn)行父系遺傳多態(tài)性檢測的結(jié)果表明,在30頭西藏牛中,2頭為普通牛Y1單倍型組,28頭為普通牛Y2單倍型組,Y1和Y2所占頻率分別為0.067和0.933,Y2單倍型組明顯占優(yōu)勢,說明西藏牛有2個(gè)父系起源,且都屬于普通牛血統(tǒng).在世界現(xiàn)存的普通牛中,中東和歐洲南部的普通牛大都屬于Y2單倍型組,而Y1單倍型組在歐亞大陸北部更為普遍[6].而中國黃牛主要包含Y2和Y3 2種Y染色體單倍型組[15],西藏牛Y1單倍型組的發(fā)現(xiàn)可能與近些年來藏區(qū)人民通過引進(jìn)大量國外品種與西藏本地牛進(jìn)行雜交有關(guān)[16].

對30條西藏牛mtDNA D-loop區(qū)全序列以及從GenBank下載的14條D-loop序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn),本研究所測得的30條序列中有8條屬于牦牛序列.將這8個(gè)mtDNA D-loop區(qū)顯示為牦牛序列個(gè)體的Y染色體單倍型組與之對應(yīng)后分析發(fā)現(xiàn),其全部屬于Y2單倍型組.由于西藏牛主要分布在西藏雅魯藏布江中下游、喜馬拉雅山東段和三江流域下游地區(qū),而西藏也是馴養(yǎng)牦牛最早的地區(qū),根據(jù)檢測出的8個(gè)牦牛序列推測西藏牛與當(dāng)?shù)氐年笈４嬖谳^多的基因交流.本研究對其余36條西藏牛D-loop區(qū)909~911 bp序列進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)62個(gè)核苷酸變異位點(diǎn),其中轉(zhuǎn)換59個(gè),顛換2個(gè),轉(zhuǎn)換與顛換共存位點(diǎn)1個(gè).雷初朝等[12]報(bào)道的中國8個(gè)黃牛品種mtDNA D-loop區(qū)序列的核苷酸多樣度(Pi)為0.005 5~0.053 9.本研究檢測到西藏牛Pi為0.006 4,說明西藏牛mtDNA D-loop區(qū)核苷酸多態(tài)性比較豐富.西藏牛單倍型多樣度為0.956 0,與蔡欣等[17]研究的中國17個(gè)黃牛品種的單倍型多樣度(0.919)相比要高,表明西藏牛線粒體DNA遺傳多態(tài)性豐富.在西藏牛36個(gè)個(gè)體中共檢測到21種單倍型,只有1條序列(GenBank登錄號:AY378119)屬于瘤牛單倍型,其余35個(gè)個(gè)體共享20個(gè)普通牛單倍型,且本研究所測得的西藏牛都屬于普通牛單倍型,提示西藏牛為普通牛和瘤牛的混合母系起源,但以普通牛為主.Lei等[11]基于mtDNA D-loop區(qū)序列變異的研究,也證實(shí)了西藏牛有普通牛和瘤牛2種母系起源,但瘤牛所占數(shù)量同樣較少(12.5%、1/8).陳幼春等[4]認(rèn)為,西藏牛是無肩峰的小個(gè)子牛,在瘤牛進(jìn)入印度前就已存在,是原牛保留在南亞邊緣未遷移去西方的古老牛種的后裔.陳智華等[2~3]通過對西藏牛血液蛋白多態(tài)性研究表明,西藏牛與蒙古牛、安西牛為一類,屬于普通牛種,但與中國北方黃牛品種并不同源;西藏牛Y染色體為中部著絲粒染色體,與普通牛的Y染色體一致,判斷其屬于普通牛型.而西藏地區(qū)的黃牛品種主要包括西藏牛、阿沛甲咂牛、日喀則駝峰牛和樟木牛,除西藏牛外,其他3個(gè)黃牛品種都含有瘤牛血統(tǒng)[1].所以本研究認(rèn)為,西藏牛mtDNA檢測到少量瘤牛血統(tǒng),可能與當(dāng)?shù)睾辛雠Ｑy(tǒng)的黃牛存在基因交流所致.

西藏以其特殊的地理位置、高海拔的生態(tài)條件孕育了極其豐富的牛種資源,包括黃牛和牦牛2個(gè)家養(yǎng)牛種.本文首次從父系和母系2個(gè)角度探討了西藏牛的起源和遺傳多態(tài)性,基于Y-SNPs和mtDNA D-loop研究,認(rèn)為西藏牛具有豐富的遺傳多態(tài)性,應(yīng)歸于普通牛一類,且群體中存在牦牛和瘤牛的基因滲入現(xiàn)象.西藏牛雖在適應(yīng)嚴(yán)酷的自然條件、耐粗飼和抗病力強(qiáng)等方面有較多優(yōu)點(diǎn),但屬原始低產(chǎn)品種,產(chǎn)乳和產(chǎn)肉等方面都不能滿足人們的生活需要.西藏牛產(chǎn)區(qū)的牧民比較注重對母牛的選擇,而不重視公牛的選育,且公母混群放牧,近親繁殖現(xiàn)象較嚴(yán)重[1].近年來人們?yōu)榱烁牧嘉鞑嘏Ｆ贩N,通過引進(jìn)大量國外品種與西藏本地牛進(jìn)行雜交[16],加上人們對種質(zhì)資源保護(hù)的意識(shí)淡薄,使得西藏牛的群體遺傳組成發(fā)生變化,因此加大西藏牛的保種力度迫在眉睫.

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Genetic Diversity of Y Chromosome USP9Y Gene and Mitochondrial DNA D-loop Region in Tibetan Cattle

XIA Xiao‐ting1, MA Zhi‐jie2, ZHANG Cheng‐fu3, LAN Xian‐yong1, CHEN Hong1, LEI Chu‐zhao1*
(1. College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Shaanxi Yangling 712100, China; 2.Academy of Animal Science and Veterinary Medicine, Qinghai University, Qinghai Xining 810016, China; 3. Institute of Animal Science, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Tibet Lhasa 850009, China)

This study is to investigate the genetic diversity and the origins of Y chromosome and mitochondrial DNA D‐loop region in Tibetan cattle. Using PCR amplification and restriction enzyme digestion methods to detect the polymorphism of Y chromosome USP9Y gene of 30 Tibetan cattle; the complete D‐loop region sequences of mitochondrial DNA from 30 individuals in Tibetan cattle were determined by PCR amplification and sequencing methods. Bioinformatics method was used to analyze the genetic polymorphism of 44 D‐loop sequences in Tibetan cattle (of which 14 sequences of Tibetan were obtained from GenBank). 30 individuals of Tibetan cattle were analyzed using a recently discovered USP9Y marker that could distinguish taurine from zebu more efficiently. The results showed that the USP9Y sequence‐tagged sites of Tibetan cattle were detected two DNA fragments, 471 bp and 552bp, and the 552 bp DNA fragment can't be digested by SspI enzyme,indicating that Tibetan cattle only had Y1 and Y2 haplogroups. The haplogroup frequencies of Y1 and Y2 were 0.067 and 0.933, respectively. To compare with 44 individuals of the complete mitochondrial DNA D‐loop region in Tibetan cattle, 8 individuals were proved to belong to yak which detected in this study, indicating the introgression of genes from the yak. 62 mutation sites and 21 haplotypes were found in 36 individuals of complete mitochondrial DNA D‐loop sequences of Tibetan cattle. Nucleotide diversity was 0.0064 and haplotype diversity was 0.9560, suggesting an abundant mitochondrial genetic diversity in Tibetan cattle. Phylogenetic analysis showed that the maternal origins of Tibetan cattle were from Bos taurus and Bos indicus, and the taurine haplotypes dominated the Tibetan cattle population (95.24%). Our results demonstrated that Tibetan cattle have rather abundant mitochondrial genetic diversity, consisting of two taurine paternal haplogroups. The Tibetan cattle should be classified as Bos taurus, and our study also revealed a female yak and zebu introgression in Tibetan cattle.

Tibetan cattle; Y chromosome; USP9Y; Mitochondrial DNA D‐loop; Genetic diversity; Origins

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-030

2017-04-10;

2017-05-18

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助(CARS-37)

夏小婷(1991-),女,山東威海人,碩士生,主要從事動(dòng)物遺傳資源研究,E-mail:xiaxiaoting1991@163.com

*通訊作者:雷初朝(1968-),男,湖南常寧人,教授,博導(dǎo),主要從事牛遺傳資源研究, E-mail:leichuzhao1118@126.com