謝元貴+劉濟明+廖小鋒+李鵬

摘要：以金銀花幼苗為試驗材料，研究不同濃度（0、5、20、30、40、50 mmol/L）的外源鈣（Ca2+）對金銀花生理生化特性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過60 d鈣脅迫，0、30、40、50 mmol/L Ca2+下金銀花的可溶性蛋白、游離脯氨酸含量相對CK（5 mmol/L Ca2+）顯著增加；可溶性淀粉、可溶性糖含量變化不明顯，可溶性淀粉含量僅缺鈣情況下顯著增加，可溶性糖含量只有（相對CK）0 mmol/L Ca2+顯著增加，50 mmol/L Ca2+顯著減少。隨著鈣離子濃度的增大，MDA含量、POD和SOD活性表現(xiàn)為先減少后增加的趨勢，根系活力變化則相反，CAT活性顯示逐漸增加趨勢。0、40、50 mmol/L Ca2+處理POD、SOD活性顯著增加，40、50 mmol/L Ca2+濃度與CK相比CAT活性顯著增加。在20 mmol/L Ca2+濃度下，金銀花MDA含量最小、根系活力最高，且能在30 mmol/L Ca2+濃度下良好生長。研究認為，金銀花可通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白、游離脯氨酸）的含量及抗氧化酶間協(xié)同作用，實現(xiàn)對高鈣脅迫較強的忍耐性和較好的適應(yīng)性。

關(guān)鍵詞：金銀花；鈣脅迫；根系活力；MDA；保護酶活性

中圖分類號： S567.7+90.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0144-03

作者簡介：謝元貴（1982—），男，碩士，副研究員、高級工程師，主要從事生態(tài)學(xué)、土地規(guī)劃與水土保持方面的研究。E-mail：yuangui_xie@163.com。

通信作者：劉濟明，博士，教授，主要從事植物生態(tài)學(xué)研究。E-mail：karst0623@163.com。貴州省是我國西南喀斯特地區(qū)中心區(qū)域，可溶性碳酸鹽巖出露面積達13萬km2，占全省土地總面積的73%，其生境極易退化，是我國六大脆弱生態(tài)系統(tǒng)之一[1-2]。喀斯特地區(qū)脆弱的獨特生境表現(xiàn)為N、P、K極度缺乏，是高Ca/Mg的土壤環(huán)境，其鈣元素的含量可達1%～3%[3]，是同緯度硅酸鹽地區(qū)土壤CaO含量的2～3倍，石灰土中CaO主要以交換態(tài)存在，鹽基離子中鈣離子占90%以上[4]。Ca是植物生長必需的大量營養(yǎng)元素，具有獨特的結(jié)構(gòu)和生理功能，在植物生長中有著重要的功能。研究表明，Ca可以通過提高細胞質(zhì)和細胞核中Ca2+濃度、促進磷酸鈣沉淀、提高離子吸收、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式直接參與植物抗寒[5]、熱害[6]、干旱[7]、抗病[8]、重金屬毒害[9]和鹽脅迫[10-11]等逆境。

金銀花（Lonicera japonica Thunb）別名忍冬，為忍冬屬（Lonacera）半常綠多年生藤本灌木。金銀花富含綠原酸、異綠原酸、木犀草苷等，具有良好的醫(yī)用和經(jīng)濟價值，被作為國家重點治理名貴中藥材之一[12]。其根系發(fā)達，適應(yīng)性強，具有抗旱、耐澇、耐寒、耐瘠薄等特點，在貴州喀斯特地區(qū)具有較好的栽培前景。目前針對金銀花逆境適應(yīng)性的研究主要集中在干旱、重金屬、鹽（NaCl）脅迫等方面[13-16]，而關(guān)于Ca2+脅迫的研究卻鮮有報道。考慮到貴州喀斯特地區(qū)高鈣的土壤環(huán)境，為了探究金銀花對喀斯特地區(qū)高鈣環(huán)境的適應(yīng)方式，本試驗選取金銀花高產(chǎn)品種“金翠蕾”，經(jīng)不同鈣濃度脅迫處理，研究金銀花對高鈣環(huán)境的生理生化適應(yīng)機制，為金銀花在貴州的推廣種植、喀斯特石漠化地區(qū)植被恢復(fù)和生態(tài)重建提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

2013年9月中旬從湖南隆回萬旺緣金銀花購銷有限公司選購“金翠蕾”灰氈毛忍冬銀花品種的幼苗，移栽于貴州大學(xué)林學(xué)院苗圃，統(tǒng)一水肥管理，作為試驗材料（煉苗約15 d）。待金銀花苗恢復(fù)長勢后，選擇長勢較為一致的金銀花分別用蒸餾水和無菌水沖洗根系3次，植入另一石英砂基質(zhì)中（底部內(nèi)徑24 cm，盆口內(nèi)徑29 cm，盆高22 cm），置于大棚內(nèi)培養(yǎng)。石英砂經(jīng)過10%的鹽酸浸泡24 h，并依次用蒸餾水和去離子水反復(fù)浸泡沖洗至pH值恒定。

1.2試驗設(shè)計

鈣脅迫試驗時段設(shè)置為10月初至12月初，設(shè)置0、5、20、30、40、50 mmol/L等6個鈣離子濃度梯度，5 mmol/L Ca2+濃度的營養(yǎng)液作為對照（CK）。每處理3次重復(fù)，每個重復(fù)3盆。采用Hoagland+Arnon微量元素營養(yǎng)液，僅將鈣濃度設(shè)為系列梯度，CaCl2作為鈣源，NaNO3作氮源。每盆每次澆灌150 mL營養(yǎng)液，每2 d澆灌1次，每澆灌2次營養(yǎng)液之后，用去離子水淋洗石英砂1次，以避免鹽分過多累積。試驗過程中每10 d就要調(diào)換1次花盆位置，保證金銀花在大棚內(nèi)光照相對一致，脅迫處理時間為60 d。

1.3指標及測試方法

金銀花葉片可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍 G-250 染色法；可溶性糖與可溶性淀粉含量采用蒽酮比色法測定；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定；根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定[17]。

采用TBA顯色法測定葉片丙二醛（MDA）含量；超氧化物歧化酶（SOD）活性利用NBT光還原法測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用H2O2還原法測定[17]；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定[18]。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理，運用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對金銀花滲透營養(yǎng)物質(zhì)的影響

由表1可見，在0 mmol/L鈣處理時，除游離脯氨酸外，金銀花葉片其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均表現(xiàn)為較高的濃度。隨著Ca2+的增加，可溶性蛋白、可溶性淀粉和游離脯氨酸含量趨于先下降后升高再下降的趨勢，當外源鈣的濃度為20 mmol/L時，可溶性蛋白、可溶性淀粉、可溶性糖的含量均最低，分別為 3.65、3.54、3.17 mg/g。CK的可溶性蛋白含量除極顯著高于20 mmol/L鈣處理，與30、40 mmol/L處理間差異不顯著，20 mmol/L 鈣處理顯著低于其他各處理。無鈣處理（0 mmol/L）可溶性淀粉含量略有增加，有鈣處理間差異不顯著。endprint

隨著鈣離子濃度的增加，可溶性糖含量表現(xiàn)為逐漸下降的趨勢，0、20、30、40 mmol/L試驗組可溶性糖含量與CK差異不顯著，50 mmol/L鈣處理其含量為1.83 mg/g，顯著性低于CK（3.72 mg/g）。20 mmol/L鈣處理游離脯氨酸含量與CK差異不顯著，其他處理組極顯著高于CK，表現(xiàn)為鈣處理下隨著Ca2+濃度的增加游離脯氨酸含量逐漸累積的趨勢。

2.2外源鈣對金銀花根系活力與丙二醛（MDA）含量的影響

由圖1可看出，隨著外源鈣濃度的增加，金銀花根系活力顯現(xiàn)倒“V”型變化趨勢，20 mmol/L處理根活力極顯著地高于CK，其他處理則極顯著低于CK。除0與30 mmol/L鈣處理組間根系活力差異不顯著，其他處理間存在顯著差異。

隨著外源鈣濃度的增加，葉片MDA的含量呈現(xiàn)與根系活力變化相反的趨勢（圖2）。0 mmol/L Ca2+處理下顯著高于CK的MDA含量，而50 mmol/L Ca2+極顯著高于對照，20、30mmol/L Ca2+條件下極顯著低于CK。有鈣處理組中，50 mmol/L 鈣處理MDA的含量最高，顯著高于含有Ca2+的其他4個處理。

2.3干旱脅迫對金銀花抗氧化系統(tǒng)的影響

無鈣處理金銀花葉片SOD酶活性相對較高，低鈣處理下SOD酶活性大幅降低，隨著鈣離子濃度的增加葉片內(nèi)SOD活性又表現(xiàn)出逐步升高的變化趨勢（圖3）。0、30、40、50 mmol/L 鈣處理下SOD活性顯著大于CK，20 mmol/L鈣處理與CK差異不顯著。

CAT活性升高能及時清理Ca2+脅迫下植物細胞內(nèi)H2O2的累積，防止質(zhì)膜被破壞。圖4顯示，隨著Ca2+濃度的增加，低濃度（5～20 mmol/L）Ca2+處理金銀花葉片CAT活性變化不大，30～50 mmol/L Ca2+處理則顯著上升，50 mmol/L Ca2+處理活性最高，顯著高于其他各處理。

圖5顯示，鈣脅迫下金銀花葉片內(nèi)POD活性和SOD活性有類似的變化趨勢，0、30、40、50 mmol/L鈣處理下均極顯著大于CK，但20 mmol/L鈣處理與CK差異不顯著。

3討論

作為細胞質(zhì)膜的氧化產(chǎn)物MDA含量可以從側(cè)面反應(yīng)植物原生質(zhì)膜的受害程度[17]。經(jīng)過60 d的盆栽鈣脅迫處理，0、40、50 mmol/L 處理金銀花的MDA含量高于CK，20 mmol/L Ca2+條件下，MDA含量最低。說明0、40、50 mmol/L Ca2+脅迫下金銀花葉片細胞膜透性發(fā)生了一定程度的改變， 影響了植物的正常生長， 20 mmol/L Ca2+條件下，

較有利于金銀花的生長。

金銀花通過提高細胞滲透調(diào)節(jié)的主要物質(zhì)來增加細胞質(zhì)濃度，維持正常的生理代謝。本試驗中金銀花可溶性蛋白含量的升高，可能由于外源Ca2+進入細胞內(nèi)提高了鈣調(diào)蛋白的水平，同時鈣調(diào)蛋白又可以和其他蛋白（HSPs）結(jié)合，從而提高可溶性蛋白的含量[19-20]。從本試驗看，游離脯氨含量的累積，能有效地提高細胞內(nèi)滲透壓，這與肖雯等的研究結(jié)果[21]相似。

植物在逆境條件下往往通過保護酶類之間的協(xié)同作用，以維持高的保護酶活性或抗氧化劑含量來清除積累的 O-2·[22] 。缺鈣條件下SOD、POD的活性較CK顯著增加，與董彩霞等對外源鈣對不同鈣敏感型番茄幼苗的保護酶活性的研究結(jié)果[23]一致；40、50 mmol/L Ca2+處理條件下，3種酶活性表現(xiàn)為不同程度的增加，從而加速對逆境條件下累積的 O-2· 清除，減緩高Ca2+處對植物的損害。鈣處理下金銀花SOD活性、CAT活性、POD活性不同程度提高，調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來實現(xiàn)高Ca2+條件下產(chǎn)生的大量 O-2· 的清除，降低其對細胞原生質(zhì)膜的損害。

一定濃度的外源鈣能有效地增加植物的抗逆性[24-26]，本研究中金銀花主要是通過提高細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白和游離脯氨酸）的含量、不同程度提高抗氧化酶活性并利用保護酶間的協(xié)同作用，實現(xiàn)對高Ca2+環(huán)境較強的忍耐性和較好的適應(yīng)性。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.040endprint