陳俊暉+漆子鈺+駱亮+劉梓富+吳沙沙+翟俊文+彭東輝

摘要：金邊朱砂根是個(gè)葉果俱佳的品系，由于其掛果量極少，有性繁殖的后代容易出現(xiàn)性狀分離，不利于優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，采用種子繁殖出的種苗遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求，因此亟須采用組培快繁體系進(jìn)行種苗的擴(kuò)繁。以金邊朱砂根的莖段為外植體，采用單因素和正交試驗(yàn)法研究不同滅菌方式、基本培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)金邊朱砂根莖段滅菌、初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：最佳的滅菌方式為0.1% HgCl2消毒8 min；初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，啟動(dòng)率為73.33%；繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+ 0.1 mg/L噻重氮苯基脲（TDZ），增殖系數(shù)為4.27；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，生根率為71.11%。

關(guān)鍵詞：金邊；朱砂根；組織培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)： S359文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0050-04

紫金牛屬（Ardisia）常綠小灌木，性喜陰涼，初夏開(kāi)花，花白色略帶粉色，7月底結(jié)成青色果實(shí)，果實(shí)于10～12月成熟轉(zhuǎn)紅[1]。果實(shí)多，顏色紅艷，掛果期長(zhǎng)，而且果期在春節(jié)期間，常作為年宵花卉的首選[2]。金邊朱砂根是由朱砂根變異種篩選出來(lái)的彩葉類(lèi)型，是個(gè)葉果俱觀的品系。但是，目前具有該變異的植株較少并且掛果量極少，無(wú)法滿(mǎn)足生產(chǎn)上對(duì)種苗的需求。植株通過(guò)有性繁殖的后代容易出現(xiàn)性狀分離，不利于優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，而且繁殖周期較長(zhǎng)。為了在短時(shí)期內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)健壯的種苗。本研究通過(guò)對(duì)金邊朱砂根快繁體系的各個(gè)階段進(jìn)行研究，力求建立一套可生產(chǎn)應(yīng)用、高效的金邊朱砂根組培快繁體系，從而為金邊朱砂根種質(zhì)資源保存提供參考，并為金邊朱砂根種苗快繁提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

晴朗午后從金邊朱砂根盆栽母株（圖1）上選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的當(dāng)年生帶腋芽莖段作為外植體。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體滅菌方案的篩選采集試驗(yàn)材料后用適當(dāng)濃度洗滌劑將莖段清洗干凈，用自來(lái)水沖洗30 min后置于超凈工作臺(tái)上，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用無(wú)菌水沖洗2遍，再用 0.1% HgCl2（添加吐溫20）、2% NaClO進(jìn)行不同時(shí)間消毒處理（表1）。滅菌劑消毒完后用無(wú)菌水沖洗3～5遍，在無(wú)

1.2.3繼代培養(yǎng)基的篩選以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3）， 將初代培養(yǎng)30 d的朱

水平因素A：基本培養(yǎng)基B：6-BA含量（mg/L）C：NAA含量（mg/L）1MS0.50.121/2 MS1.00.23WPM2.00.3

砂根組培苗切為約1.5 cm長(zhǎng)的莖段，分別接種于繼代培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

1.2.4生根培養(yǎng)基的篩選以大量元素按比例配制的MS培養(yǎng)基+IBA、NAA溶液作為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)（表4），從繼代增殖培養(yǎng)40 d的朱砂根組培苗上切取帶單個(gè)芽的外植體，接種于生根培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

表4生根培養(yǎng)基配方L9（34）正交設(shè)計(jì)

水平因素A：基本培養(yǎng)基B：IBA含量（mg/L）C：NAA含量（mg/L）11/2 MS0.50.023/4 MS1.01.03MS2.02.0

1.2.5數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003、SPSS 19.0分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)計(jì)算公式：污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；死亡率=死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；啟動(dòng)率=啟動(dòng)生長(zhǎng)的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；增殖系數(shù)=增殖后芽數(shù)/接種外植體數(shù)；生根率=生根株數(shù)/接種株數(shù)×100%；平均生根數(shù)=生根根數(shù)/接種不定芽數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1外植體滅菌結(jié)果

從表5可以看出，用0.1% HgCl2作滅菌劑時(shí)隨著消毒時(shí)間的增加，外植體的污染率下降，而死亡率先下降后上升；在消毒8 min時(shí)的死亡率極顯著低于其他消毒時(shí)間，僅為 11.67%；當(dāng)用2% NaClO消毒10 min時(shí)，外植體死亡率最高，達(dá)到93.33%；而用0.1% HgCl2消毒12 min時(shí)，外植體死亡率也達(dá)到較高水平，為80.00%。從污染率、死亡率的控制考慮，用0.1% HgCl2消毒8 min是最佳的滅菌方式。

2.2初代培養(yǎng)

將滅菌過(guò)的莖段切取帶腋芽部分1.5 cm接到不同的基本培養(yǎng)基+不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA進(jìn)行金邊朱砂根莖段的芽誘導(dǎo)啟動(dòng)培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d后，第1、2、5組培養(yǎng)基中外植體的頂端和葉腋處開(kāi)始萌動(dòng)生長(zhǎng)，長(zhǎng)出2～3個(gè)不定芽。

從表6可以看出，在初代啟動(dòng)培養(yǎng)過(guò)程中，不同基本培養(yǎng)基和激素組合對(duì)金邊朱砂根莖段啟動(dòng)培養(yǎng)的影響效果差別很大。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合下，啟動(dòng)率最高，達(dá)到73.33%。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的極差R值決定各因素對(duì)金邊朱砂根莖段啟動(dòng)生長(zhǎng)的影響程度依次為A>B>C，即基本培養(yǎng)基>6-BA>NAA，最佳的組合為A1B2C3。

由方差分析得出，基本培養(yǎng)基的P值=0.018<0.05，6-BA的P值=0.033 5<0.05，NAA的P值=0.656>0.05，基本培養(yǎng)基和6-BA對(duì)金邊朱砂根莖段啟動(dòng)率的影響顯著，NAA對(duì)其影響不顯著。進(jìn)一步用LSD法多重比較3種因素對(duì)金邊朱砂根繼代增殖的影響。不同基本培養(yǎng)基的多重比較表明，MS與1/2 MS差異顯著，MS與WPM差異極顯著，1/2MS 與WPM差異不顯著。所以基本培養(yǎng)基為MS、1/2MS時(shí)均有利于金邊朱砂根莖段啟動(dòng)，WPM效果較差。6-BA不同濃度水平的多重比較表明，0.5 mg/L處理與1.0 mg/L處理差異顯著，1.0 mg/L處理與2.0 mg/L處理差異顯著，0.5 mg/L 處理與2.0 mg/L處理差異不顯著。6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)啟動(dòng)生長(zhǎng)效果最好，明顯高于濃度為0.5、2.0 mg/L 時(shí)的啟動(dòng)率，說(shuō)明適宜濃度的6-BA對(duì)金邊朱砂根莖段啟動(dòng)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但是過(guò)高則會(huì)抑制。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合處理下的朱砂根莖段培養(yǎng)15 d即啟動(dòng)生長(zhǎng)，頂端、葉腋處開(kāi)始長(zhǎng)芽，且長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其他處理。

2.3繼代培養(yǎng)

將莖段初代啟動(dòng)培養(yǎng)長(zhǎng)出的不定芽切成單個(gè)芽轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖，基本培養(yǎng)基選取前面試驗(yàn)中效果最好的MS，添加不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA和TDZ組合，對(duì)繼代增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.4生根培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

將繼代增殖中的不定芽切去2 cm作生根材料，在按不同大量元素比例配制的改良MS培養(yǎng)基上添加不同質(zhì)量濃度的NAA、IBA進(jìn)行生根培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計(jì)生根率和平均生根數(shù)。從表8可以看出，在生根培養(yǎng)過(guò)程中，不同基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素組合對(duì)生根的影響差異較大。在1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA組合下，生根率最高，為71.11%，平均生根數(shù)最多，達(dá)到4.18條。

由方差分析得出，基本培養(yǎng)基的P值=0.008<0.01，IBA的P值=0.024<0.05，NAA的P值=0.250>0.05，基本培養(yǎng)基和IBA對(duì)金邊朱砂根莖段生根率的影響顯著或極顯著，NAA對(duì)其影響不顯著。進(jìn)一步用LSD法多重比較3種因素對(duì)金邊朱砂根繼代增殖的影響。不同基本培養(yǎng)基的多重比較表明，1/2 MS處理與3/4 MS處理差異顯著，1/2 MS處理與MS處理差異極顯著，3/4 MS處理與MS處理差異顯著?；九囵B(yǎng)基為1/2 MS、3/4 MS時(shí)生根率明顯高于MS，可以看出減少培養(yǎng)基的含鹽量有利于提高金邊朱砂根莖段的生根率。IBA不同濃度水平的多重比較表明，0.5 mg/L處理與10 mg/L處理差異顯著，1.0 mg/L處理與2.0 mg/L處理差異顯著，0.5 mg/L 處理與2.0 mg/L處理差異不顯著（表8）。IBA濃度為0.5、1.0 mg/L時(shí)均有利于提高金邊朱砂根莖段生根率，2.0 mg/L處理效果較差。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的極差R值決定各因素對(duì)金邊朱砂根生根率的影響程度依次為A>B>C，即基本培養(yǎng)基>IBA>NAA，最佳的組合為A1B2C2。朱砂根金邊組織培養(yǎng)發(fā)育過(guò)程見(jiàn)圖2。

3討論與結(jié)論

3.1討論

不同植物所需的滅菌劑和處理時(shí)間存在差異，滅菌方式的選擇與植物的表皮結(jié)構(gòu)和選取部位的木質(zhì)化程度有關(guān)。植物的表皮帶絨毛或者木質(zhì)化程度越高，所需的滅菌劑滅菌時(shí)間就越久。但如果處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，滅菌劑會(huì)很難去除，殘留的滅菌劑會(huì)毒害植物，不利于其生長(zhǎng)。所以，選擇合適的滅菌劑和處理時(shí)間是外植體組培快繁體系建立的第1步[3]。

表明，選用0.1% HgCl2作為滅菌劑比具有強(qiáng)氧化性的2% NaClO消毒后培養(yǎng)的外植體死亡率更低，對(duì)外植體的傷害更小。消毒時(shí)間為8 min時(shí)外植體的污染率和死亡率均較低，所以選用0.1% HgCl2消毒8 min的滅菌方式。

馬明東等在研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)朱砂根外植體初代培養(yǎng)的影響試驗(yàn)中，分析得出植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA兩者濃度比值在10以?xún)?nèi)時(shí)萌芽率較高，可達(dá)80.00%以上[4]。其中培養(yǎng)基配方MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA對(duì)芽的誘導(dǎo)率顯著高于其他處理，是腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，與孔祥海等的研究結(jié)果[5]一致。但在本研究中，最佳的芽誘導(dǎo)初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA，啟動(dòng)率達(dá)73.33%。很多研究表明，即使是同種植物的不同品種在組織培養(yǎng)過(guò)程中仍存在較大差異，這種差異主要體現(xiàn)在不同品種啟動(dòng)培養(yǎng)的難易程度[6]、培養(yǎng)過(guò)程中所需要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和基本培養(yǎng)基類(lèi)型[7]，而且這種差異體現(xiàn)在啟動(dòng)、增殖、生根培養(yǎng)的各個(gè)階段。金邊朱砂根對(duì)于6-BA、NAA的質(zhì)量濃度的要求明顯高于朱砂根原種，這也證明了上述差異。很多木本植物使用WPM基本培養(yǎng)基的效果好于MS，而對(duì)于金邊朱砂根MS基本培養(yǎng)基啟動(dòng)生長(zhǎng)的效果明顯優(yōu)于WPM。本研究中，最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ，增殖系數(shù)為4.27。TDZ是一種具有細(xì)胞分裂素活性的取代脲類(lèi)化合物，具有促進(jìn)植物芽的誘導(dǎo)與增殖功能。在本研究中，加入低濃度的TDZ對(duì)于金邊朱砂根的繼代增殖有顯著的促進(jìn)作用，是金邊朱砂根繼代增殖的主導(dǎo)因素，與孫曉敏等在光皮樺組織培養(yǎng)離體再生方面的研究結(jié)果[8]一致。1/2 MS培養(yǎng)基的大量元素含量為MS的1/2，本研究中生根培養(yǎng)階段結(jié)果表明，1/2 MS更有利于金邊朱砂根的生根，而高鹽的MS最不利于其生根，此結(jié)論與眾多試驗(yàn)中植物生根培養(yǎng)時(shí)低鹽的培養(yǎng)基生根效果更好的結(jié)論一致。植物生長(zhǎng)素的組合對(duì)生根有促進(jìn)作用[9]，在IBA 濃度相同時(shí)，增加NAA的濃度到1.0 mg/L對(duì)金邊朱砂根的生根率也有促進(jìn)作用。金邊朱砂根最佳的生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，此組合下生根率達(dá)到71.11%，平均生根數(shù)為 4.18 條，整體生根效果最好。

3.2結(jié)論

最佳金邊朱砂根的滅菌方式為0.1% HgCl2消毒8 min；最佳的初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，啟動(dòng)率為73.33%，達(dá)到啟動(dòng)培養(yǎng)的要求；最佳的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ，增殖系數(shù)為4.27；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+10 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，生根率為71.11%，且根系粗壯。

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