楊宏　韓震　何敏　張翠英

【摘要】 目的：探討肺癌患者恩度聯(lián)合NP方案化療前后外周血循環(huán)內皮細胞（CECs）以及活性循環(huán)內皮細胞（aCECs）的變化及其臨床意義。方法：用流式細胞儀對2013年5月-2015年10月本院20例健康人（對照組）及68例肺癌患者（治療組）治療前后外周血CECs及aCECs進行檢測。結果：對照組外周血CECs及aCECs的數(shù)量均低于治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。恩度聯(lián)合NP治療后CECs及aCECs數(shù)目出現(xiàn)分層變化，其中臨床獲益（CR+PR）患者CECs及aCECs數(shù)目與治療前比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；臨床進展（PD）患者CECs及aCECs數(shù)目與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；臨床穩(wěn)定（SD）患者CECs及aCECs數(shù)目變化分層、CECs數(shù)目變化與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），aCECs數(shù)目與治療前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：恩度通過對腫瘤血管生成的負性調節(jié)，提高了抗腫瘤效果并抑制腫瘤生長速度，CECs及aCECs的聯(lián)合檢測可能是恩度聯(lián)合NP方案治療肺癌的較好療效預測指標。

【關鍵詞】 恩度； 循環(huán)內皮細胞； 活化循環(huán)內皮細胞

The Changes and Significance of Circulating Endothelial Cells in Non-small Cell Lung Cancer Treatment of Endostar Combined with NP Regimen/YANG Hong，HAN Zhen，HE Min，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：023-026

【Abstract】 Objective：To discuss the changes of endothelial cells（CECs） in peripheral blood circulation（CECs） and the changes of the active circulating endothelial cells（aCECs） and its clinical significance in patients with lung cancer patients.Method：CECs and aCECs were detected in 20 healthy people （the control group）and 68 lung cancer patients（the treatment group）by flow cytometry before and after treatmnet from June 2013 to October 2015.Result：The number of CECs and aCECs in control group were significantly lower than those of the treatment group，the differences were statistically significant（P<0.001）. Endostar combined with NP after the treatment of CECs and the number of aCECs layered changes，the number of CECs and aCECs in patients with clinical benefit（CR+PR） were decreased than before treatment，the differences were statistically significant（P<0.001），there were no significant differences of the number of CECs and aCECs in patients with clinical progress（PD） before and after treatment（P>0.05）.The number of CECs and aCECs in patients with clinical stability（SD） was stratified，and there were no significant differences CECs before and after treatment（P>0.05），and the differences of aCECs number before and after treatment was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Endostar can improve anti-tumor therapeutic effect and inhibit tumor growth speed by negative regulation of tumor angiogenesis， the combined detection of CECs and aCECs may be a good predictor to evaluate the Endostar combined with NP chemotherapy in patients with lung cancer.

【Key words】 Endu； Circulating endothelial cells； Activated circulating endothelial cells

First-authors address：Inner Mongolia Peoples Hospital，Hohhot 010017，Chinaendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.007

非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer）是肺癌的特發(fā)病例，也是肺癌患者中占據(jù)比例較大的疾病類型，臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其占肺癌總數(shù)的75%～85%，且診斷難度較大[1]。恩度（Endostar）是我國自主設計研發(fā)的抗新生血管生成療法，治療機制以建立足夠的血管系統(tǒng)，從而為其生長提供氧氣和營養(yǎng)為目標，對抑制血管生成和腫瘤生長具有遏制作用[2]。恩度聯(lián)合化療成為NSCLC一線治療非小細胞肺癌的可行性方案[3]。但是恩度價格很高而且有一定的副反應，因此有必要尋找一種方法來預測其療效，從而可以指導臨床選擇減少患者不必要的經(jīng)濟負擔的方案，真正做到精準治療?？寡苌伤幬锿ㄟ^抑制VEGF-VEGFR途徑來抑制血管內皮細胞特異性生長。是調節(jié)血管生成細胞因子、誘導血管新生和抑制腫瘤生長方面起著重要作用，國外學者研究發(fā)現(xiàn)它能在體內誘導血管新生、反映腫瘤血管生成及監(jiān)測血管治療藥物療效的標記物[4]。其中活化內皮細胞（activited Circulating endothelial cells，aCECs）更可以反映腫瘤的新生血管生成的活力[5]。本研究選用恩度聯(lián)合NP方案治療ⅢB/Ⅳ期非小細胞肺癌，聯(lián)合檢測治療前后患者血清CECs、aCECs水平的變化，分析和比較變化的意義，為臨床決策提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年5月-2015年10月本院68例組織病理學或細胞學確診的晚期非小細胞肺癌患者為治療組，具體納入標準：經(jīng)病理學研究結果證實，確診為晚期非小細胞肺癌患者；KPS評分：0～1分；無化療禁忌證及抗血管生成藥物禁忌證患者。其中男41例，女27例，年齡45～72歲，平均（59±14）歲；鱗癌25例，腺癌43例；Ⅲb期4例，Ⅳ期64例。另選取健康人20例作為對照組，納入標準：（1）健康自愿者；（2）年齡20～70歲；（3）排除心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、內分泌系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤的患者。其中男15例，女5例，年齡37～64歲，平均（52.0±13.5）歲。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 治療組為NP（長春瑞濱+順鉑）方案聯(lián)合恩度，具體為：長春瑞濱25 mg/m2，第1、8天，靜滴；順鉑25 mg/m2，第2～4天，靜滴，并在化療第1～14天靜脈滴注恩度15 mg，每21天為1個療程，至少完成2周期上述方案方可評價療效，至多不超過6個周期。

1.2.2 儀器與試劑 流式細胞儀（FACS AriaTM Cell Sorter）由美國Becton Dickinson公司生產；Beckman-Coulter公司生產的CD45-PE-Cy5抗體（PN：Im2653U）、CD146-PE抗體（Cat：550315）、CD106-FI TC抗體（Cat：551146），天津灝洋生物有限公司的淋巴細胞分離液（Cat：LTS1077），溶血劑為0.83%的氯化銨溶液，PBS液由本實驗室自行配制。

1.2.3 檢測方法 采用熒光抗體標記，流式細胞儀檢測。（1）標本采集：健康對照組在體檢中心體檢時采血。NSCLC患者：在第一周期治療前1 d和第二周期的第22天采血。兩次取清晨靜脈血，分別為1 mL靜脈血和5 mL靜脈血于EDTA抗凝管4 ℃冰箱保存血，6 h處理后并用流式細胞儀自動檢測CECs和aCECs。（2）標本處理：應用細胞分離技萃取單個核細胞約1.5 mL，以3倍PBS液1300 r/min離心5 min，取細胞懸液100～200 μL備測；三種流式試管CD45-PE-Cy5、CD146-PE、CD106-FITC容積分別為2、10、10 μL同時加入50 μL備測細胞懸液，搖勻震蕩，室溫下避光15 min；再于三試劑內加入溶血劑500 μL，搖勻震蕩，室溫下避光10 min；完全溶血后在15 min內上流式細胞儀檢測。（3）標本檢測：檢測前對設備性能進行質控，對光流路質量調控和熒光補償?shù)脑试S范圍進行定性，嚴格散射光信號對單個核細胞群進行設門，標本獲取設門內細胞>100 000個，再據(jù)以Li stmode文件對檢測數(shù)據(jù)及其占比進行統(tǒng)計記錄。

1.3 療效評估標準 依據(jù)胸部CT、腦MR、骨掃描及腹部B超對比，2009年RECIST1.1版實體腫瘤療效評定標準進行評估。按照RECIST標準評價療效，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進展（PD）。CR：全部病灶消失，維持4周以上；PR：病灶縮小至少30%，維持4周以上；SD：介于部分緩解和進展之間；PD：病灶增加超過20%，或出現(xiàn)新病灶。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者治療情況 治療組68例患者中，可評價療效為44例，均至少完成2周期恩度聯(lián)合NP方案治療，沒有患者達到完全緩解（CR），9例患者部分緩解（PR），29例患者穩(wěn)定（SD），6例患者病情進展（PD）。其余24例患者因各種原因未能完成治療。

2.2 兩組治療前CECs及aCECs數(shù)量比較 治療組68例晚期NSCLC患者化療前CECs數(shù)目明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療組化療前aCECs數(shù)目明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。對NSCLC患者進一步分層分析顯示：治療前鱗癌的CECs及aCECs數(shù)目分別為（2677.0±208.5）、（997.0±110.5）個/mL，與腺癌的（2705.0±204.3）、（890.0±103.2）個/mL比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。endprint

2.3 治療組治療前后CECs及aCECs數(shù)量比較 治療組44例可評價療效NSCLC患者中，化療后外周血中CECs的數(shù)目較化療前變化出現(xiàn)分層。其中CR+PR患者外周血CECs數(shù)目較治療前降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；SD、PD患者外周血CECs數(shù)目與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。治療后CR+PR、SD患者外周血aCECs數(shù)目均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；PD患者治療前后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.545）。見表2。

3 討論

抗血管生成藥物通過抑制VEGF-VEGFR途徑來抑制內皮細胞，在腫瘤生長中能加快結構、功能異常的腫瘤血管的形成，產生大量的腫瘤血管[6-7]。其中aCECs是由成熟CECs被激活后進入循環(huán)中轉變而成，通常在腫瘤周圍并參與形成新生血管。因為兩者在腫瘤血管新生和腫瘤生長方面起著重要作用，所以筆者假設其數(shù)量變化可能反映血管生成的變化以及恩度的療效。目前有研究認為其有可能為血管靶向藥物的理想標記物[8-9]。其中活性CECs（aCECs）可以更好地反映腫瘤新生血管生成的活力。國內也有關于CECs在不同腫瘤中的相關研究[10-11]。

本研究聯(lián)合檢測恩度聯(lián)合NP方案治療晚期NSCLC前后的CECs及aCECs變化，并對健康人群（對照組）與NSCLC患者（治療組）的CECs及aCECs進行比較和探討。本研究結果顯示，對照組CECs與aCECs的數(shù)量均低于治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001），這與文獻[12-13]報道結果一致。同時本研究中所有完成2周期恩度聯(lián)合NP方案治療的患者在治療后的平均CECs與aCECs的數(shù)量比治療前出現(xiàn)了不同情況的變化，經(jīng)過分層后結果又有不同，其中CR+PR患者外周血CECs數(shù)目較治療前降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；SD、PD患者外周血CECs數(shù)目與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。治療后CR+PR、SD患者外周血aCECs數(shù)目均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；PD患者治療前后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.545）。文獻[14]研究結果顯示化療造成CECs下降。

以內皮抑制素最為理想，它不僅抑制腫瘤血管生成和腫瘤轉移，使腫瘤細胞凋亡，而且不產生耐藥，毒副作用輕[15-16]，NP+恩度方案聯(lián)合熱療治療晚期非小細胞肺癌是合理、安全、有效的一種可行性方案，而恩度聯(lián)合放化療同步治療可以提高局部晚期非小細胞的局部控制和生存率，恩度聯(lián)合順鉑局部灌注治療晚期NSCLC合并胸腔積液具有一定的臨床效果，不良反應較少，能提高部分患者的生活質量，其作用機制與抑制VEGF、HIF-1α表達水平有關[17-20]。在不同的研究中所檢測的CEC亞群不同（活性或凋亡CEC），單純給予化療后誘發(fā)腫瘤的CECs重新釋放，它增加了即刻的CECs的暫時升高，通過抗血管生成治療克服這部分釋放。本研究采用恩度聯(lián)合NP方案治療NSCLC，結果是有效的，患者CECs及aCECs數(shù)量在治療后均出現(xiàn)下降。

綜上所述，恩度通過對腫瘤血管生成的負性調節(jié)，提高了抗腫瘤效果并抑制腫瘤生長速度，CECs及aCECs的聯(lián)合檢測可能是恩度聯(lián)合NP方案治療肺癌的較好療效預測指標。

參考文獻

[1]文兆明.三維適形放療聯(lián)合小劑量順鉑對老年非小細胞肺癌的療效評價[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報，2012，18（23）：3451-3452.

[2] Yu Y，Moulton K S，Khan M K，et al.E-selectin is required for the antiangiogenic activity of endostatin[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（21）：8005-8010.

[3]滕家俊，韓寶惠，沈潔，等.重組人血管內皮抑制素聯(lián)合治療30例晚期非小細胞肺癌的臨床研究[J].臨床腫瘤學雜志，2008，13（2）：171-175.

[4] Poullet P，Gaut reau A，Kadare G，et al.Ezrin Interacts with Focal Adhesion Kinase and Induces Its Activation Independently of Cell-matrix Adhesion[J].J Biol Chem， 2001，276（40）：37 686.

[5] Shi R L，Li J F，Qu Y，et al.Expression of Ez rin in gast ric carcino Ma and its significance[J].Chinese Journal of Gastrointestinal Surgery，2006，9（5）：433.

[6] Siegel R L，Miller K D，Jemal A.Cancer statistics，2015[J].CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

[7]林麗珠，周京旭，鄭心婷，等.恩度聯(lián)合化療治療晚期復治非小細胞肺癌31例的臨床探討[J].中國腫瘤臨床，2009，36（6）：316-319.

[8] Abdollahi A，Hahnfeldt P，Maercker C，et al.Endostatins antiangiogenic signaling network[J].Mol Cell，2004，13（5）：649-663.

[9]王金萬，劉永煜，張沂平，等.重組人血管內皮抑素聯(lián)合NP方案治療晚期NSCLC隨機、雙盲、對照、多中心Ⅲ期臨床研究[J].中國肺癌雜志，2005，8（4）：283-290.

[10] Bret scher A，Edwards K，F(xiàn)ehon R G.ERM proteins and merlin：Int egrat ors at the cell cortex[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3（8）：586.

[11]王萍，楊金鳳，張慶，等.RhoC基因的過量表達在胃癌中的意義[J].臨床消化病雜志，2007，19（2）：80.

[12]馬倩，孫洪巖，張愛梅，等.流式細胞術檢測非小細胞肺癌外周血循環(huán)內皮細胞方法初探[J].臨床輸血與檢驗，2010，12（2）：100-104.

[13]黃純，李凱.重組人血管內皮抑素聯(lián)合NP方案治療晚期非小細胞肺癌的臨床觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2008，15（4）：283.

[14]孫洪巖，操樂杰，張愛梅，等.肺癌患者外周血循環(huán)內皮細胞和VEGF檢測臨床意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18（13）：1027-1031.

[15]楊一飛.恩度聯(lián)合NP方案治療晚期非小細胞肺癌近期療效觀察[J].浙江中西醫(yī)結合雜志，2009，19（7）：421-422.

[16]黃國勝.NP+恩度方案與熱療聯(lián)合治療非小細胞肺癌[J].河南外科學雜志，2007，13（6）：1-2.

[17]劉麗峰，沙永生，趙曉亮，等.恩度聯(lián)合NP方案治療老年晚期非小細胞肺癌的不良反應觀察及臨床護理[J].護士進修雜志，2014，29（12）：1118-1120.

[18]隋黎麗，王欣，管樂靜，等.恩度聯(lián)合放化療同步治療非小細胞肺癌的臨床觀察[J].中國肺癌雜志，2009，12（6）：560-561.

[19]隋黎麗，王欣，管樂靜，等.恩度聯(lián)合放化療同步治療非小細胞肺癌的臨床觀察[C]//第八屆中國腫瘤轉移學術大會論文集，2009.

[20]朱志真，石建華，侯森，等.恩度聯(lián)合順鉑局部治療非小細胞肺癌合并惡性胸腔積液的療效及對VEGF、HIF-1α的影響[J].實用癌癥雜志，2014，29（7）：855-857.

（收稿日期：2017-07-03） （本文編輯：康玥）endprint