孫利東，許秀麗，袁 飛，聶雪梅，許博舟，洪云鶴，張 峰,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176；2.內(nèi)蒙古滿洲里出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，內(nèi)蒙古 滿洲里 021400）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶和雞肉中4 種激素本底值

孫利東1,2，許秀麗1，袁 飛1，聶雪梅1，許博舟1，洪云鶴1，張 峰1,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176；2.內(nèi)蒙古滿洲里出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，內(nèi)蒙古 滿洲里 021400）

建立牛奶和雞肉中4 種激素（睪酮、甲基睪酮、孕酮、氫化可的松）本底值同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。樣品經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶水解，加入乙腈超聲提取，正己烷除脂肪。采用ZORBAX SB-C18色譜柱分離，以0.1%甲酸溶液和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，分別在電噴霧離子源正、負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分段掃描同時(shí)檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4 種激素在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.991；在牛奶中的檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）分別為0.02～0.10 μg/kg和0.06～0.33 μg/kg，在雞肉中的檢出限和定量限分別為0.03～0.12 μg/kg和0.10～0.40 μg/kg；在3 個(gè)水平下的平均回收率為牛奶56.0%～132.8%，雞肉79.6%～122.0%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為牛奶1.8%～17.3%，雞肉2.0%～18.1%。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于對(duì)牛奶和雞肉中4 種激素進(jìn)行快速篩查和本底值測(cè)定。

激素；雞肉；牛奶；本底值；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

氫化可的松是人工合成也是天然存在的一類糖皮質(zhì)激素，主要影響糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝、提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的作用。睪酮（睪丸酮）是主要的雄性激素，屬類固醇激素。甲基睪酮為天然睪酮的17-α位甲基衍生物，具有雄激素和蛋白同化作用。孕酮是一種天然孕激素，又名黃體酮。以上4 種激素具有影響動(dòng)物性別分化、縮短動(dòng)物生長(zhǎng)周期以及較強(qiáng)的糖代謝及抗炎等作用，可以通過(guò)食物鏈和環(huán)境殘留對(duì)人和動(dòng)物健康、社會(huì)和生態(tài)環(huán)境造成直接和潛在危害[1]。已有研究表明，過(guò)多的激素進(jìn)入人體可使內(nèi)分泌失常，導(dǎo)致代謝紊亂或者腫瘤等疾病[2]。歐盟[3]等國(guó)際組織及國(guó)家均對(duì)動(dòng)物源性食品中激素的殘留作出了嚴(yán)格要求。我國(guó)也有相關(guān)法律規(guī)定，禁止一些激素在動(dòng)物性食品中檢出[4]。在現(xiàn)有報(bào)道中多是激素多殘留同時(shí)測(cè)定的方法，主要用于牛奶[5-6]、肉類[7-9]、海產(chǎn)品[10]、保健品[11]、化妝品[12]、飼料[13]等方面，還沒(méi)有專門針對(duì)本底值測(cè)定的分析方法。并且牛奶和雞肉中激素本底值水平一直沒(méi)有相關(guān)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)，通過(guò)技術(shù)手段嚴(yán)格監(jiān)測(cè)激素的本底值含量，對(duì)于確保食品安全具有極為重要的意義。

本研究針對(duì)牛奶和雞肉中具有代表性的睪酮、孕酮、氫化可的松和甲基睪酮4 種激素本底值含量測(cè)定，建立了特異性的樣品前處理方法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，能夠很好地用于測(cè)定4 種激素的本底值含量。由于激素分析時(shí)基質(zhì)效應(yīng)顯著，且天然激素含量水平低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度要求比較高。本研究采用液液萃取凈化法對(duì)樣品中的4 種激素進(jìn)行提取和凈化，選用的溶劑既能達(dá)到去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的目的，也無(wú)需復(fù)雜的儀器和凈化裝置，使處理過(guò)程大大簡(jiǎn)化，且結(jié)果可靠滿意，滿足痕量分析要求。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高，選擇性和特異性好，能夠?qū)Φ蜐舛鹊臉悠愤M(jìn)行良好確認(rèn)，已成為動(dòng)物源性食品中痕量獸藥殘留分析的重要方法。由于氫化可的松和其他3 種性激素在結(jié)構(gòu)上的差異，質(zhì)譜分析時(shí)需要采用不同采集模式，本方法建立了正、負(fù)離子源分段采集模式檢測(cè)4 種激素殘留，與現(xiàn)有方法比較提高了靈敏度，縮短分析時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了不同種類激素準(zhǔn)確、快速的同時(shí)檢測(cè)，適用于4 種激素在牛奶和雞肉中本底值的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶、雞肉樣品 市購(gòu)；激素標(biāo)準(zhǔn)品：睪酮（純度99.0%）、17α-甲基睪酮（純度98.5%）、氫化可的松（純度99.8%）、孕酮（純度99.3%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸、乙酸鈉、氯化鈉（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純） 美國(guó)賽爾科技公司；β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液 美國(guó)M erck公司；實(shí)驗(yàn)用純水由M illipore純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜 美國(guó)安捷倫公司；API5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司；HH-6恒溫水浴 江蘇金壇億通電子有限公司；VM-6渦旋振蕩器 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；KQ-500DE超聲儀 上海楚定分析儀器有限公司；Allegra X-22R型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；R-220SE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 相關(guān)溶液的配制

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的配制：稱取22.9 g五水乙酸鈉，加入10 m L乙酸，用水溶解并定容到1 000 m L，用乙酸調(diào)節(jié)pH 5.2。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取各激素藥物標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。

1.3.2 色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件：A g ilen t ZORBA X SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇；流速0.8 m L/m in；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫程序：0～2.0 m in，B相30%～85%，2.0～6.5 m in，B相85%～100%，6.5～8.5 m in，B相100%，8.5～9.5 m in，B相100%～30%，9.5～11.5 m in，B相30%。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multip le reaction m onitoring，MRM）采集方式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10.0 L/m in；霧化氣壓力275.8 kPa（40.0 psi）；毛細(xì)管電壓5 500 V；分辨率：MS1、MS2均為Unit；其他質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 4 種激素質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 M ass spectrometric conditions of 4 hormones

本方法在質(zhì)譜分析時(shí)采用分段掃描，0～6 m in為電噴霧離子源負(fù)離子源掃描，6～11.5 m in切換為電噴霧離子源正離子源掃描。

1.3.3 樣品前處理

稱取樣品5.00 g于50 m L離心管中，加入100 μL β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液，10 m L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，37 ℃水浴中酶解12 h。取出，降至室溫，加入10 m L乙腈，渦旋混勻，超聲提取20 m in，水平振蕩5 m in，10 000 r/m in離心10 m in，移出乙腈層于另一離心管中。下層水相再加入10 m L乙腈重提1 次，合并2 次乙腈提取液。加入5 m L正己烷，振蕩5 m in，4 000 r/m in離心10 m in，移去正己烷層，向乙腈提取液中加入1.0 g NaCl固體，靜止分層。將乙腈層移入雞心瓶中，旋蒸至干。加入1 m L 30%甲醇溶液復(fù)溶。過(guò)0.22 μm濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

1.3.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取空白樣品經(jīng)1.3.2節(jié)處理，得到空白樣品提取液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，得到系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)定

采用相對(duì)響應(yīng)值法[14]根據(jù)下式評(píng)定4 種激素的基質(zhì)效應(yīng)：

式中：Am為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值；Ac為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值。

基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜檢測(cè)方法中普遍存在，是影響方法靈敏度的主要因素。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%時(shí)，認(rèn)為基質(zhì)干擾對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，但當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)小于80%或大于120%時(shí)，認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響不可忽略。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定牛奶和雞肉基質(zhì)對(duì)4 種激素的影響，如表2所示，表明大部分激素的基質(zhì)效應(yīng)都在61%～82%之間。所以本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

表2 4 種激素的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 M atrix effects of 4 hormones

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析條件優(yōu)化

在對(duì)氫化可的松掃描方式選擇時(shí)，分別采用電噴霧正離子源和負(fù)離子源掃描，對(duì)比了相同質(zhì)量濃度條件下，2 種不同離子源時(shí)氫化可的松的響應(yīng)，負(fù)離子源時(shí)的響應(yīng)遠(yuǎn)大于正離子源時(shí)的響應(yīng)。可能是由于氫化可的松的分子在負(fù)離子源條件下[15]，易加和甲酸根后形成甲酸去質(zhì)子的母離子，繼而形成失去甲酸的碎片，在儀器分析時(shí)響應(yīng)最強(qiáng)。3 種性激素選用正離子模式掃描，為了達(dá)到4 種激素同時(shí)檢出，在質(zhì)譜分析時(shí)，選用了分段掃描的方式，在0～6 m in時(shí)，對(duì)氫化可的松進(jìn)行負(fù)模式采集，在6～11.5 m in時(shí)，對(duì)3 種性激素進(jìn)行正離子模式采集，如圖1所示。

圖1 4 種激素的MRM圖（5.0 μg/L）Fig. 1 MRM chromatograms of 4 hormones (5.0 μg/L)

2.2 色譜分析條件優(yōu)化

流動(dòng)相的選擇分別考察了0.1%甲酸溶液+乙腈和0.1%甲酸溶液+甲醇時(shí)，4 種激素的分離和響應(yīng)情況。在這2 種流動(dòng)相條件下，4 種激素都能達(dá)到良好分離。如圖2所示，在選用甲醇為有機(jī)相時(shí)，3 種性激素響應(yīng)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于選用乙腈時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度，氫化可的松響應(yīng)受到影響不大，所以選用0.1%甲酸+甲醇為流動(dòng)相。在水相中加入了0.1%的甲酸后，可大大增強(qiáng)3 種性激素的響應(yīng)，并且氫化可的松的響應(yīng)強(qiáng)度并不受很大影響。

圖2 4 種激素在不同流動(dòng)相時(shí)的響應(yīng)對(duì)比Fig. 2 Effect of mobile phase composition on the intensity of response to 4 hormones

2.3 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 前處理方法選擇

圖3 3 種提取凈化方法對(duì)4 種激素的回收率對(duì)比Fig. 3 Effect of cleanup m ethods on the recovery of 4 hormones

如圖3所示，分別考察了3 種樣品前處理方法，方法1[16]將樣品在乙酸銨緩沖溶液中酶解后再經(jīng)甲醇提取，使用ENV I-Carb和氨基SPE柱凈化，由于提取溶液體積接近150 m L，柱凈化時(shí)間長(zhǎng)，大大降低樣品前處理效率；方法2[17]是樣品在乙酸銨緩沖溶液中酶解，加入甲醇提取后，甲基叔丁基醚萃取，再經(jīng)過(guò)濃縮復(fù)溶，SPE柱凈化，該方法操作步驟繁瑣，增加目標(biāo)物損失，回收率低。方法3即本實(shí)驗(yàn)采用方法，將樣品在乙酸銨緩沖溶液中酶解，加入乙腈提取，由于乙腈有很好的除去蛋白作用，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物與基質(zhì)有效分離，再用正己烷除脂，即完成了目標(biāo)的提取與凈化，濃縮復(fù)溶后即可上機(jī)測(cè)定。本方法步驟簡(jiǎn)單高效，凈化效果良好，目標(biāo)物損失較少，在降低基質(zhì)效應(yīng)的同時(shí)能夠保證較高回收率。

2.3.2 提取溶劑選擇

分別考察乙腈、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效果[18-25]，結(jié)果表明乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的回收率都不及乙腈，最終選用乙腈用作提取溶劑。由于蛋白質(zhì)在乙腈中的溶解度很低，在提取過(guò)程中，可以很好地除去基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，再用正己烷除脂凈化，便可達(dá)到測(cè)定要求。牛奶和雞肉2 種基質(zhì)的空白樣品和加標(biāo)圖譜如圖4、5所示。目標(biāo)物附近沒(méi)有干擾峰，改進(jìn)后的樣品處理方法能夠滿足激素本底值測(cè)定的要求。

圖4 空白牛奶樣品（A）和加標(biāo)牛奶樣品（B）的MRM圖（加入量1.0 μg/kg）Fig. 4 MRM chromatogram s of blank m ilk sam p le (A) and spiked m ilk sam p le (B) (at 1.0 μg/kg)

圖5 空白雞肉樣品（A）和加標(biāo)雞肉樣品（B）的MRM圖（加入量1.0 μg/kg）Fig. 5 MRM chromatogram s of blank chicken sam p le (A) and spiked chicken sam p le (B) (at 1.0 μg/kg)

2.4 校準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限結(jié)果

如表3所示，顯示能夠滿足檢測(cè)要求。本方法用空白基質(zhì)提取溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后測(cè)定，根據(jù)響應(yīng)信號(hào)的信噪比來(lái)確定方法的檢出限和定量限[25-31]。當(dāng)RSN為3時(shí)，確定為方法的檢出限，當(dāng)RSN為10時(shí)，確定為方法定量限。如表4所示，牛奶和雞肉的檢出限和定量限分別都在0.12 μg/kg和0.40 μg/kg以下，完全可以滿足本底值檢測(cè)要求。

表3 4 種激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 3 Linear equations, linear relationships and linear ranges of the 4 hormones

表4 4 種激素的檢出限和定量限Table 4 LODs and LOQs of the hormones

2.5 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

在樣品中分別添加1、2 倍和10 倍定量限的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定，如表5所示。牛奶和雞肉的加標(biāo)回收率在56.0%～132.8%之間。

表5 4 種激素在牛奶和雞肉中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 6）Table 5 Recoveries and relative standard deviations (n = 6) of the hormones in spiked m ilk and chicken samp les

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了市售11 份牛奶和7 份雞肉樣品中4 種激素的本底值含量。如表6所示，11 份牛奶樣品氫化可的松含量在0.14～0.30 μg/kg之間，孕酮含量在0.50～3.34 μg/kg之間；5份雞肉樣品氫化可的松含量在0.06～0.43 μg/kg之間，1 份雞肉樣品中孕酮含量為0.26 μg/kg；牛奶和雞肉樣品中均未檢出睪酮和甲基睪酮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法適用于牛奶和雞肉中4 種激素的本底值檢測(cè)。

表6 4 種激素在18 份樣品中的測(cè)定結(jié)果Table 6 Contents of 4 hormones in 18 real sam p les

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)牛奶和雞肉中具有代表性的睪酮、孕酮、氫化可的松和甲基睪酮4 種激素本底值含量測(cè)定，通過(guò)對(duì)樣品前處理和儀器分析方法的改進(jìn)優(yōu)化，建立了特異性的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢測(cè)成本低，為牛奶和雞肉中4 種激素的本底值測(cè)定提供技術(shù)保障。

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[4] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)[EB/OL]. (2008-06-29) [2017-01-20].http://www.moa.gov.cn/zw llm/nybz/index_3.htm.

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High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method for Simultaneous Determination of Background Values of 4 Hormones in M ilk and Chicken

SUN Lidong1,2, XU Xiuli1, YUAN Fei1, NIE Xuemei1, XU Bozhou1, HONG Yunhe1, ZHANG Feng1,*
(1. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China;2. Technology Center of the Manzhouli Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Manzhouli 021400, China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determ ination of background values of 4 hormones (testosterone, methyltestosterone, progesterone and hydrocortisone) in m ilk and chicken. The samples were hydrolyzed by β-glucuronidase and ultrasonically extracted w ith acetonitrile, and then the extract was defatted w ith hexane. The analytes were seperated on a ZORBAX SB-C18column w ith methanol-0.1% form ic acid as mobile phase by gradient elution. The mass spectrometer was run in multiple reaction monitoring mode (MRM) using positive- and negative-ion electrospray ionization (ESI), respectively. The quantitative analysis was carried out by matrix-matched external standard method. The results showed that the calibration curves had good linearity for 4 hormones in the tested concentration ranges, w ith correlation coefficients of more than 0.991. The lim its of detection (LOD, RSN= 3) and lim its of quantitation (LOQ, RSN= 10) were 0.02–0.10 and 0.06–0.33 μg/kg in m ilk, and 0.03–0.12 μg/kg and 0.10–0.40 μg/kg in chicken, respectively. The average recoveries at three spiked levels 56.0%–132.8% for m ilk and 79.6%–122.0% for chicken, and the precisions expressed as relative standard deviations (RSDs)were 1.8%–17.3% for milk and 2.0%–18.1% for chicken. The method proved to be simple, rapid, accurate, and suitable for rapid screening and detection of background values for 4 hormones in m ilk and chicken.

hormones; chicken; m ilk; background values; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

10.7506/spkx1002-6630-201722043

2017-01-24

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0401103；2016YFF0203903）

孫利東（1983—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称分杏卸居泻ξ镔|(zhì)、獸藥殘留檢測(cè)。

E-mail：sunlidong1983@sina.com

*通信作者：張峰（1974—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)、食品安全。E-mail：fengzhang@126.com

O658

A

1002-6630（2017）22-0291-07

孫利東, 許秀麗, 袁飛, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶和雞肉中4 種激素本底值[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):291-297. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722043. http://www.spkx.net.cn

SUN Lidong, XU Xiuli, YU AN Fei, et al. High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous determ ination of background values of 4 hormones in m ilk and chicken[J]. Food Science, 2017, 38(22):291-297. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722043. http://www.spkx.net.cn