黃銀莉 周洪 蘇曉霞 鐘天宇

人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細(xì)胞與人牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的對(duì)比研究

黃銀莉 周洪 蘇曉霞 鐘天宇

目的比較人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesechymal stem cells, hUCWJMSCs)與人牙周膜干細(xì)胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力。方法體外培養(yǎng)hUCWJMSCs和hPDLSCs。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；成骨誘導(dǎo)后測(cè)定細(xì)胞的ALP活性，茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞礦化能力，Real-time PCR分析OPN和Runx2基因的表達(dá)。結(jié)果hUCWJMSCs增殖能力高于hPDLSCs； 經(jīng)礦化誘導(dǎo)后hPDLSCs ALP表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)形成高于hUCWJMSCs(P<0.05)；Runx2在hPDLSCs中表達(dá)高于hUCWJMSCs(P<0.05)；而hUCWJMSCs中OPN表達(dá)高于hPDLSCs(P<0.05)。結(jié)論hUCWJMSCs、hPDLSCs均具有成骨分化能力，hPDLSCs成骨分化能力較強(qiáng)。

人臍帶Wharton’s Jelly間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCWJMSCs)； 人牙周膜干細(xì)胞(hPDLSCs)； 成骨分化

口腔頜面部骨組織工程技術(shù)中種子細(xì)胞的選擇一直是研究的重點(diǎn)[1-2]。牙周膜干細(xì)胞多用于牙周骨組織缺損的研究，但因其來源受限、細(xì)胞產(chǎn)量較低、存在混雜細(xì)胞等缺點(diǎn)，故尋找新的替代種子細(xì)胞成為研究重點(diǎn)。人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesechymal stem cells,hUCWJMSCs)在細(xì)胞增殖、多向分化、免疫特性以及旁分泌等方面更具優(yōu)勢(shì)，引起廣泛關(guān)注[3]；其成骨能力已被證實(shí)并應(yīng)用于骨組織工程，被認(rèn)為是一種新的骨組織種子細(xì)胞[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過體外研究，比較hUCWJMSCs與人牙周膜干細(xì)胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力，探討hUCWJMSCs應(yīng)用于牙周骨組織工程的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Gibco公司,美國)，地塞米松、茜素紅、β-甘油磷酸鈉、L-抗壞血酸2-磷酸鹽(Sigma公司，美國)，總RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國)，引物合成、PCR試劑盒、cDNA合成試劑盒(Takara公司，日本)，ALP半定量試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)，倒置相差顯微鏡(Nikon,日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測(cè) hUCWJMSCs、hPDLSCs增殖能力

臍帶來源：健康足月產(chǎn)婦中獲得新鮮臍帶，實(shí)驗(yàn)獲得西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者對(duì)其用途均知情同意。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/ml，接種到96 孔板，每孔100 μl，MTT法連續(xù)8 d檢測(cè)2 種細(xì)胞增殖情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)復(fù)孔，繪制增殖曲線。

1.2.2 hUCWJMSCs和hPDLSCs體外成骨分化能力比較

1.2.2.1 成骨誘導(dǎo)后ALP表達(dá)的比較 取P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs干細(xì)胞，以2×104/孔接種于24 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到 70%～80%融合時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，成骨誘導(dǎo)液為：DMDM/F12培養(yǎng)基，100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素，0.25 μg/ml兩性霉素B、終濃度10%FBS，10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油及50 μmol/L的L-抗壞血酸-2-磷酸。3 d換1 次培養(yǎng)液；用普通培養(yǎng)基同時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞，其它培養(yǎng)條件與成骨分化組相同，做為陰性對(duì)照。

分別在誘導(dǎo)0、1、3、5、7、14、21 d收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組上清液進(jìn)行堿性磷酸酶半定量檢測(cè)。檢測(cè)步驟按堿性磷酸酶半定量試劑盒進(jìn)行。

1.2.2.2 成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)半定量比較 取P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs干細(xì)胞，以5×104細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種于6 孔中，在37 ℃，5%CO2恒定濕度培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60%以上融合時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)14、21 d后進(jìn)行茜素紅染色、拍照。每孔加入1 ml 10%氯化十六烷基置室溫下30 min，吹打是鈣化結(jié)節(jié)完全溶解，吸取上清液300 μl，562 nm紫外分光光度計(jì)測(cè)量A值。分別在14、21 d以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)復(fù)孔。收集數(shù)據(jù)并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2.3 Real-time PCR比較成骨基因表達(dá) 取P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs干細(xì)胞，以5×104細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔中，成骨誘導(dǎo)0、3、7、14、21 d，以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 次。Trizol提取總RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA(表 1)。

表 1 PCR引物

1.3 兩步法進(jìn)行進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)

預(yù)變性95 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)結(jié)果曲線進(jìn)行確認(rèn)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 hUCWJMSCs、hPDLSCs增殖能力

MTT法繪制hUCWJMSCs和hPDLSCs的增殖曲線，顯示:前兩天細(xì)胞處于潛伏期，3～6 d處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7 d細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高值進(jìn)入平臺(tái)期。hUCWJMSCs進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)間早于hPDLSCs且增殖速度較快(圖 1)。

2.2 hUCWJMSCs和hPDLSCs體外成骨分化能力比較

2.2.1 ALP半定量檢測(cè) 通過對(duì)hUCWJMSCs、hPDLSCs成骨誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)1 、3、5 、7 、14、21 d進(jìn)行ALP半定量檢測(cè)。結(jié)果表明hUCWJMSCs、hPDLSCs成骨誘導(dǎo)組相對(duì)于對(duì)照組均高表達(dá)；同時(shí)hPDLSCs成骨誘導(dǎo)后ALP分泌明顯高于hUCWJMSCs且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖 2)。

2.2.2 茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)半定量檢測(cè) 分別對(duì)hUCWJMSCs和hPDLSCs成骨誘導(dǎo)14、21 d后進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示，2 種細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后有紅色被染礦化基質(zhì)形成，21 d后陽性被染顆粒明顯增多，而對(duì)照組則無明顯紅色被染顆粒形成。同時(shí)可見hPDLSCs組21 d后茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)形成明顯多于hUCWJMSCs(圖 3)。礦化結(jié)節(jié)半定量比較也得出相似的結(jié)論(圖 4)。

圖 1 hUCWJMSCs和hPDLSCs的增殖曲線 圖 2 各組細(xì)胞ALP表達(dá)水平

Fig 1 Growth curves of hUCWJMSC and hPDLSCs Fig 2 ALP expression of the cells

圖 3 茜素紅染色結(jié)果(-129 μm)

Fig 3 Alizarin red staining results(-129 μm)

圖 4 各組細(xì)胞礦化水平比較 圖 5 Runx2和OPN mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)

Fig 4 Comparison of the minerialization level of the cells Fig 5 mRNA expression of Runx2 and OPN in the cells

2.2.3 成骨誘導(dǎo)后Real-time PCR比較成骨基因表達(dá)

提取RNA后進(jìn)行純度及含量測(cè)定，結(jié)果顯示各組A260/A280比值均1.8,提示無蛋白質(zhì)污染，RNA純度可滿足實(shí)驗(yàn)要求。hUCWJMSCs和hPDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后分別于3、7、14、21 d后采用Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)成骨基因OPN和Runx2的表達(dá)，結(jié)果表明成骨誘導(dǎo)后，此2 種基因均有表達(dá)。其中Runx2在hPDLSCs中表達(dá)高于hUCWJMSCs(P<0.05)；而OPN在hUCWJMSCs成骨誘導(dǎo)組高于hPDLSCs(P<0.05，圖 5)。

3 討 論

近幾年，關(guān)于hUCWJMSCs應(yīng)用于牙周組織修復(fù)的研究引起了口腔醫(yī)生的高度關(guān)注。付云等[6]利用跨室培養(yǎng)裝置研究hUCWJMSCs定向分化為hPDLSCs的可能性，研究表明，在一定條件下可定向分化為hPDLSCs；將hUCWJMSCs用于自體牙移植后牙周修復(fù)的研究，結(jié)果顯示在牙本質(zhì)表面形成被纖維樣組織包繞的牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，提示hUCWJMSCs可用于自體牙移植后牙周組織的愈合[7]。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示hUCWJMSCs可作為牙周再生的種子細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究。

hUCWJMSCs和hPDLSCs的成骨分化能力分別被諸多實(shí)驗(yàn)證明[8-9]，同時(shí)也分別比較與其他成體干細(xì)胞成骨分化能力。Wen等[10]比較了hUCWJMSCs與骨髓干細(xì)胞(hBMSCs)、脂肪干細(xì)胞(hAD-MSCs)成骨分化能力，hBMSCs較hUCWJMSCs、hAD-MSCs表達(dá)更多的ALP陽性被染顆粒，hUCWJMSCs、hAD-MSCs較hBMSCs表達(dá)更多的COL-1和Runx2，hUCWJMSCs高表達(dá)OPN且有骨結(jié)構(gòu)形成，說明hUCWJMSCs可作為骨組織缺損修復(fù)的種子細(xì)胞。研究表明，在炎癥狀況下hBMSCs骨形成能力明顯高于hPDLSCs，說明hPDLSCs免疫調(diào)節(jié)能力較弱[11]。但是關(guān)于hUCWJMSCs和hPDLSCs兩種干細(xì)胞成骨分化能力的研究尚缺乏。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hUCWJMSCs較hPDLSCs增殖能力更強(qiáng)，擴(kuò)增用時(shí)更短，結(jié)果與其他學(xué)者研究相似[12]，hUCWJMSCs細(xì)胞倍增的時(shí)間為22.23 h，hPDLSCs為27.51 h；其與牙髓干細(xì)胞增殖能力較hBMSCs與hAD-MSCs高[13]。本實(shí)驗(yàn)通過體外對(duì)2 種干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，檢測(cè)成骨分化過程中與成骨相關(guān)的特異性蛋白和胞外基質(zhì)，比較2 種干細(xì)胞成骨分化能力。hPDLSCs表達(dá)ALP明顯高于hUCWJMSC，且較hUCWJMSCs形成的礦化結(jié)節(jié)量更多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Runx2是轉(zhuǎn)錄因子家族Runx中重要的一員，成骨細(xì)胞的增殖和分化有密切的聯(lián)系，是成骨分化過程的早期基因[14]。本實(shí)驗(yàn)Runx2表達(dá)誘導(dǎo)隨時(shí)間的增加，表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，最高峰為7 d，后呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。Hsieh等[15]通過對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)，檢測(cè)Runx2表達(dá)變化，得出了相似的結(jié)果。同時(shí)，hPDLSCs較hUCWJMSCs組Runx2要高表達(dá)，說明在相同的條件下hPDLSCs早期表達(dá)更多的Runx2以參與干細(xì)胞成骨分化過程。Ciavarella等[16]研究表明Runx2可通過促進(jìn)成骨特異性基因如骨鈣蛋白(Osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白( Osteopontin，OPN)以及其他骨涎蛋白(bone Sialoproteins)的表達(dá)，同時(shí)也表達(dá)于牙周韌帶纖維細(xì)胞中，故其除參與細(xì)胞成骨分化過程外也存在于牙周組織中，故進(jìn)一步解釋了hPDLSCs表達(dá)高于hUCWJMSCs的原因。OPN是一種成骨細(xì)胞在鈣三醇的刺激下表達(dá)的成骨相關(guān)基因，對(duì)骨的重塑、細(xì)胞遷移、腫瘤轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)都具有多方面的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)中hUCWJMSCs較hPDLSCs高表達(dá)，說明在相同的條件下hUCWJMSCs表達(dá)更多的OPN以參與干細(xì)胞生理作用。OPN對(duì)干細(xì)胞的影響是多方面的，在干細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要的作用，關(guān)于其調(diào)節(jié)成骨分化的機(jī)制尚不是很清楚，需要進(jìn)一步研究[18]。

關(guān)于兩者成骨分化能力差異的原因，可能是hUCWJMSCs來源為胚胎干細(xì)胞，其表達(dá)更多較為原始的基因。相關(guān)研究顯示hPDLSCs較hUCWJMSCs擁有更多的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成且可抑制破骨細(xì)胞形成的基因如SATB1、SATB2和TNFRSF11B[19-20]，hUCWJMSCs則擁有更多與胚胎發(fā)育相關(guān)基因和促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因，如HOXC8其在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)可抑制細(xì)胞的沉骨分化[21]，故hUCWJMSCs較hPDLSCs有更強(qiáng)的增殖能力，而成骨能力卻沒有明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)誘導(dǎo)方法對(duì)hUCWJMSCs和hPDLSCs 2 種干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，并通過ALP、茜素紅染色和半定量以及成骨相關(guān)表達(dá)基因OPN和Runx2的檢測(cè)，比較2 種細(xì)胞成骨分化能力。研究結(jié)果顯示hUCWJMSCs和hPDLSCs都具有明顯的成骨分化能力，但未修飾的hUCWJMSCs不能直接用于牙周骨組織修復(fù)，需進(jìn)行相關(guān)成骨基因的修飾后方可應(yīng)用。

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TheosteogenesisabilityofhumanumbilicalcordWharton’sJelly-derivedmesenchymalstemcellsandperiodontalmesenchymalstemcells

HUANGYinli,ZHOUHong,SUXiaoxia,ZHONGTianyu.

710004,DepartmentofOrthodontics,StomatologicalHospitalofXi'anJiaotongUniversity,China

Objective： To compare the osteogenesis ability between human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells(hUCWJMSCs) and human periodontal ligament mesenchymal stem cells(hPDLSCs)invitro.MethodshUCWJMSCs and hPDLSCs wereinvitrocultured. The cell proliferation capacity was examined by MTT assay. After osteogenesis induction culture, ALP activity of the cells was determined, minerialization was observed by alizarin red staining, OPN and Runx2 mRNA expression was analyzed by Real-time PCR.ResultshUCWJMSCs grew faster than hPDLSCs. After osteogenic differentiation induction, hPDLSCs group showed higher ALP level, more mineralized nodule formation and higher Runx2 expression compared with hUCWJMSCs group(P<0.05); while the OPN expressed higher in hUCWJMSCs than in hPDLSCs(P<0.05).ConclusionhUCWJMSCs and hPDLSCs have osteogenesis differentiation potential, hPDLSCs are more osteogenetic.

HumanumbilicalcordWharton’sJelly-derivedmesenchymalstemcells(hUCWJMSCs);Humanperiodontalligamentmesenchymalstemcells(hPDLSCs);Osteogenicdifferentiation

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)： 2008ZDKG-65)

710004， 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科

周洪 029-87281409 E-mail： zhouhong@mail.xjtu.edu.cn

R329.2

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.021

(收稿： 2017-03-30 修回： 2017-04-26)