藺棟鵬 呂瑾茹 趙天一 王永功 彭利偉 馬秦

透明質(zhì)酸、TGF-β1對下頜骨髁突軟骨增殖分化的影響

藺棟鵬 呂瑾茹 趙天一 王永功 彭利偉 馬秦

目的研究透明質(zhì)酸(HA)、TGF-β1因子對下頜骨髁突軟骨增殖分化的影響。方法取新生小鼠的下頜骨髁突軟骨體外進(jìn)行組織培養(yǎng)，按培養(yǎng)液內(nèi)添加因子不同分為對照組、HA(0.5 mg/ml)、TGF-β1(5 ng/ml)組，于培養(yǎng)1、2、4、6、8 周后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、軟骨面積測量、茜素紅染色以及堿性磷酸酶染色研究。結(jié)果對照組中髁突軟骨在培養(yǎng)4 周后軟骨內(nèi)開始出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)，茜素紅染色、堿性磷酸酶染色提示軟骨基質(zhì)出現(xiàn)了鈣化、軟骨內(nèi)成骨的過程；HA組中髁突軟骨內(nèi)未出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)，而髁突軟骨面積卻顯著增大(P<0.05)；TGF-β1組中髁突軟骨在培養(yǎng)2 周后提前出現(xiàn)了高密度光阻射區(qū)，然軟骨面積無顯著改變(P>0.05)。結(jié)論在體外培養(yǎng)下，HA可以促進(jìn)髁突軟骨的增殖，對軟骨細(xì)胞的肥大分化有一定的抑制作用，TGF- β1 在早期可顯著促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞的肥大分化。

下頜骨髁突軟骨； 組織培養(yǎng)； 體外； 透明質(zhì)酸； TGF- β1； 增殖分化

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(TMJ OA)是發(fā)生于成人顳頜關(guān)節(jié)區(qū)的骨關(guān)節(jié)炎，其顯著特征是髁突軟骨基質(zhì)進(jìn)行性降解，并引起一系列臨床癥狀，給患者的生活質(zhì)量造成很大的影響。研究顯示[1]，OA的病理改變類似于軟骨內(nèi)成骨過程中軟骨細(xì)胞的肥大分化過程。透明質(zhì)酸(HA)是一種高分子量的粘多糖，構(gòu)成了關(guān)節(jié)軟骨與滑液的主要成分，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HA不僅被廣泛應(yīng)用于治療OA引起的疼痛[2]，而且還能夠延緩OA的進(jìn)程[3]。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)在軟骨細(xì)胞的增殖分化中起重要作用，TGF-β1屬于TGF-β超家族中的一個(gè)亞型，實(shí)驗(yàn)證明TGF-β1不僅可以抑制軟骨細(xì)胞的肥大分化，而且能維持未分化的軟骨細(xì)胞表型[4]。本人在前期實(shí)驗(yàn)已成功建立了髁突軟骨在體外培養(yǎng)下軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大分化，自發(fā)基質(zhì)鈣化的模型。本次研究使用前期的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討HA、TGF-β1對髁突軟骨細(xì)胞增殖分化的影響，為臨床上研究髁突軟骨細(xì)胞增殖分化異常導(dǎo)致的疾病提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用新生3 d的昆明小鼠子鼠，平均體重為2.1 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)由大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施。

1.1.2 主要試劑 IMDM培養(yǎng)液(Hyclone,美國)，100 μg/ml青鏈霉素(Solarbio,北京), β-甘油磷酸鹽、蘇木精伊紅染液、0.05%茜素紅染色液、0.01% light green solution(Sigma,美國)，4%多聚甲醛固定液、堿性磷酸酶染色液試劑盒(Leagene，北京)，PBS(實(shí)驗(yàn)室提供)，梯度酒精等。

1.1.3 主要設(shè)備 超凈工作臺、生物組織包埋機(jī)、展烤片機(jī)(愛華，天津)，石蠟切片機(jī)(Leica,德國)，電熱恒溫干燥箱(東星，上海)，培養(yǎng)箱，體視顯微鏡、倒置顯微鏡 (Olypus,日本)，12孔板，顯微外科手術(shù)器械等。

1.2 方法

1.2.1 分組取材 采用新生3 d的昆明小鼠子鼠30 只，在超凈工作臺內(nèi)，斷頸處死后得到60 支髁突組織，按培養(yǎng)液內(nèi)添加因子不同分為3 組(對照組、TGF-β1組，HA組)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組按照不同時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、6、8 周)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。其中，髁突組織被切長度約2 mm，要求包含全部髁突軟骨和部分骨組織。

1.2.2 體外組織培養(yǎng) 將取好的軟骨組織先用無菌PBS液沖洗10 min后，再用配置好的IMDM培養(yǎng)液(含100 μg/ml青鏈霉素，β-甘油磷酸鹽5 mmol/L)沖洗2 次，每次5 min。隨后將髁突軟骨組織放入12 孔板內(nèi)，每孔含IMDM培養(yǎng)液1 ml。最后將培養(yǎng)板放入37 ℃，含CO2濃度為5%的恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)液每周更換3 次。其中HA組中培養(yǎng)液采用的濃度是0.5 mg/ml[5]，TGF-β1組中培養(yǎng)液采用的濃度是5 ng/ml[6]。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察與軟骨面積測量 分別于5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、6、8 周)對軟骨組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察與軟骨面積測量，具體方法：采用倒置顯微鏡觀察，每次使用相同的倍數(shù)(×40)、標(biāo)尺及其它光學(xué)參數(shù)，保持軟骨組織在同一水平面，拍攝照片后將其導(dǎo)入Cellsens 1.7顯微圖像軟件，在軟件中利用多邊形測量工具測量軟骨的面積 (S,μm2)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量6 張圖片，每張圖片測量5 次，并記錄數(shù)值。軟骨面積具體測量見圖 1。

圖 1 髁突軟骨面積測量

1.2.4 茜素紅染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、漂洗后，切片入0.05%茜素紅染液30 min，漂洗2 min后，再入0.01%Light green solution 5 min，最后脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、干燥。

1.2.5 堿性磷酸酶染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、漂洗后，切片入ALP孵育液，37 ℃孵育2～12 h。蒸餾水漂洗5 min后，切片入硝酸鈷溶液，37 ℃孵育5 min。蒸餾水漂洗5 min后，切片入ALP硫化工作液，37 ℃孵育2 min。最后蒸餾水漂洗，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min,二甲苯脫水，透明，中性樹膠封片、干燥。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)軟骨面積測量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察與軟骨面積測量

通過倒置顯微鏡觀察，可以看到各培養(yǎng)組在體外培養(yǎng)下，軟骨組織沒有發(fā)生崩解壞死現(xiàn)象?？瞻着囵B(yǎng)組中髁突軟骨在培養(yǎng)4 周后，髁突軟骨后緣與骨交界處出現(xiàn)了高密度光阻射區(qū)，培養(yǎng)6 周結(jié)束，高密度光阻射區(qū)延伸至對側(cè)軟骨，培養(yǎng)8 周后高密度光阻射區(qū)幾乎占據(jù)整個(gè)軟骨區(qū)域(圖 2)。TGF-β1 組在培養(yǎng)2 周后，高密度光阻射區(qū)提前發(fā)生，培養(yǎng)4 周后，軟骨內(nèi)高密度光阻射區(qū)延伸至對側(cè)軟骨，培養(yǎng)6 周、8 周結(jié)束，高密度光阻射區(qū)同樣幾乎占據(jù)整個(gè)軟骨區(qū)。HA組髁突軟骨自培養(yǎng)初至培養(yǎng)8 周結(jié)束，軟骨內(nèi)均未觀察到高密度光阻射區(qū)。隨著培養(yǎng)時(shí)間推進(jìn)，HA組中髁突軟骨面積呈上升趨勢；而對照組與TGF-β1組，髁突軟骨面積無明顯變化。HA對髁突軟骨的增殖具有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)，而 TGF-β1對于髁突軟骨的增殖無顯著作用(P>0.05)(圖 3)。

圖 2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(×40)

Fig 2 Morphological observation(×40)

圖 3 髁突軟骨面積直方圖

2.2 茜素紅染色

對照組中髁突軟骨在培養(yǎng)4周后胞外基質(zhì)(ECM)發(fā)生了鈣化，而TGF-β1組中髁突軟骨培養(yǎng)2 周后，ECM鈣化提前發(fā)生，培養(yǎng)4 周后，ECM鈣化幾乎占據(jù)了大部分軟骨層。而HA組中髁突軟骨內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)ECM鈣化(圖 4)。

2.3 堿性磷酸酶染色

對照組與TGF-β1組中髁突軟骨培養(yǎng)4周后，堿性磷酸酶活性不僅表達(dá)于鈣化軟骨層及骨組織，而且表達(dá)于發(fā)生肥大分化的軟骨細(xì)胞及胞外基質(zhì)。培養(yǎng)8 周結(jié)束，堿性磷酸酶表達(dá)更為明顯。堿性磷酸酶活性的增強(qiáng)提示軟骨細(xì)胞發(fā)生的肥大分化，其實(shí)質(zhì)是正在經(jīng)歷軟骨內(nèi)成骨的一個(gè)過程。而HA組中髁突軟骨除肥大層及骨組織表達(dá)陽性外，其余軟骨層未見明顯表達(dá)(圖 5)。

3 討 論

3.1 骨關(guān)節(jié)炎與軟骨細(xì)胞肥大分化

髁突軟骨屬于繼發(fā)性軟骨，其生長特性與長骨生長板軟骨不同，主要由纖維軟骨構(gòu)成，易受到局部因素的影響[7]。本實(shí)驗(yàn)中髁突軟骨在體外培養(yǎng)條件下，發(fā)生的軟骨細(xì)胞肥大分化，自發(fā)基質(zhì)鈣化的現(xiàn)象，主要由髁突軟骨的生長特性決定的。髁突軟骨細(xì)胞的肥大分化過程主要存在于軟骨內(nèi)成骨(EO)的過程中，髁突軟骨增殖層中含有未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞具有多向分化的潛能，在基因的調(diào)控下細(xì)胞開始聚集增殖分化為軟骨細(xì)胞，隨后軟骨細(xì)胞停止增殖發(fā)生肥大化[8]，最終肥大分化的細(xì)胞被成骨細(xì)胞所代替，并表達(dá)自身特有的標(biāo)記物ALP、X型膠原。骨關(guān)節(jié)炎是一種以ECM降解為特征的退行性疾病，正常的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在生理環(huán)境下，通過適度的代謝活性，以維持ECM的組成。而在病理環(huán)境下，一些關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞失去了分化表型，軟骨細(xì)胞進(jìn)入了一個(gè)類似于EO的增殖過程和肥大分化過程[9]，并伴隨著肥大分化階段顯著的標(biāo)記物表達(dá)，如ALP[10]，X型膠原等。因此本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)下髁突軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大分化，基質(zhì)鈣化的模型可以作為體外骨關(guān)節(jié)炎模型來研究。

圖 4 茜素紅染色(×40)

Fig 4 Alizarin red staining(×40)

圖 5 堿性磷酸酶染色(×100)

Fig 5 Alkaline phosphatase staining(×100)

3.2 TGF-β1早期促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞肥大分化

本實(shí)驗(yàn)添加TGF-β1的培養(yǎng)組中，早期培養(yǎng)2 周后髁突軟骨細(xì)胞開始發(fā)生肥大分化，形態(tài)學(xué)觀察看到了明顯的高密度光阻射區(qū)，茜素紅染色證實(shí)ECM發(fā)生了鈣化，堿性磷酸酶染色表明軟骨細(xì)胞正經(jīng)歷著軟骨內(nèi)成骨的過程，然而軟骨面積與對照組相比無明顯差異。這表明TGF-β1早期促進(jìn)了髁突軟骨細(xì)胞的肥大分化，但對軟骨細(xì)胞的增殖并無顯著影響。Delatte[11]在體外培養(yǎng)髁突軟骨發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液內(nèi)添加TGF-β1可以顯著增加髁突軟骨中GAG、膠原的含量，但TGF-β1對髁突軟骨細(xì)胞的增殖并無明顯影響。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論有相似之處。Livne[12]在體外組織培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠明顯促進(jìn)TMJ OA鼠的下頜骨髁突軟骨細(xì)胞的基質(zhì)合成，還可誘導(dǎo)增強(qiáng)堿性磷酸酶的代謝活性。本實(shí)驗(yàn)中TGF-β1組髁突軟骨培養(yǎng)2 周后，ALP的活性增強(qiáng)與其結(jié)論一致。另外，TGF-β1對于髁突軟骨細(xì)胞增殖分化的影響，除受自身生物學(xué)特性影響外，還可能與TGF-β1的濃度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。

3.3 HA抑制髁突軟骨細(xì)胞肥大分化，促進(jìn)軟骨增殖

HA由B型滑膜細(xì)胞分泌，具有潤滑、營養(yǎng)和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的功能。本實(shí)驗(yàn)添加HA的培養(yǎng)組中，形態(tài)學(xué)觀察髁突軟骨內(nèi)始終未出現(xiàn)高密度光阻射區(qū)，茜素紅染色也未發(fā)現(xiàn)ECM鈣化現(xiàn)象，堿性磷酸酶染色表達(dá)陰性證實(shí)了髁突軟骨細(xì)胞并未發(fā)生肥大分化。而髁突軟骨面積直方圖明顯看到HA對髁突軟骨的增殖作用顯著。因此可以認(rèn)為，在體外環(huán)境下，HA 對于髁突軟骨細(xì)胞的肥大分化存在一定的抑制作用，但能顯著地促進(jìn)了軟骨的增殖。HA目前被越來越多運(yùn)用于臨床治療OA引起的關(guān)節(jié)疼痛，實(shí)驗(yàn)研究表明HA能夠延緩OA的進(jìn)程。趙天一[13]利用本實(shí)驗(yàn)的研究模型證實(shí)了HA可以抑制下頜骨髁突軟骨鈣化，并對其發(fā)生的可能機(jī)制進(jìn)行了闡述；這與本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)一致。Christopher[14]在研究關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的特性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)系統(tǒng)中加入HA后，對于軟骨細(xì)胞基質(zhì)的產(chǎn)生和軟骨細(xì)胞的增殖活性有明顯的促進(jìn)作用。而外源性的HA治療OA的生理效應(yīng)很大程度還取決于HA的分子質(zhì)量，高分子質(zhì)量的HA 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射較低分子質(zhì)量HA對于OA引起的疼痛更為有效[15]。本實(shí)驗(yàn)中HA抑制了軟骨細(xì)胞的肥大分化，從臨床角度看在一定程度上緩解了OA的病理過程，但對其確切的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了TGF-β1、HA對于髁突軟骨增殖分化的影響。TGF-β1早期對軟骨細(xì)胞肥大分化的促進(jìn)作用，HA促進(jìn)髁突軟骨增殖，抑制軟骨細(xì)胞肥大分化的結(jié)果將對后期更深入的研究與其相關(guān)的臨床疾病提供了可靠的依據(jù)。

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TheeffectsofhyaluronicacidandTGF-β1onthegrowthofmandibularcondylarcartilageandthehyperthophicdifferentiationofthecondylarchondrocyts

LINDongpeng1,LVJinru2,ZHAOTianyi3,WANGYonggong1,PENGLiwei1,MAQin4.

1. 450000Zhengzhou,DepartmentofStomatology,HenanProcincialPeople'sHospital,China; 2.DepartmentofStomatology,ZhengzhouPeople'sHospital; 3.DepartmentofStomatology,SuzhouDentalHospital,China; 4.StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology&NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases&ShaanxiClinicalResearchCenterforOralDiseases,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery，SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an

Objective: To study the effects of hyaluronic acid(HA) and TGF-β1 on the growth of mandibular condylar cartilage and the hyperthophic differentiation of the condylar chondrocyts.Methods60 condyle samples from newborn mice wereinvitrocultured and treated with HA(0.5 mg/ml), TGF- beta 1(5 ng/ml) and without additional agent(the control) respectively. The Morphological observation,Alizarin Red Staining, Alkaline phosphatase staining and condylar cartilage surface area measurement were conducted after 1, 2, 4, 6 and 8 weeks of culture respectively.ResultsHigh-density photoresist area was observed in the condylar cartilage of the control group after 4 weeks of culture. Alizarin Red Staining and Alkaline phosphatase staining showed condylar cartilage matrix production and calcification.The HA group showed no high-density photoresist area at all time points, however, the cartilage area was significantly increased(P<0.05); the TGF-beta 1 group showed high-density photoresist area after 2 weeks of culture. but the cartilage area were not significantly changed(P>0.05).ConclusionHA can promote the growth of condylar cartilageinvitro, but have an inhibitory effect on chondrocyte differentiation. TGF-β1 plays a role in mandibular condylar chondrocyte hypertrophic differentiation in the early days ofinvitroculture.

Mandibularcondylarcartilage;Tissueculture;Invitro;Hyaluronicacid(HA);TGF-β1;Hyperplasia

十二五軍隊(duì)重點(diǎn)課題(編號： BWS11J046)

450000 鄭州， 河南省人民醫(yī)院口腔頜面外科(藺棟鵬 彭利偉 王永功)； 鄭州人民醫(yī)院口腔科(呂瑾茹)； 蘇州口腔醫(yī)院(趙天一)； 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科(馬秦)

馬秦 E-mail： qinma@fmmu.edu.cn

R782.6

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.003

(收稿： 2017-03-28 修回： 2017-03-30)