王 穎，付 強(qiáng)，陳雅寒，成巨龍，安德榮

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.陜西省煙草公司 煙草研究所，西安 710061)

超敏蛋白BaPE1對(duì)煙草馬鈴薯Y病毒的誘導(dǎo)抗性

王 穎1，付 強(qiáng)1，陳雅寒1，成巨龍2，安德榮1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.陜西省煙草公司 煙草研究所，西安 710061)

為了探究超敏蛋白對(duì)煙草馬鈴薯Y病毒病的誘導(dǎo)抗性影響，采用半葉枯斑法和田間效果試驗(yàn)研究超敏蛋白BaPE1提取物對(duì)枯斑三生煙和普通煙的誘導(dǎo)抗性和促生作用。結(jié)果表明，超敏蛋白BaPE1能誘導(dǎo)煙株對(duì)煙草馬鈴薯Y病毒產(chǎn)生抗性，并對(duì)煙草有一定的促生作用。接種前48 h噴施500 μg/mL超敏蛋白BaPE1預(yù)防效果達(dá)70.46%，接種后24 h、48 h噴施500 μg/mL超敏蛋白BaPE1治療效果達(dá)61.30%和60.59%,均顯著高于對(duì)照組；噴施500 μg/mL超敏蛋白后煙草在株高、莖圍、最大葉面積等方面表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)勢(shì)，并高于其他處理。因此，超敏蛋白BaPE1不僅可以提高煙草抗性而且還能促進(jìn)煙株生長(zhǎng)、提高煙葉經(jīng)濟(jì)效益。

超敏蛋白；煙草馬鈴薯Y病毒；抗性；促生

煙草馬鈴薯Y病毒病是由馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的系統(tǒng)性病害，主要通過煙蚜介體傳播[1]。該病毒一般與煙草花葉病毒以及黃瓜花葉病毒等混合侵染，引起煙株花葉、斑駁、矮化、畸形、脈帶壞死等癥狀，嚴(yán)重影響煙葉的質(zhì)量與產(chǎn)量，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，對(duì)于煙草病害的防治主要以化學(xué)農(nóng)藥和使用抗病品種為主，成效甚微，且化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用造成的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及抗藥性增加等問題日漸嚴(yán)重。生物防治作為符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的防治手段，得到越來越多人的關(guān)注。

1992年首次從梨火疫病原菌(Erwiniaamylovory)中分離得到超敏蛋白，之后國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者不斷從多種病原細(xì)菌中分離出具有相似功能的蛋白激發(fā)子[3-5]。超敏蛋白BaPE1是由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba-168菌株產(chǎn)生的非特異性蛋白因子，屬于新型激活蛋白，具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生非寄主抗性和一定的促生作用[6-7]。本研究采用由解淀粉芽孢桿菌Ba-168菌株通過發(fā)酵得到的超敏蛋白BaPE1對(duì)煙草馬鈴薯Y病毒的誘導(dǎo)抗性進(jìn)行研究，希望能夠?yàn)闊煵莶『Ψ乐翁峁﹨⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 植物材料、供試菌株及相關(guān)培養(yǎng)基

煙草：心葉煙(Nitcotianaglutinosa)、普通煙 NC89(Nitcotianatobacumvar.NC89)，分別由中國(guó)農(nóng)科院煙草研究所和陜西省煙草研究所提供。

菌株：解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba-168菌株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病毒和資源微生物實(shí)驗(yàn)室前工作者分離、鑒定并保藏。

供試病毒：煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒實(shí)驗(yàn)室分離保存于(25±3) ℃防蟲溫室中普通煙草上。

試劑及儀器：w=20%嗎啉胍·乙銅(moroxydine hydrochloride-copper acetate，MCA)可濕性粉劑，青島瀚正益農(nóng)生物科技有限公司；φ=8%寧南霉素(ningnanmycin)水劑，黑龍江強(qiáng)爾生化技術(shù)開發(fā)有限公司；手持式噴霧器，浙江廣豐塑業(yè)有限公司。

發(fā)酵用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)uria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、H2O 1 000 mL、pH 7.2。

1.2 超敏蛋白BaPE1的制備

將解淀粉芽孢桿菌Ba-168菌株接種于LB平板上進(jìn)行活化，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取適量菌株接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)72 h，從而制得超敏蛋白BaPE1發(fā)酵液。

將發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心12 min后，將收集到的上清液通過0.45 μm的濾膜抽濾3～4次直至完全去除菌體，從而得到超敏蛋白BaPE1原液。

1.3 超敏蛋白BaPE1誘導(dǎo)心葉煙抗PVY作用

該部分包括預(yù)防試驗(yàn)和治療試驗(yàn)兩部分。預(yù)防試驗(yàn)和治療試驗(yàn)均采用半葉枯斑法測(cè)定，都選擇6～7葉期長(zhǎng)勢(shì)一致的心葉煙，打頂后留3～4片葉，置于22～30 ℃溫室內(nèi)自然光照培養(yǎng)1周，這兩部分試驗(yàn)都選擇w=20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑和φ=8%寧南霉素水劑800倍液為對(duì)照藥劑。不同的是，預(yù)防試驗(yàn)是將500倍稀釋處理的超敏蛋白BaPE1和800倍稀釋處理的w=20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑以及φ=8%寧南霉素水劑后采用噴霧法噴施到煙葉半葉，另半葉噴清水處理。于噴施處理24 、48 h后，對(duì)處理過的煙葉進(jìn)行全葉片摩擦接種PVY。而治療效果是先將煙葉進(jìn)行全葉片摩擦接種，保濕24 h、48 h后，分別將經(jīng)過800倍稀釋處理的超敏蛋白BaPE1、w=20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑和φ=8%寧南霉素水劑噴施到接種的煙葉半葉，另外半葉采用清水處理。其他條件一致，每處理3株，每株處理3片葉，重復(fù)3次，之后置于22～30 ℃溫室內(nèi)自然光照培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)并計(jì)算預(yù)防效果和治療效果。

預(yù)防效果=(處理半葉枯斑數(shù)-對(duì)照半葉枯斑數(shù))/對(duì)照半葉枯斑數(shù)×100%。

治療效果=(處理半葉枯斑數(shù)-對(duì)照半葉枯斑數(shù))/對(duì)照半葉枯斑數(shù)×100%。

1.4 超敏蛋白BaPE1對(duì)煙草促生效果

于2015年陜西漢中西鄉(xiāng)縣試驗(yàn)田進(jìn)行，試驗(yàn)分4個(gè)處理(超敏蛋白BaPE1，20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑，8%寧南霉素水劑和CK)，每處理3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)25 m2，大田面積667 m2，栽培行株距為120 cm×50 cm，每個(gè)小區(qū)種植不少于40株。在普通煙NC89的煙草苗床期進(jìn)行噴藥處理，每次噴藥間隔20 d，共噴灑3次，3組處理均稀釋至800倍，快速均勻噴施于煙草莖葉上，各組噴施處理液以葉片上的溶液開始下滴為度。施藥時(shí)，小區(qū)間用塑料膜遮隔，以防小區(qū)間藥劑相互干擾。噴藥后于打頂后期對(duì)普通煙NC89的株高、莖圍、有效葉數(shù)、最大葉長(zhǎng)和葉寬進(jìn)行觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超敏蛋白BaPE1誘導(dǎo)心葉煙抗PVY作用

試驗(yàn)結(jié)果顯示，超敏蛋白BaPE1對(duì)于PVY具有較好的預(yù)防效果和一定的治療效果。相比于兩組藥劑對(duì)照組的抑制率，超敏蛋白對(duì)PVY的預(yù)防和治療效果具有明顯優(yōu)勢(shì)。僅就超敏蛋白對(duì)PVY的預(yù)防效果來看，在接種前24、48 h噴施超敏蛋白BaPE1后的枯斑抑制率分別為53.01%和70.46%，說明越早噴施超敏蛋白BaPE1，對(duì)PVY的預(yù)防效果越好。從治療效果來看，超敏蛋白BaPE1可以有效地控制煙草馬鈴薯Y病毒的擴(kuò)展和危害，防治效果在60%左右。相較于其他藥劑處理組的抑制率，超敏蛋白BaPE1的防治效果要好于藥劑處理組，說明接毒后及時(shí)噴施超敏蛋白BaPE1，仍然能夠提高煙草的抗性(表1、2)。

2.2 超敏蛋白BaPE1對(duì)煙草促生效果

小區(qū)促生調(diào)查結(jié)果顯示(表3)，噴施超敏蛋白BaPE1后，在打頂期煙草的株高、莖圍、最大葉面積均處于最高水平，且從高到低順序?yàn)槌舻鞍譈aPE1>20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑>8%寧南霉素水劑>空白對(duì)照。噴施超敏蛋白BaPE1的植株表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，且葉片寬大、顏色變深，與20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑相比，株高、莖圍、最大葉面積分別提高15.09%、28.17%、9.47%。超敏蛋白BaPE1能夠有效地促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，具有良好的促生效果。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，經(jīng)超敏蛋白BaPE1處理，可以有效控制PVY的擴(kuò)展和對(duì)煙草的危害，誘導(dǎo)煙草對(duì)PVY產(chǎn)生抗性，并能夠在一定程度上對(duì)煙草有促生作用。調(diào)整超敏蛋白的噴施時(shí)間可以將枯斑抑制率從61.30%提高到70.46%，且都要比藥劑對(duì)照組的效果好，說明超敏蛋白能夠顯著提高煙草對(duì)PVY病毒的抗性。究其原因，可能是超敏蛋白BaPE1作為一種蛋白因子，通過激活植物自身免疫系統(tǒng)、生長(zhǎng)系統(tǒng)等，從而達(dá)到提高植物抗性的效果[8-9]。一般藥劑對(duì)煙草抗PVY效果不佳，可能是長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致植物產(chǎn)生的抗藥性從而影響植物對(duì)PVY的抗性[10]。通過研究超敏蛋白對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明相比對(duì)照組，噴施超敏蛋白后的植株普遍表現(xiàn)出莖稈粗壯、葉片肥厚、葉片顏色濃綠，表現(xiàn)出更為旺盛的生長(zhǎng)勢(shì)。對(duì)于噴施超敏蛋白所產(chǎn)生的促生作用，研究學(xué)者認(rèn)為一方面是超敏蛋白作為蛋白因子本身所含有的氨基酸等物質(zhì)直接作為植物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分；另一方面，超敏蛋白作為細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物含有大量鐵、錳、鋅等營(yíng)養(yǎng)元素，能夠促進(jìn)植物合成更多的葉綠素等物質(zhì)從而直接影響植物的蛋白質(zhì)合成以及光合作用等[11-13]。

表1 超敏蛋白BaPE1對(duì)PVY的預(yù)防效果Table 1 Preventing effect of BaPE1 on PVY

注：數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”。同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母分別表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.01、P<0.05水平差異顯著。下同。

Note:Data in the table are “mean±SE”.Different uppercase and lowercase letters in the same column indicate significant differences atP<0.01 andP<0.05 levels by Ducan’s new multiple test, respectively.The same below.

表2 超敏蛋白BaPE1對(duì)PVY的治療效果Table 2 Treatment effect of BaPE1 on PVY

表3 超敏蛋白BaPE1對(duì)煙草農(nóng)藝性狀的影響Table 3 Effect of Harpin BaPE1 on NC-89 agronomic traits

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EffectsofHarpinBaPE1onPVY-resistantofTobacco

WANG Ying1,FU Qiang1,CHEN Yahan1,CHENG Julong2and AN Derong1

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, College of Plant Protection, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.Tobacco Research of Shaanxi Province, Xi’an 710061,China)

In order to study effect of Harpin BaPE1 on induced-resistance on PVY, the half-leaf method and field experiment were selected to detect the anti-PVY activity and growth promoting effects of Harpin BaPE1 onNicotianatabacumvar.‘Samsun NN’ andN.tabacum.The results showed that the Harpin BaPE1 induced the tobacco got induced resistance and growth-promoting. Spraying 500 μg/mL Harpin 48 h before PVY inoculation, the prevention effect was up to 70.46%, and the treatment effect of 24 h,48 h after inoculation were 61.30% and 60.59%, and all the effects were significantly higher than the control. After spraying 500 μg/mL Harpin, the tobacco performed better growth potential in plant height, stem girth and area of maximum leaf, and higher than the other treatments. Therefore the Harpin BaPE1 not only could enhance the tobacco resistance of PVY, but also promote the growth.

Harpin BaPE1； PVY； Resistance； Growth-promoting

2016-09-26

2017-03-23

State Tobacco Monopoly Bureau“Aphidius Gifuensis Prevention and Control of Myzus Persicae Localization Technology Research and Extension”(No.KJ-2014-01).

WANG Ying, female,master student.Research area:plant pathology.E-mail:waktny@163.com

AN Derong,male,professor, Ph.D.Research area: plant pathology.E-mail:anderong323@163.com

S435.72

A

1004-1389(2017)10-1550-04

日期：2017-10-18

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.038.html

2016-09-26

2017-03-23

陜西省煙草專賣局資助項(xiàng)目(KJ-2014-01)。

王 穎，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±怼-mail：waktny@163.com

安德榮，男，教授，從事植物病毒學(xué)研究。E-mail：anderong323@163.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)