程 倩，嵇樂(lè)樂(lè)，韓雪嬌，仲啟迪，辛 江，賈建波

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

瓜蔞皮抗腫瘤活性成分的初步研究

程 倩，嵇樂(lè)樂(lè)，韓雪嬌，仲啟迪，辛 江，賈建波*

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

采用改進(jìn)的MTS法來(lái)探究瓜蔞皮石油醚相不同極性成分對(duì)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用，探討其抗腫瘤活性。利用硅膠柱色譜制備極性不同的五種成分，改進(jìn)的MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖作用，Propidium Iodide染色法分析HCT-116細(xì)胞周期；Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116細(xì)胞凋亡。在低濃度情況下發(fā)現(xiàn)，瓜蔞皮醚相極性成分促進(jìn)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)，成分E誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在S-期而起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用，并且成分C及E抗癌細(xì)胞增殖作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的作用機(jī)制，并以劑量依賴方式誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。通過(guò)硅膠柱色譜制備的石油醚相不同極性成分具有抗腫瘤活性。

瓜蔞皮；硅膠柱色譜；細(xì)胞系；抗腫瘤

0 引言

癌癥目前已經(jīng)成為威脅人類健康的重大疑難疾病之一。由于缺乏有效的治療手段，因癌癥死亡的人數(shù)呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)[1]。而中藥作為天然產(chǎn)物存在著廣泛的生物活性物質(zhì)，因此近年來(lái)國(guó)內(nèi)外抗腫瘤藥物的研究已逐漸轉(zhuǎn)向天然動(dòng)植物，中醫(yī)藥治療腫瘤逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)新途徑[2]。相比于西藥，中藥治療腫瘤具有多個(gè)作用靶點(diǎn)、多種治療效應(yīng)、療效作用持久及不易復(fù)發(fā)等諸多優(yōu)勢(shì)[3]。其中栝樓屬植物抗腫瘤活性研究近幾年越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視。瓜蔞皮的體外抗癌效果較瓜蔞仁強(qiáng)，子殼和脂肪油均無(wú)效，自瓜蔞皮醚浸出液中得到的類白色非晶體性粉末也有體外抗癌作用[4-5]。

瓜蔞皮為葫蘆科植物栝樓或雙邊栝樓的干燥成熟果皮[6]，屬于常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[7]，具有清熱滌痰、寬胸散結(jié)、潤(rùn)燥滑腸等功效，用于治療痰濁黃稠、肺熱咳嗽、結(jié)胸痞滿、胸痹心痛、乳癰、常癰腫痛、肺癰、大便秘結(jié)等癥狀[8]。現(xiàn)代藥理研究表明，瓜蔞皮的藥理作用主要包括對(duì)心臟、血管的保護(hù)作用[9]，抗血小板聚集的作用，降低血清膽固醇、血糖的作用[10]，促進(jìn)免疫的作用，抗菌抗炎作用，抗腫瘤[11]的作用等。

為指導(dǎo)正確使用瓜蔞皮對(duì)腫瘤的治療，對(duì)瓜蔞皮的抗腫瘤作用做了初步研究。前期研究表明瓜蔞皮石油醚相具有抗腫瘤作用，本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法評(píng)價(jià)抗癌活性，選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為評(píng)價(jià)模型，通過(guò)MTS法[12]測(cè)定細(xì)胞活力、探索瓜蔞皮的抗癌活性，及瓜蔞皮活性成分與抗癌之間的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1實(shí)驗(yàn)原料與試劑

瓜蔞皮，購(gòu)于江蘇淮安盱眙當(dāng)?shù)兀?0～55℃下烘干至質(zhì)量恒定后粉碎過(guò)篩備用；結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，來(lái)源于ATCC細(xì)胞庫(kù)；McCoy’s 5A培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于上海中喬新舟生物科技公司；致死牛血清蛋白FBS，購(gòu)于上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司；200 ×青霉素-鏈霉素溶液，購(gòu)于上海千曦生物科技有限公司；細(xì)胞增殖分析試劑盒，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，Propidium Iodide (PI)，RNase，購(gòu)于上海吉滿生物科技有限公司；甲醇等試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

DJ-10A傾倒式破碎機(jī)，上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；B-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JY88-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；WH-3微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器公司；200～300目硅膠，青島海洋化工有限公司；FACScan流式細(xì)胞儀，上海曙誠(chéng)醫(yī)療科技發(fā)展有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方案

2.1瓜蔞皮石油醚相不同極性成分制備

準(zhǔn)確稱取藥材0.5 kg，粉碎，過(guò)60目篩，用10倍體積的80%乙醇超聲破碎提取三次，將提取液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得瓜蔞皮浸膏103.47 g，溶于5倍體積的去離子水中，用等體積的石油醚萃取三次，收集石油醚相，減壓濃縮得到石油醚相浸膏18.29 g。用少量石油醚溶解后上硅膠柱色譜，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯=10:1，石油醚-乙酸乙酯=5:1，石油醚-乙酸乙酯=1:1，乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，得五種不同極性成分A、B、C、D、E。

2.2癌細(xì)胞的培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 分別用McCoy’s 5A和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中均補(bǔ)加有10% FBS和50 units/mL的青霉素-鏈霉素混合液，細(xì)胞培育均在由5% CO2和95%空氣組成的潮濕空氣中，溫度控制在37℃。

2.3用改進(jìn)的MTS法進(jìn)行細(xì)胞增殖分析

細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，24 h后，用含有不同濃度DMSO培養(yǎng)液更換培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，DMSO最終含量為0.5%。用0.5% DMSO作為空白對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，參照廠家說(shuō)明書，用MTS試劑盒評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖，暴露處理結(jié)束后，在每一培養(yǎng)孔中用含有20 μL MTS 試劑的100 μL新鮮培養(yǎng)基替換，并放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，從每孔中取60 μL轉(zhuǎn)移至96孔ELSA板，于490 nm波長(zhǎng)下記錄其吸光度。結(jié)果用相對(duì)空白對(duì)照的百分比計(jì) (僅含0.5% DMSO的空白對(duì)照記為100%)。

2.4 Propidium Iodide染色法分析HCT-116細(xì)胞周期

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)瓜蔞皮不同極性成分A→E對(duì)抗癌潛力的影響，用不同濃度的成分A和E處理HCT-116細(xì)胞系。細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，48 h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別含有不同濃度的成分A和E，再培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞，用80%乙醇在蝸旋下溫和固定，置于冰柜中2 h，于冰浴上用0.25% Triton X-100 處理5 min，細(xì)胞懸浮于含有40 μg/mL PI和0.1 mg/mL RNase的300 μL PBS中，室溫下暗室培養(yǎng)20 min，用FACScan流式細(xì)胞儀分析測(cè)試細(xì)胞周期，并用FlowJo 10.0.4軟件 (Tree Star, Ashland, OR)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)每一次測(cè)量，至少計(jì)數(shù)20000個(gè)細(xì)胞。

2.5 Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116細(xì)胞凋亡

細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1天后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有不同濃度的A、C、E，培養(yǎng)48 h后收集懸浮細(xì)胞及粘壁細(xì)胞(用0.25%胰酶脫附后)，加入含有FBS培養(yǎng)基使胰酶失活，輕輕吹散后，在1500 r/min下離心5 min，吸除上清液，根據(jù)廠家說(shuō)明用Annexin V-FITC 和PI試劑盒染色處理細(xì)胞。用未加藥處理的細(xì)胞雙染后作為空白對(duì)照。染色后，立即用FACScan流式細(xì)胞分析，每次測(cè)量中，至少計(jì)數(shù)20000個(gè)細(xì)胞。

3 結(jié)果

3.1五種不同極性成分對(duì)HCT-116及MCF-7的抗增殖作用

分析瓜蔞皮石油醚相五種不同極性成分對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響，結(jié)果如圖1所示。

20 μg/mL濃度處理48 h，成分A抑制了8.1%的HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)，而成分E抑制了83.8%的細(xì)胞生長(zhǎng)，其它成分抗增殖潛力介于A和E之間。 瓜蔞皮石油醚相不同極性成分對(duì)MCF-7細(xì)胞的敏感性比HCT-116低。在100 μg/mL濃度下，成分A抑制了20.5% MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)，而成分B、C、D、E分別抑制30.1%、55.4%、65.5%、87.6%。在低濃度情況下發(fā)現(xiàn)，瓜蔞皮醚相極性成分反而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)。而成分E對(duì)HCT-116及MCF-7細(xì)胞的IC50濃度分別為5 μg/mL與30 μg/mL。

圖1 不同極性成分對(duì)HCT-116及MCF-7癌細(xì)胞的濃度依賴的抗增殖作用

此外，還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間也影響醚相不同極性成分的抗癌細(xì)胞增殖效力。取10 μg/mL的五種極性成分分別處理HCT-116和MCF-7細(xì)胞24、48、72 h，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)成分E對(duì)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)分別抑制了57%、61%、80%，對(duì)MCF-7細(xì)胞也有類似抑制效果并且以時(shí)間依賴方式抑制癌細(xì)胞增殖。此外，成分E對(duì)兩株癌細(xì)胞均呈現(xiàn)出最強(qiáng)抑制作用，這些結(jié)果顯示瓜蔞皮石油醚相經(jīng)乙酸乙酯洗脫的成分E能夠顯著地增強(qiáng)其抗癌潛能。

圖2 不同極性成分對(duì)HCT-116及MCF-7癌細(xì)胞的時(shí)間依賴的抗增殖作用

3.2成分A和E對(duì)HCT-116細(xì)胞周期的影響

為了探討瓜蔞皮醚相經(jīng)硅膠柱不同極性溶劑洗脫的成分抑制HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在作用機(jī)制，運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析了細(xì)胞周期的輪廓，如圖3所示(三行圖依次為對(duì)照、A、E)。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，相比較于對(duì)照，成分A未明顯改變細(xì)胞周期分布輪廓，而觀察到成分 E顯著改變細(xì)胞周期分布輪廓。在成分E濃度為1 μg/mL與2.5 μg/mL處理下不能改變細(xì)胞周期分布輪廓，但隨著濃度增大，細(xì)胞周期分布輪廓明顯被改變了。相較于對(duì)照(57.1% 細(xì)胞處于G-期、25.3%細(xì)胞處于S-期、19.9% 細(xì)胞處于G2/M-期)，10 μg/mL成分E處理48 h后G1-、S-、G2/M-期細(xì)胞百分比分別為33.1%、46.0%、15.6%；20 μg/mL成分E處理48 h后G1-、S-、G2/M-期細(xì)胞百分比分別為25.4%、52.1%、21.7%。結(jié)果顯示：成分E顯著誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在S-期而起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用。

圖3 不同濃度A及E對(duì) HCT-116細(xì)胞周期的影響

圖4 不同濃度A、C、E對(duì) HCT-116細(xì)胞凋亡作用的影響

3.3成分A、C及E對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡作用的影響

細(xì)胞增殖分析結(jié)果顯示不同極性成分抑制癌細(xì)胞增殖能力與處理細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步探究不同極性成分的作用機(jī)制，進(jìn)行了細(xì)胞凋亡分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示(三行圖依次為A、C、E)。相較于對(duì)照 (早期凋亡細(xì)胞為4.7%～5.6%，晚期凋亡細(xì)胞為2.2%～3.6%)，用濃度5 μg/mL及10 μg/mL處理48 h后，成分A未增加早期和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)，而成分C溫和地增加了早期凋亡細(xì)胞至17.6%，成分E快速增加了早期細(xì)胞凋亡至48.1%。同樣地，也觀測(cè)到成分C及E顯著增加了晚期凋亡。 結(jié)果表明成分C及E抗癌細(xì)胞增殖作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的作用機(jī)制，并以劑量依賴方式誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。進(jìn)而，也顯示了凋亡誘導(dǎo)潛力與成分極性相關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

本文較為系統(tǒng)地研究了通過(guò)硅膠柱色譜制備的瓜蔞皮石油醚相五種不同極性成分對(duì)結(jié)腸癌HCT-116和乳腺癌MCF-7細(xì)胞系的抗癌活性，得出以下結(jié)論：

在細(xì)胞抗增殖作用實(shí)驗(yàn)中，五種成分對(duì)HCT-116 及MCF-7細(xì)胞有著明顯的抗增殖作用且以時(shí)間依賴方式抑制癌細(xì)胞增殖，其中成分E對(duì)HCT-116及MCF-7細(xì)胞的IC50濃度分別為5 μg/mL與30 μg/mL，并且發(fā)現(xiàn)低濃度的成分A反而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)；利用Propidium Iodide 染色法分析HCT-116細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中，其中成分E能夠顯著的誘導(dǎo)癌細(xì)胞停滯在S-期從而起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用；而Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，成分C及E的抗癌細(xì)胞增殖作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的作用機(jī)制，并以劑量依賴方式誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。進(jìn)而，也顯示了凋亡誘導(dǎo)潛力與成分對(duì)細(xì)胞處理時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)聯(lián)，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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APreliminaryStudyontheAntitumorConstituentsofPericarpiumTrichosanthis

CHENG Qian, JI Le-le, HAN Xue-jiao, ZHONG Qi-di, XIN Jiang, JIA Jian-bo*

(Faculty of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Techonology, Huai'an Jiangsu 223003, China)

Improved MTS method was used to explore the inhibitory effect of different polar components in human colon cancer HCT-116 cells and breast cancer MCF-7 cell proliferation gualoupi petroleum ether, and its antitumor activity was explored. Using silica gel column chromatography to prepare five different components with different polarity, the proliferation of MTS cells was detected. The improved method Propidium Iodide staining was used for the analysis of HCT-116 cell cycle. Analysis of apoptosis of HCT-116 cells was by Annexin V-FITC/Propidium Iodide staining. In the case of low concentration, gualoupi ether polar components promote the growth of MCF-7 cells. E components induce the cell cycle in S- phase to inhibit the proliferation of cancer cells; E cancer cell proliferation is through the mechanism of inducing apoptosis mediated, and inducing apoptosis in a dose dependent manner. The petroleum ether phase with different polar components prepared by silica gel column chromatography has antitumor activity.

Trichosanthes; silica gel column chromatography; cell line; antitumor

TQ461

A

1009-7961(2017)05-0036-05

2017-06-19

江蘇省研究生創(chuàng)新計(jì)劃基金項(xiàng)目(HGYK201603)

程倩(1989-)，女，江蘇宿遷人，在讀碩士，主要從事生物化工研究。*為通訊作者。

(責(zé)任編輯：鄭 菲)