魏云曉 李 菲 張淑江 章時蕃 張 慧 孫日飛

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)試驗室，北京 100081）

菜薹（菜心）—芥藍(lán)雜交親和性分析及后代性狀表現(xiàn)

魏云曉 李 菲 張淑江 章時蕃 張 慧 孫日飛*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)試驗室，北京 100081）

種間雜交是拓寬遺傳種質(zhì)資源，創(chuàng)造新物種、新材料的重要手段；雜交親和性及適宜的授粉方法是成功配制雜交組合的重要因素。本試驗采用4種授粉方式對菜薹（菜心）和芥藍(lán)進(jìn)行種間雜交，利用苯胺藍(lán)染色法觀察花粉管生長狀況，通過胚挽救幼苗獲得率分析種間雜交親和性，篩選雜交親本，并對后代進(jìn)行倍性鑒定、形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)分析。結(jié)果表明：蕾期授粉4次有助于獲得雜種幼苗，菜心材料755適宜作雜交母本；花粉管生長狀況與胚挽救幼苗獲得率之間的相關(guān)性達(dá)極顯著水平，利用苯胺藍(lán)染色法可以輔助預(yù)測種間雜交親和性。田間調(diào)查結(jié)果表明，雜種后代株型偏母本，營養(yǎng)生長旺盛，是培育新型菜用甘藍(lán)型油菜的中間材料。

菜薹（菜心）；芥藍(lán)；種間雜交；親和性；熒光顯微法

菜薹（菜心）〔Brassica rapa L. ssp. chinensis（L. ） var. utilis Tsen et Lee，AA，2n=20〕是十字花科蕓薹屬白菜亞種中以花薹為產(chǎn)品的變種，營養(yǎng)豐富。菜心主要由白菜類蔬菜中易抽薹類型材料長期選育而成，導(dǎo)致其遺傳資源背景狹窄，且推廣品種在抗逆性和品質(zhì)方面不能滿足市場需求（張華和劉自珠，2010；張艷 等，2012；晏儒來，2014）。芥藍(lán)（Brassica oleracea var. alboglabra，CC，2n=18）屬于蕓薹屬甘藍(lán)種，以花薹為產(chǎn)品，風(fēng)味獨(dú)特。芥藍(lán)栽培品種主要為地方常規(guī)品種，因此存在產(chǎn)量低、品質(zhì)差等問題（秦耀國 等，2009；吳文林 等，2012；晏儒來，2014）。

遠(yuǎn)緣雜交可以綜合親本優(yōu)勢或創(chuàng)造新的雜種優(yōu)勢，促進(jìn)基因間交流和新物種的形成；利用種間雜交可以豐富物種的遺傳背景，培育含有理想農(nóng)藝性狀的栽培類型，是遺傳改良的重要途徑（林超 等，2007）。梁紅等（1994）采用菜心與甘藍(lán)進(jìn)行正反交，雜交后代的一般性狀介于兩親本之間，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的生長優(yōu)勢，蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量等超親，雜交優(yōu)勢顯著。Snowdon等（2000）通過白芥與甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交，將抗黑脛病基因從白芥轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜上。于海龍等（2015）通過芥藍(lán)與甘藍(lán)型油菜雜交，創(chuàng)制了Ogura細(xì)胞質(zhì)不育材料。前人通過遠(yuǎn)緣雜交獲得雜種后代，轉(zhuǎn)育有利基因，創(chuàng)造新的作物類型（梁紅 等，1994；滿紅，2007；Sheng et al.，2008；孔芳，2010；喬海云 等，2012；陰濤 等，2014）。但是鮮有關(guān)于多個品種菜心與芥藍(lán)雜交的研究報道。

本試驗采用二倍體菜心與二倍體芥藍(lán)雜交，通過苯胺藍(lán)染色法與胚挽救幼苗獲得率對種間雜交親和性進(jìn)行分析，篩選親和性較高的材料，為種間雜交組合配制提供理論基礎(chǔ)；雜種后代的獲得豐富了育種資源，可以為菜心育種、芥藍(lán)育種及菜用甘藍(lán)型油菜的選育提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試3份菜心材料的編號為755、756、758，3份芥藍(lán)材料的編號為719、722、723。其中，755、756為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組多年選育材料；其余均為品種，亦由本所白菜課題組提供（表1）。

表1 參試材料來源及其主要特征特性

1.2 試驗方法

1.2.1 種間雜交 各試驗材料均于2015年1月21日播種，3月6日定植于本所實(shí)驗基地塑料大棚內(nèi)，植株現(xiàn)蕾后7 d開始授粉。以菜心為母本、以 芥 藍(lán) 為 父 本， 配 制 755×719、755×722、755×723、756×719、756×722、756×723、758×719、758×722、755×723等9個雜交組合，每個組合采用4種授粉方式授粉，共36個處理。① 蕾期授粉1次：晴夭上午，選擇還有2～3 d開花的健壯花蕾，去雄后授以芥藍(lán)花粉；② 蕾期授粉4次：上午、下午各授粉1次，連續(xù)授粉2 d；③ 延遲授粉1次：晴夭上午，選擇還有2～3 d開花的健壯花蕾，去雄后48 h授以芥藍(lán)花粉；④ 延遲授粉4次：上午、下午各授粉1次，連續(xù)授粉2 d。

1.2.2 苯胺藍(lán)染色法觀察花粉管 分別取各處理授粉后24 h的雌蕊20個。固定：立即浸泡在FAA固定液中（無水乙醇∶乙酸=3V∶1V）24 h，雌蕊綠色褪去變?yōu)榘咨?；軟化：依次放?0%、50%、30%酒精中洗滌10 min，然后浸泡到16 mol·L-1NaOH溶液中，室溫處理12 h，雌蕊接近透明狀態(tài)；染色：放入0.108 mol·L-1K3PO4溶液中洗滌10 min，然后浸泡到0.1%苯胺藍(lán)染色液（用0.108 mol·L-1K3PO4配置，pH≈11）中，黑暗處理12 h；觀察：將雌蕊放到載玻片上，滴加甘油調(diào)節(jié)花粉管的分散程度，先用立體顯微鏡觀察雌蕊柱頭有無熒光并計數(shù)，蓋上蓋玻片后觀察花粉管生長狀況（Mori et al.，2006；Chae et al.，2009）。利用 SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 胚挽救 分別取各處理授粉后10～12 d的子房，首先用75%的乙醇消毒1 min，然后用8%的次氯酸鈉滅菌15 min，最后用無菌水沖洗3次。用鑷子剝?nèi)∽臃恐械呐咧?，接種到B5培養(yǎng)基上。接種胚珠在溫度（25±2）℃、光照10 h·d-1、光照強(qiáng)度2 000 lx條件下培養(yǎng)30～50 d。成活胚珠的幼苗經(jīng)分化和生根后定植于玻璃溫室，常規(guī)管理（喬海云，2012）。計算胚挽救幼苗獲得率，利用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.4 種間雜種鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：觀察、記錄F1植株營養(yǎng)生長與生殖生長階段的形態(tài)學(xué)變化。

倍性鑒定：2016年8月2日，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析。取F1植株及親本新鮮幼嫩葉片30～40 mg，加入2 mL預(yù)冷的Galbraith緩沖液〔45 mmol·L-1MgCl2，30 mmol·L-1檸檬酸鈉，20 mmol·L-1MOPS，0.1% TritonX（m/V），pH=7〕，用鋒利的刀片快速切碎，經(jīng)30 μm孔徑的尼龍膜過濾至2.5 mL離心管中，2 000 rpm離心3 min，倒掉上清液，向離心管中加入500 μL PI染液。振蕩混勻，15 min后取細(xì)胞懸浮液用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析（饒琳莉，2015）。

花粉育性檢測：2016年8月8日上午9：00～10：00，取F1完全開放的新鮮花朵，在載玻片上滴1滴1%的醋酸洋紅染液，使花粉粒游離在染色液中，染色5 min后蓋上蓋玻片鏡檢。每朵花選取500個花粉粒作為觀察對象，統(tǒng)計花粉染色成功率（Li et al.，2015）。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用苯胺藍(lán)染色法觀察花粉管生長狀況

由圖1及表2、3、4可知，菜心材料755、756、758的柱頭花粉萌發(fā)能力有顯著差異，柱頭有熒光的雌蕊平均數(shù)分別為13.50、11.67、11.42個，可觀察到花粉管的雌蕊平均數(shù)分別為3.12、2.42、1.25個，表明菜心材料755雜交親和性較高。以芥藍(lán)材料719、722、723為父本，雜交母本柱頭有熒光的雌蕊平均數(shù)分別為12.75、11.80、12.00個，可觀察到花粉管的雌蕊平均數(shù)分別為3.00、2.25、1.75個，表明芥藍(lán)材料719適宜做雜交父本。蕾期授粉1次、蕾期授粉4次、延遲授粉1次、延遲授粉4次處理柱頭有熒光的雌蕊平均數(shù)分別為12.00、13.67、11.33、11.78個，可觀察到花粉管的雌蕊平均數(shù)分別為3.56、2.44、2.00、1.44個，表明蕾期授粉效果比延遲授粉好，授粉次數(shù)之間的差異不明顯。

差異顯著性分析結(jié)果表明（表3、4），蕾期授粉4次與其他授粉方式間柱頭有熒光雌蕊數(shù)、可觀察到花粉管雌蕊數(shù)差異均達(dá)顯著水平，其他3種授粉方式之間差異不顯著。菜心材料755與756、758之間柱頭有熒光雌蕊數(shù)、可觀察到花粉管雌蕊數(shù)差異均達(dá)顯著水平，而芥藍(lán)材料719、722、723之間無顯著差異。表明蕾期授粉4次及母本材料差異對雜交親和性有顯著影響。

圖1 苯胺藍(lán)染色后花粉管生長狀況

表2 不同授粉方式對菜心和芥藍(lán)雜交親和性的影響

2.2 不同處理胚挽救幼苗獲得率

由表2可知，本試驗共獲得胚挽救的幼胚總數(shù)為1 238個，成功獲得幼苗234株。菜心材料755、756、758胚挽救幼苗獲得率不一致，平均值分別為29%、18%、6%，與苯胺藍(lán)染色法的觀察結(jié)果一致，表明菜心材料755適宜做雜交母本。以芥藍(lán)材料719、722、723為父本，胚挽救幼苗獲得率的平均值分別為24%、18%、22%，表明芥藍(lán)材料719適宜做雜交父本。蕾期授粉1次、蕾期授粉4次、延遲授粉1次、延遲授粉4次處理的胚挽救幼苗獲得率平均值分別為12%、31%、11%、18%，表明蕾期授粉效果比延遲授粉好，授粉4次的效果比授粉1次的效果好。

差異顯著性分析結(jié)果表明（表3、4），蕾期授粉4次與其他授粉方式間的胚挽救幼苗獲得率有顯著差異，其他3種授粉方式之間無顯著差異。菜心材料755與758之間的胚挽救獲得率有顯著差異，而芥藍(lán)材料719、722、723之間差異不顯著。表明蕾期授粉4次及母本材料差異對雜交親和性有顯著影響。

表3 4種授粉方式的差異顯著性分析

表4 不同親本的差異顯著性分析

利用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行胚挽救幼苗獲得率與柱頭有熒光雌蕊數(shù)和可觀察到花粉管雌蕊數(shù)的相關(guān)性分析。三者之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），胚挽救幼苗獲得率與可觀察到花粉管雌蕊數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)R2=0.814，表明胚挽救概率及熒光顯微法預(yù)測雜交親和性可得到一致的結(jié)論。

2.3 雜種后代表現(xiàn)

2.3.1 形態(tài)學(xué)表現(xiàn) F1植株（異源單倍體）各性狀介于親本之間，莖稈有微量蠟粉，下部葉片裂葉明顯，側(cè)枝較主枝葉片顏色深、莖稈蠟粉少，與親本芥藍(lán)一樣開白花（圖2）。母本相同、父本不同雜交所得F1植株形態(tài)相似，抽薹高度相似；父本相同、母本不同雜交所得F1植株形態(tài)差異較大，以755作母本的F1葉片較小，主薹高于葉片，株型與755相似；以756、758作母本的F1則葉片較大，主薹與葉片高度齊平，株型與母本相似，表明雜種后代植株形態(tài)有明顯的母本偏向性；且雜種后代分枝多，生長勢均比親本強(qiáng)，與王國槐等（2003）、崔彬彬和李云（2006）、趙琴（2015）的研究結(jié)果一致。

2.3.2 倍性鑒定 由圖3可見，親本菜心的熒光強(qiáng)度高峰位于190，芥藍(lán)的熒光強(qiáng)度高峰位于245；異源單倍體的熒光強(qiáng)度高峰位于220，為親本的平均值；異源二倍體熒光強(qiáng)度高峰位于435，為單倍體的二倍。經(jīng)驗證，234個雜種后代中有3株自然加倍為異源二倍體，其他雜種均為異源單倍體。

2.3.3 育性檢測 花粉育性檢測結(jié)果顯示，異源單倍體花粉呈現(xiàn)兩種情況，一種是雜種花粉表現(xiàn)為完全不育，可染率為0；一種是雜種花粉表現(xiàn)為少量花粉，可染率為41.21%。異源二倍體的花粉活性較好，花粉可染率為96.00%（圖4）。

圖2 菜心和芥藍(lán)雜交F1植株（異源單倍體）形態(tài)特征

圖3 菜心、芥藍(lán)及典型后代流式細(xì)胞圖

圖4 菜心和芥藍(lán)雜交F1的成熟花粉粒

3 結(jié)論與討論

前人采用胚挽救幼苗獲得率分析物種之間的親和性（喬海云 等，2012；何麗 等，2013；文雁成等，2014）；利用苯胺藍(lán)染色法觀察花粉管生長狀況來預(yù)測雜交親和性（馬豐山 等，1986；王愛云 等，2006； 張 瀟 等，2015；Katarzyna et al.，2015）。本試驗同時采用這兩種方法分析菜心和芥藍(lán)種間雜交親和性，結(jié)果表明胚挽救幼苗獲得率與可觀察到花粉管的概率和柱頭熒光概率相關(guān)性極顯著。花粉在柱頭上萌發(fā)，柱頭顯示熒光，由于柱頭乳突細(xì)胞和花粉識別過程中產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)引發(fā)親和性障礙，花粉管形成胼胝質(zhì)塞或者乳突細(xì)胞胼胝質(zhì)反應(yīng)阻礙，所以只有少數(shù)萌發(fā)的花粉穿過乳突細(xì)胞，完成受精。說明可觀察到花粉管的概率和柱頭熒光概率可以準(zhǔn)確預(yù)測雜交親和性。本試驗中不同組合雜交親和性存在差異，差異顯著性分析結(jié)果表明乳突細(xì)胞和花粉識別與雜交材料密切相關(guān)。菜心材料755與芥藍(lán)雜交親和性高，適宜作雜交親本；而758柱頭花粉不易萌發(fā)，表明不親和，不適宜用作雜交親本。

吳俊等（1999）認(rèn)為不親和反應(yīng)抑制因素在剛開花前出現(xiàn)，所以蕾期授粉可以提高受精率。王靜（2008）提出延遲授粉會增加遠(yuǎn)緣雜交的受精率。此外，用異源花粉多次授粉可消耗柱頭上的識別蛋白（林超 等，2007）。本試驗采用4種授粉方式所得結(jié)果與前人結(jié)論一致：多次授粉效果比1次授粉好；蕾期授粉效果比延遲授粉好。預(yù)測存在某一時刻抑制因素最少，異源花粉最易進(jìn)入與胚珠結(jié)合，可以進(jìn)一步設(shè)置更多的授粉時間段來確定最佳授粉時間。差異顯著性分析表明蕾期重復(fù)授粉效果最好，與其他授粉方式間差異達(dá)顯著水平。

盧長明（1998）以白花芥藍(lán)與黃花白菜雜交，后代開白花，說明在人工甘藍(lán)型油菜基因組中白花基因?qū)S花為顯性或具上位性。本試驗以黃花菜心與白花芥藍(lán)雜交，獲得的雜交后代均開白花，與前人的研究結(jié)果一致。本試驗所得異源單倍體及異源二倍體基部葉片均表現(xiàn)裂葉明顯，裂葉性狀在親本中都無表現(xiàn)，推測是由于雜種后代兩套基因組AA和CC相互作用存在差異的結(jié)果（劉愛華 等，2003；饒琳莉，2015；Li et al.，2015）。此外，調(diào)查發(fā)現(xiàn)同一雜交組合后代花粉的可染率不一致，大部分表現(xiàn)為完全不育，少部分表現(xiàn)為少量花粉，與小麥遠(yuǎn)緣雜交中的現(xiàn)象類似，單倍體AC中可能也存在未減數(shù)配子基因，形成具有活力的配子（羅江陶，2015）。胚挽救獲得3株自然加倍異源二倍體，通過回交、自交等手段可應(yīng)用于異附加系等細(xì)胞學(xué)研究。雜種后代田間表現(xiàn)生長旺盛，分枝能力強(qiáng)，可進(jìn)一步研究F1、F2等后代及親本蛋白質(zhì)、碳水化合物、硫苷等物質(zhì)變化，分析后代作為培育菜用甘藍(lán)型油菜材料的應(yīng)用價值。

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Analysis on Interspecif i c Hybridization Compatibility and Progeny Characteristics of Flowering Chinese Cabbage and Chinese Kale

WEI Yun-xiao，LI Fei，ZHANG Shu-jiang，ZHANG Shi-fan，ZHANG Hui，S UN Ri-fei*

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）

The interspecific hybridization is an important method for creating new species and enriching genetic germplasm resource．The hybridization compatibility and suitable pollination method are critical factors for successfully preparing hybrid combinations．This experiment adopted 4 pollination methods to conduct interspeicific crossing between flowering Chinese cabbage〔Brassica rapa L. ssp. chinensis（L.）var. utilis Tsen et Lee〕and Chinese kale（Brassica oleracea var. alboglabra），observed the situation of pollen tube growth with anilin blue staining method，analyzed the interspecific hybridization affinity by rate of embryo rescue，selected hybrid parents，and conducted ploidy identification，orphological and cytological analysis on the progeny．The results showed that multiple pollination in bud stage was helpful to obtain hybrid seedlings and material 755 is suitable for being female parent in hybridization．Besides，the status of pollen tube growth and hybrid rate by embryo rescue had extreme significant correlation，and anilin blue staining method could assist forecasting the hybridization compatibility．Moreover，the results of field investigation indicated that the plant type of hybrid progeny was partial as female parent with vigorous growth．This hybrid progeny was good intermediate material for breeding vegetable Brassica napus L. of new type．

Chinese cabbage；Chinese kale；Interspecific hybridization；Compatibility ；Fluorescence microscopy

魏云曉，女，博士研究生，專業(yè)方向：白菜遺傳育種，E-mail：yuluoyunxiao@126.com

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（Corresponding author）：孫日飛，男，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：白菜遺傳育種，E-mail：sunrifei@caas.cn

2017-07-13；接受日期：2017-09-11

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2016YFD0101701）