張 平，萬鷹昕*，李 楠

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用對肺癌細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)分析

張 平，萬鷹昕*，李 楠

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

目的：觀察亞硒酸鈉與白藜蘆醇單獨及聯(lián)合應(yīng)用對肺癌細(xì)胞的影響，并通過細(xì)胞周期探討其作用機(jī)理。方法：用四甲基偶氮唑鹽法檢測亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨及聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞增殖和存活的影響；用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期。結(jié)果：亞硒酸鈉和白藜蘆醇對肺癌細(xì)胞A549均有拮抗作用，且隨濃度的增加，拮抗效果越顯著，當(dāng)亞硒酸鈉濃度大于等于5 μmol/L時，拮抗效果極顯著（P＜0.01）；當(dāng)白藜蘆醇濃度大于等于65 μmol/L時，拮抗效果極顯著（P＜0.01）。亞硒酸鈉對A549細(xì)胞的半致死率（lethal dose of 50%，LD50）為4.759 μmol/L，白藜蘆醇對A549細(xì)胞的LD50為45.24 μmol/L。然而亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合用藥作用于A549細(xì)胞的拮抗效果優(yōu)于單獨用藥，且低劑量的亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合就能發(fā)揮出高劑量亞硒酸鈉對A549細(xì)胞的拮抗作用效果，有效地降低了亞硒酸鈉對細(xì)胞的毒副作用。另外，亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇作用可以阻滯A549細(xì)胞G0/G1期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

亞硒酸鈉；白藜蘆醇；肺癌細(xì)胞A549；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

肺癌細(xì)胞是常見的導(dǎo)致死亡率最高的惡性腫瘤細(xì)胞之一，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩種，而占死亡率80%以上的肺癌細(xì)胞是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，即A549細(xì)胞[1]。19世紀(jì)中期Schwarz等[2]從面包酵母中分離出了一種能阻止肝細(xì)胞死亡的生物活性物質(zhì)，通過研究證實是硒元素，自此人們從另外一個角度認(rèn)識了硒元素。通過細(xì)胞和動物研究可以發(fā)現(xiàn)硒對肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等均有一定的抑制效果[3-6]。硒的抗癌作用機(jī)制比較復(fù)雜，它是癌基因和抑癌基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，對癌細(xì)胞具有促分化、抑分裂、誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序性死亡的作用，明顯影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)。硒元素在生物體內(nèi)以硒結(jié)合蛋白的形式存在。近年的研究證實，亞硒酸鈉不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，而且還能誘導(dǎo)其凋亡，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系[7]。但其有效作用范圍窄，高劑量有毒副作用。

白藜蘆醇是一種普遍存在于自然界的植物次級代謝物，通過近年的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對機(jī)體無毒副作用，另外，白藜蘆醇在抗腫瘤[8-9]、心血管疾病治療[10-12]、抗氧化、抗自由基[13-15]、保肝、影響骨代謝以及調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、抗變態(tài)反應(yīng)、輻射保護(hù)、預(yù)防急性傳染性非典型肺炎等方面有藥理作用。但白藜蘆醇成本高，且對癌細(xì)胞的作用相對于亞硒酸鈉效果不明顯[16-17]。為減輕硒作用于癌細(xì)胞時的毒副作用，本實驗探究亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用對A549細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A549細(xì)胞購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

胎牛血清、胰蛋白酶（含與不含乙二胺四乙酸）、DMEM/F12培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、細(xì)胞周期試劑盒、細(xì)胞凋亡分析試劑盒 美國Genview公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；超凈工作臺 北京百劍空氣凈化設(shè)備廠；TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；BS110S型電子天平 美國Sartorius公司；恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司；血球計數(shù)板（計數(shù)器） 北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司；GI 54 DWS自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；液氮生物容器 四川樂山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

把細(xì)胞從液氮生物容器中取出，通過細(xì)胞復(fù)蘇進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在進(jìn)行傳代過程中，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）緩慢沖洗1～3 次，避免吹起細(xì)胞，用胰蛋白酶酶解細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，底壁上約80%細(xì)胞呈現(xiàn)圓粒狀、細(xì)胞間連接將要分離時，迅速吸掉胰蛋白酶溶液，避免胰蛋白酶處理過度。然后向直徑100 mm、高20 mm的圓形培養(yǎng)皿內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液4 mL，小心吹起皿底的細(xì)胞，盡量避免產(chǎn)生氣泡（若有大的氣泡，則吸除），保證皿底的所有細(xì)胞都吹下來，使其懸浮培養(yǎng)液中，再分裝。

1.3.2 實驗分組

實驗組分為亞硒酸鈉組、白藜蘆醇組、亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合用藥組。亞硒酸鈉濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L；白藜蘆醇濃度為5、25、45、65、85、105、125 μmol/L?？瞻讓φ战M不含A549細(xì)胞，對照組含A549細(xì)胞和無血清培養(yǎng)基。在532 nm波長處測定實驗組、對照組和空白對照組OD值，按下式計算各實驗組作用后A549細(xì)胞的存活率。

1.3.3 四甲基偶氮唑鹽法檢測細(xì)胞活性

培養(yǎng)皿中取出處于對數(shù)期的A549細(xì)胞，在96 孔板中鋪板。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后按照實驗分組所設(shè)置好的藥物濃度配制并依次加入96 孔板中，處理24 h，吸除廢液，添加100 μL 5 mg/mL四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液處理4 h，然后每孔加入100 μL DMSO處理10 min，最后用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞懸液OD值。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

用對數(shù)期的細(xì)胞配制成密度為3×105個/mL的細(xì)胞懸液，再于6 孔板中按1 mL/孔添加混勻的細(xì)胞懸液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加藥，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期試劑盒進(jìn)行處理，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞周期。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨用藥對A549細(xì)胞存活率的影響

2.1.1 亞硒酸鈉

亞硒酸鈉是最普遍最廣泛的硒強(qiáng)化劑，在抗癌方面也有一定的功能。由圖1可知，A549細(xì)胞的存活率與亞硒酸鈉濃度有關(guān)，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，肺癌細(xì)胞的存活率先升高再逐漸降低，且當(dāng)實驗組亞硒酸鈉濃度大于等于5.0 μmol/L時，細(xì)胞存活率與對照組差異極顯著（P＜0.01）。亞硒酸鈉對A549細(xì)胞的半致死率（lethal dose of 50%，LD50）為4.759 μmol/L。

圖1 亞硒酸鈉對A549細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effect of sodium selenite on survival rate of A549 cells

2.1.2 白藜蘆醇

圖2 白藜蘆醇對A549細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of resveratrol on survival rate of A549 cells

白藜蘆醇是植物為了對抗外界刺激如紫外線、機(jī)械損傷而產(chǎn)生的一種植物抗毒素，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有廣泛的生物活性，在抗癌方面具有一定的療效且無毒副作用[10]。由圖2可知，肺癌細(xì)胞的存活率與白藜蘆醇濃度有關(guān)，隨著白藜蘆醇濃度的升高，A549細(xì)胞的存活率先升高再逐漸降低，當(dāng)白藜蘆醇的濃度不小于65 μmol/L時，與對照組相比，實驗組A549細(xì)胞的存活率差異極顯著（P＜0.01）。白藜蘆醇對A549細(xì)胞的LD50值為45.24 μmol/L。

2.2 亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞存活率的影響

圖3 亞硒酸和白藜蘆醇鈉聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞存活率的影響Fig. 3 Effect of sodium selenite combined with resveratrol on survival rate of A549 cells

如圖3所示，不含亞硒酸鈉時，A549細(xì)胞的存活率先是隨著白藜蘆醇濃度的升高而升高，當(dāng)濃度大于25 μmol/L后，細(xì)胞存活率逐漸降低；當(dāng)加入亞硒酸鈉后，隨著白藜蘆醇濃度的升高細(xì)胞存活率先降低，當(dāng)白藜蘆醇濃度升至約25 μmol/L后，存活率隨著濃度的升高而升高。當(dāng)白藜蘆醇濃度一定時，隨亞硒酸鈉濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，當(dāng)亞硒酸鈉濃度大于等于5 μmol/L時，與對照組相比，實驗組A549細(xì)胞的存活率差異極顯著（P＜0.01），且其細(xì)胞存活率在10%～50%之間。當(dāng)亞硒酸鈉濃度小于等于2 μmol/L，白藜蘆醇濃度為25、45 μmol/L時，A549細(xì)胞的存活率在40%～70%之間；當(dāng)亞硒酸鈉濃度大于2 μmol/L，白藜蘆醇濃度在5、25 μmol/L時，A549細(xì)胞的存活率在15%～30%之間。

2.3 亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞凋亡的影響

圖4 亞硒酸鈉和白藜蘆醇對A549細(xì)胞凋亡的影響Fig. 4 Effect of 2,5 μmol/L sodium selenite combined with 25 μmol/L resveratrol on apoptosis in A549 cells

亞硒酸鈉是無機(jī)硒化合物，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉對機(jī)體細(xì)胞有一定的毒副作用[18]；白藜蘆醇是從植物中提取出來的天然活性物質(zhì)[19]，在一定濃度范圍內(nèi)，對機(jī)體無毒副作用。根據(jù)亞硒酸鈉和白藜蘆醇對A549細(xì)胞的LD50設(shè)置了2 種研究方案：1）亞硒酸鈉濃度為2 μmol/L，白藜蘆醇濃度為25 μmol/L；2）亞硒酸鈉濃度為5 μmol/L，白藜蘆醇濃度為25 μmol/L。

細(xì)胞凋亡貫穿于腫瘤發(fā)生、腫瘤免疫監(jiān)測、組織細(xì)胞代謝等過程的開始。由圖4可以看出，與不加亞硒酸鈉和白藜蘆醇的對照組相比，單獨用藥組和聯(lián)合用藥組都能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但亞硒酸鈉組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率差異極顯著（P＜0.01）；當(dāng)2 μmol/L亞硒酸鈉和25 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合用藥時，與亞硒酸鈉組相比，聯(lián)合用藥組的凋亡率差異極顯著（P＜0.01），這說明了與其他組相比，聯(lián)合用藥組對A549細(xì)胞抑制作用更顯著，差異更明顯。當(dāng)5 μmol/L亞硒酸鈉和25 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合用藥時，與亞硒酸鈉單獨用藥組相比，細(xì)胞凋亡率差異極顯著（P＜0.01）。

亞硒酸鈉的毒副作用與其濃度有關(guān)，高劑量比低劑量的亞硒酸鈉毒副作用更顯著。當(dāng)亞硒酸鈉濃度為2 μmol/L且白藜蘆醇濃度為25 μmol/L時，A549細(xì)胞的凋亡率為（3.733±1.038）%；當(dāng)亞硒酸鈉濃度為5 μmol/L且白藜蘆醇濃度為25 μmol/L時，A549細(xì)胞的凋亡率為（2.217±0.689）%。由此可見，與亞硒酸鈉濃度為5 μmol/L的聯(lián)合用藥組相比，亞硒酸鈉濃度為2 μmol/L時的聯(lián)合用藥組的效果差異顯著（P＜0.05）。

另外，隨著研究的不斷深入，細(xì)胞凋亡的調(diào)控和增殖還與眾多基因蛋白的表達(dá)有關(guān)，比如促凋亡基因（P53、Bax）、抑凋亡基因（Bcl-2）等[20-23]。細(xì)胞凋亡的早期特征變化主要包括出現(xiàn)水解酶Caspase-3，活化的Caspase-3能夠裂解胞內(nèi)眾多酶類，其也能使細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[24-27]。這對亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞影響的分子機(jī)制研究具有重要的借鑒以及指導(dǎo)作用。

2.4 亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合對A549細(xì)胞周期的影響

圖5 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對A549細(xì)胞周期的影響Fig. 5 Effect of sodium selenite combined with resveratrol on cell cycle in A549 cells

表2 亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞周期的影響Table 2 Effect of sodium selenite combined with resveratrol on cell cycle in A549 cells cycle

腫瘤細(xì)胞的一大特點就是無限增殖，其主要原因是其細(xì)胞周期失控所致，因此干擾腫瘤細(xì)胞無限增殖是治療腫瘤的另一個思路。有絲分裂是細(xì)胞實現(xiàn)增殖的必須手段。有絲分裂間期分為G1、S、G2 3 個階段，其中在G1期與G2期細(xì)胞進(jìn)行DNA的復(fù)制與有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，S期進(jìn)行DNA的復(fù)制。故S期是完成遺傳信息復(fù)制的最重要階段。因此，阻止細(xì)胞周期由G1期到S期的過渡是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的有效方法并且在癌癥治療中起到重要的作用[28-30]。如圖5和表2所示，與對照組細(xì)胞相比，亞硒酸鈉組G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少，S期細(xì)胞比例顯著增大（P＜0.05），說明亞硒酸鈉可將細(xì)胞周期阻滯在S期。這與王家駿等[31]研究亞硒酸鈉與順鉑聯(lián)合用藥作用于體外A549細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉中、高劑量組A549細(xì)胞的周期被阻滯于G0/G1期的結(jié)果相同。而白藜蘆醇組與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增大，S期細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05），提示白藜蘆醇可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。而陳加順等[32]通過白藜蘆醇作用于A549細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，隨著白藜蘆醇濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例越來越高，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制肺腺癌細(xì)胞的增值。亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合用藥作用于A549細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞與亞硒酸鈉組相比顯著增多（P＜0.05）。提示亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇作用后，可以對A549細(xì)胞形成G0/G1期阻滯，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3 結(jié) 論

本研究分析和評價了亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨用藥和聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞拮抗的效果，通過比較單獨用藥和聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞的存活率、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期得出如下結(jié)論：亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合用藥能抑制A549細(xì)胞增殖，在一定的劑量范圍之內(nèi)，與單獨用藥相比，聯(lián)合用藥的抑制效果顯著；亞硒酸鈉是無機(jī)硒，且其具有一定的毒性，而白藜蘆醇無毒，在本研究中，低劑量（2 μmol/L）的亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇作用于A549細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于高劑量（5 μmol/L）的亞硒酸鈉單獨使用的作用效果。

通過本研究可以初步判定亞硒酸鈉和白藜蘆醇的最適宜配比，為進(jìn)一步研究亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞的分子機(jī)制研究提供依據(jù)?？傊谝欢ǖ膭┝糠秶畠?nèi)，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞有一定的拮抗作用，而且還能緩解亞硒酸鈉的毒副作用，可為對A549細(xì)胞的臨床研究提供一些依據(jù)。然而，亞硒酸鈉和白藜蘆醇誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Synergistic Effect of Sodium Selenite and Resveratrol on Lung Cancer Cell Line

ZHANG Ping, WAN Yingxin*, LI Nan
(College of Biochemical Engineering, Beijing Union University, Beijing 100023, China)

Objective: To investigate the effect of sodium selenite, resveratrol and their combination on the proliferation and apoptosis of lung cancer cell line A549 cells and to explore the underlying mechanisms. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to assess the individual and combined effects of sodium selenite and resveratrol on proliferation and survival of A549 cells. The cell apoptosis rate and cell cycle were determined by flow cytometry. Results indicated that sodium selenite and resveratrol had an antagonistic effect on A549 cells in a concentration-dependent manner,and the effect was very significant at a concentration ≥ 5 μmol/L for sodium selenite and ≥ 65 μmol/L for resveratrol (P ＜0.01). The median lethal doses of (LD50) of sodium selenite and resveratrol for A549 cells were 4.759 and 45.24 μmol/L,respectively. However, when sodium selenite and resveratrol were used in combination, a synergistic effect was observed.The combination of low-dose sodium selenite and resveratrol inhibited A549 cells as effectively as high-dose sodium selenite, greatly reducing the cytotoxicity of high-dose sodium selenite. In addition, the combination of sodium selenite and resveratrol arrested the cell cycle at the G0/G1 phase and ultimately led to cell apoptosis.

sodium selenite; resveratrol; lung cancer A549 cells; cell cycle; cell apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201721035

TS201.2

A

1002-6630（2017）21-0217-06

張平, 萬鷹昕, 李楠. 亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用對肺癌細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 217-222.

10.7506/spkx1002-6630-201721035. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Ping, WAN Yingxin, LI Nan. Synergistic effect of sodium selenite and resveratrol on lung cancer cell line[J]. Food Science,2017, 38(21): 217-222. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721035. http://www.spkx.net.cn

2017-05-03

北京市教委面上項目（KM201711417008）；北京聯(lián)合大學(xué)“啟明星”大學(xué)生科技創(chuàng)新項目

張平（1989—），男，碩士研究生，研究方向為微量元素成分提取加工及其性能。E-mail：2369248122@qq.com

*通信作者：萬鷹昕（1976—），女，教授，博士，研究方向為微量元素富硒活性成分提取加工及其性能。E-mail：wyx@buu.edu.com