王瓊英，高 巍，趙夢然，鄔向麗，陳 強，曲積彬，黃晨陽*

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081）

市售食用菌鮮品外源細菌的動態(tài)變化分析

王瓊英，高 巍，趙夢然，鄔向麗，陳 強，曲積彬，黃晨陽*

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081）

目前，市售食用菌鮮品大多保藏于常溫條件下，食用菌因營養(yǎng)豐富、表面組織鮮嫩而更易滋生外源微生物。以市售常溫保藏的金針菇、杏鮑菇、蟹味菇鮮品為材料，分析貨架期內其外源細菌數(shù)量、種類、群落多樣性的變化。結果表明，3 種食用菌在貨架期內外源細菌數(shù)量明顯增加，貨架期5 d蟹味菇增長了29 倍，金針菇、杏鮑菇分別增長了417、4 116 倍。外源細菌種類及相對豐度在貨架期呈動態(tài)變化，表現(xiàn)為優(yōu)勢菌在貨架期1～5 d能夠被檢測到，蟹味菇假單胞菌屬豐度增加和金針菇乳球菌屬豐度降低。Shannon指數(shù)表明在貨架期內，金針菇外源細菌多樣性明顯低于杏鮑菇和蟹味菇。主成分分析結果表明，3 種食用菌各自在不同貨架期內菌群結構呈現(xiàn)相似性，蟹味菇和杏鮑菇外源細菌菌群結構存在一定的相似性，金針菇外源細菌菌群結構與蟹味菇和杏鮑菇存在差異。

貨架期；高通量測序法；多樣性；致病菌；腐敗菌

食用菌兼具營養(yǎng)、美味和保健功能，深受消費者青睞。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2015年我國食用菌總產(chǎn)量3 476.15萬 t，產(chǎn)值2 516.38億 元。市售食用菌以干品和鮮品為主，隨著消費需求的改變，食用菌鮮品占比日益擴大[1]。食用菌生產(chǎn)環(huán)節(jié)易于控制，嚴把原料質量、規(guī)范栽培管理即可完全避免重金屬污染、農(nóng)藥殘留等問題[2]，但是市售食用菌鮮品存在質量的問題，主要原因是采后的包裝、貯運、銷售環(huán)節(jié)采用常溫，未能有效防范外源細菌的繁殖[3-5]。研究食用菌外源細菌數(shù)量、種類、群落多樣性的變化成為必然。

國外學者對食用菌外源細菌開展初步研究。Reinartz等[6]對-24 ℃凍存一年的雙孢蘑菇切片和其他食品進行微生物區(qū)系檢測，以探究微生物死亡率以及不同細菌的生存能力，發(fā)現(xiàn)腸桿菌科細菌顯著減少，乳酸細菌、乳酸桿菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌也有相當程度的減少。Leff等[7]對雙孢蘑菇和蔬菜、水果等進行外源細菌研究，發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇外源細菌中腸桿菌科細菌比例很小，其外源細菌主要隸屬于根瘤菌科、微球菌科、鞘脂桿菌科、叢毛單胞菌科，且傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)式栽培比有機農(nóng)業(yè)式栽培外源細菌豐度更高。Jaworska等[8]對新鮮未貯存、20 ℃貯存48 h、4 ℃貯存48 h和4 ℃貯存96 h的牛肝菌樣品進行外源微生物分析，結果發(fā)現(xiàn)，20 ℃貯存48 h的樣品可以檢測到大量乳酸菌，還包括一些芽孢菌、霉菌和酵母，已不適合銷售；即使經(jīng)過熱燙處理后，并沒有明顯減少上述微生物數(shù)量；但4 ℃貯存96 h的牛肝菌未檢測到。國內對食用菌外源細菌的研究鮮有報道。

本研究以市售金針菇、杏鮑菇、蟹味菇鮮品為對象，分析常溫條件下外源細菌數(shù)量、種類、群落多樣性，探尋貨架期內外源細菌動態(tài)變化規(guī)律，以期為保障食用菌鮮品質量安全提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇、杏鮑菇、蟹味菇3 種食用菌為材料，購自北京市本地超市，常溫銷售，當天上架，托盤獨立包裝。

LB培養(yǎng)基 生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

Shock-Mixer1脈沖均質器 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；C1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 貨架期設置

金針菇、杏鮑菇、蟹味菇3 種食用菌各購買25 份，選擇當天上架的、獨立包裝的同批鮮品，置于常溫條件下存放。貨架期設置1～5 d共5 個處理，當天隨機取樣3 份記為貨架期1 d。每次隨機取樣，3 個重復。

1.3.2 樣品制備

處理過程中采樣原則、采樣方案參照GB 4789.1—2016《食品微生物學檢驗 總則》[9]。采樣后，樣品預處理：經(jīng)無菌操作將新鮮子實體切碎，混合均勻，取25.0 g放入無菌袋中，加入225.0 mL質量分數(shù)0.85% NaCl溶液，經(jīng)脈沖勻質器振蕩30 s，均質液即為10-1樣品稀釋液，以質量分數(shù)0.85% NaCl溶液依次制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋液，備用。

1.3.3 菌種鑒定

分離、純化：選擇10-2、10-3、10-4、10-5、10-6多個梯度樣品稀釋液涂平板，選擇適宜濃度的平板，根據(jù)平板上菌落生長的形態(tài)、大小、顏色等特征挑取單菌落，進行劃線培養(yǎng)。

菌落計數(shù)：計數(shù)原則、方案參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[10]。

鑒定：用煮沸法提取細菌DNA（取菌苔于50 μL ddH2O中，100 ℃煮沸15 min，-20 ℃放置90 s，12 000 r/min離心2 min，上清液備用）。使用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增16S rDNA全長[11]。擴增體系為：2 μL DNA模板，5 μL 10×ExTaq Buffer，2 μL dNTPs，引物27F和1492R各0.75 μL（10 μmol/L），0.25 μL ExTaq聚合酶，ddH2O補足至25 μL。PCR產(chǎn)物電泳檢測后，送北京博邁德公司測序，測序結果與Eztaxon數(shù)據(jù)庫比對得到相似度最高的種[12]。

1.3.4 16S rDNA高通量測序

取200 mL洗脫液，分裝于50 mL離心管，12 000 r/min離心20 min，棄上清液，用1.0 mL無菌水懸浮沉淀，合并于10 mL離心管。然后，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，沉淀用于DNA提取。

基因組提取：使用細菌基因組提取試劑盒，依據(jù)說明書操作，所提DNA保存于-20 ℃。

16S rDNA高通量測序：委托北京奧維森公司進行，以338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為引物擴增16S V3～V4區(qū)[13]，采用MiSeq平臺測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)檢測合格進行生物信息學分析。對有效數(shù)據(jù)在97%水平上進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，并利用Greengenes數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類信息分析，分析樣品物種組成[14-15]。利用Mothur軟件進行Alpha多樣性和Beta多樣性分析。Beta多樣性分析基于加權Unifrac算法進行主成分分析（principal component analysis，PCA）[16]。

2 結果與分析

2.1 3 種食用菌貨架期內外源細菌數(shù)量變化

圖1 3 種食用菌貨架期外源細菌數(shù)量變化Fig. 1 Changes in total number of exogenous bacteria in three kinds of mushrooms during storage

結果表明，貨架期1～5 d內，3 種食用菌的外源細菌持續(xù)增殖，外源細菌數(shù)明顯增加（圖1）。金針菇外源細菌數(shù)量均明顯高于杏鮑菇和蟹味菇，第5天可達到1.8×108CFU/g。在杏鮑菇貨架期1 d時，外源細菌最少，貨架期1～3 d，外源細菌增殖最快。蟹味菇在貨架期外源細菌增殖相對比較緩慢。存在差異的主要原因可能是兩方面：一是存在的外源細菌種類不一樣；二是不同種類食用菌的質地和營養(yǎng)不同，為外源微生物生長繁殖創(chuàng)造的營養(yǎng)基礎不同。

2.2 3 種食用菌貨架期內外源細菌種類及變化

2.2.1 16S rDNA高通量測序細菌物種組成分析

對金針菇、杏鮑菇、蟹味菇1～5 d貨架期外源細菌16S rDNA高通量測序，結果顯示鑒定到31 個門，79 個綱，132 個目，212 個科，343 個屬。

在不同分類級別，對外源細菌群落結構進行分析。門水平所有樣品中含量最高是變形菌門（Proteobacteria）（84.7%），其次是厚壁菌門（Firmicutes）（9.4%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（4.4%）。綱水平所有樣品含量最高的是γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）（78.4%），其次是桿菌綱（Bacilli）（8.8%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）（4.4%）、鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria）（2.9%）。進一步在屬水平進行分析，金針菇外源細菌中比例前10的屬為乳球菌屬（Lactococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙雷氏菌（Serratia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、愛文氏菌屬（Ewingella）、歐文氏菌屬（Erwinia）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）。杏鮑菇為假單胞菌屬、乳球菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、棲霉菌屬（Mycetocola）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）。蟹味菇為假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、橄欖形菌屬（Olivibacter）、歐文氏菌屬、德沃斯氏菌（Devosia）、地桿菌屬（Pedobacter）、弓形桿菌屬。

圖2 3 種食用菌貨架期外源假單胞菌屬及乳球菌屬相對豐度變化Fig. 2 Changes in relative abundance of exogenous Pseudomonas and Lactococcus in three kinds of mushrooms during storage

在屬水平，假單胞菌屬和乳球菌屬豐度較高，在3 種食用菌表面均存在。蟹味菇外源細菌中假單胞菌屬相對豐度遠高于金針菇以及杏鮑菇；該屬在杏鮑菇貨架期延長過程中逐漸降低；在金針菇中相對豐度最低（圖2a）。乳球菌屬在不同貨架期菌群結構中的變化與假單胞菌屬有明顯的區(qū)別。金針菇外源細菌中乳球菌屬相對豐度最高，但隨貨架期延長豐度降低；杏鮑菇和金針菇呈現(xiàn)相同的變化趨勢；蟹味菇在貨架期乳球菌屬豐度沒有明顯變化（圖2b）。出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象可能是因為在貨架期初期，富足的營養(yǎng)使菌體大量繁殖，伴隨著新陳代謝產(chǎn)物的不斷積累（如乳酸的積累），抑制細菌增殖，而部分能夠適應環(huán)境改變的種類仍能大量存在（如假單胞菌）。

2.2.2 平板分離法物種鑒定

為進一步在種的分類水平進行分析，對金針菇、杏鮑菇、蟹味菇貨架期1～5 d外源細菌進行平板分離、純化和鑒定，共得到24 個屬，38 個種（表1）。

表1 平板培養(yǎng)3 種食用菌分離外源細菌的種類Table 1 Exogenous bacterial species in three kinds of mushrooms evaluated by plate culture method

2.2.3 16S rDNA高通量測序和平板分離法物種鑒定結果對比

16S rDNA高通量測序發(fā)現(xiàn)金針菇、杏鮑菇、蟹味菇貨架期外源細菌群落結構中相對豐度最高的屬分別為乳球菌屬、假單胞菌屬、假單胞菌屬；而平板培養(yǎng)法中，金針菇外源細菌中優(yōu)勢種為美洲愛文菌（愛文氏菌屬）和變形肥桿菌（肥桿菌屬），杏鮑菇為美洲愛文菌（愛文氏菌屬）和北京泛菌（泛菌屬），蟹味菇為解鳥氨酸拉烏爾菌（拉烏爾菌屬）和深紅沙雷氏菌（沙雷氏菌屬）。

2 個方法存在一定的差異，但在平板培養(yǎng)法中檢測到的優(yōu)勢種，均可在高通量測序方法中檢測到。高通量測序法能更準確判讀外源細菌群落種類相對豐度，且能夠檢測到外源細菌群落結構中更多的細菌種類，包括大量的不可培養(yǎng)細菌，但在種的分類水平鑒定方面并不準確，而平板培養(yǎng)法能準確進行種水平的分析。因此，將2 種方法相結合，能夠更加科學地進行食用菌貨架期外源細菌種類的分析。

2.3 3 種食用菌貨架期外源細菌群落多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析

圖3 3 種食用菌貨架期外源細菌群落OTU數(shù)量變化Fig. 3 Variations in OTU numbers of exogenous bacterial community in three kinds of mushrooms during storage

高通量測序結果顯示，在0.97的相似度下，共獲得8 480 個OTU。蟹味菇外源細菌OTU數(shù)量明顯高于杏鮑菇和金針菇（圖3）。金針菇外源細菌OTU數(shù)量在貨架期1～4 d呈增長趨勢，第5天部分下降；杏鮑菇外源細菌貨架期OTU數(shù)量變化趨勢與金針菇相反；蟹味菇外源細菌OTU數(shù)量在貨架期1～2 d上升而后下降。

圖4 3 種食用菌貨架期外源細菌群落Shannon指數(shù)變化Fig. 4 Variations in Shannon index of exogenous bacterial community in three kinds of mushrooms during storage

基于OTU的結果計算Shannon指數(shù)，結果表明在整個貨架期內金針菇外源細菌群落多樣性明顯低于杏鮑菇和蟹味菇（圖4）。杏鮑菇貨架期內外源細菌Shannon指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的變化，貨架期1 d Shannon指數(shù)值最高；蟹味菇1～3 d貨架期內外源細菌Shannon指數(shù)維持穩(wěn)定，3～4 d轉而降低，4～5 d有所回升。

2.3.2 Beta多樣性分析

基于OTU的結果進行PCA分析，以觀察不同食用菌不同貨架期外源細菌群落間的差異（圖5）。結果表明貨架期1～5 d，金針菇、蟹味菇、杏鮑菇3 組樣品內呈現(xiàn)一定的交疊現(xiàn)象，說明組內樣品在貨架期群落結構具有一定的相似性。PC1或PC2水平，金針菇細菌群落均能與杏鮑菇和蟹味菇區(qū)分開，說明該組樣品相對于另外兩組樣品具有獨特的群落結構。而杏鮑菇與蟹味菇這兩組樣品間菌群結構具有相似性。

圖5 3 種食用菌貨架期外源細菌群落結構PCA圖Fig. 5 PCA plot for exogenous bacterial communities in three kinds of mushrooms stored for different time periods

3 討 論

在食品腐敗過程中，微生物的作用是主要因素之一。以乳制品、肉制品、水產(chǎn)品和果蔬4 類食品為例，細菌的群體作用在這4 類食品腐敗過程中起到關鍵作用[17]。同時有文獻報道，細菌是污染鮮切蔬菜的主要微生物[18]，如胡蘿卜、紫甘藍、西蘭花的主要腐敗細菌數(shù)量分別占總活菌數(shù)量的69%～75%、66%～70%、72%～77%。因此本研究中只探究了貨架期外源細菌數(shù)量、種類、多樣性等特征，而未對真菌群落進行研究。另外，鑒于低溫貯藏可以減弱微生物繁殖，使腸桿菌、乳酸菌、假單胞菌等細菌的數(shù)量大幅降低，進而延長貨架期，因此本研究只對貨架期內（5 d）常溫條件下貯藏的食用菌鮮品進行了研究。

本研究表明，不同種類食用菌外源細菌OTU組成存在較大差異，出現(xiàn)這樣的情況可能是因為：1）不同食用菌種類質地與營養(yǎng)基礎不同，因此為外源細菌提供的生長繁殖基礎不同；2）不同食用菌種類子實體結構不同，與外源細菌接觸機會不同；3）在3 種食用菌表面生存的細菌種類不同，有些種類生長繁殖能力強，在貨架期能夠一直繁殖，不會因為其他細菌的競爭關系而導致其數(shù)量的減少[19]。

鑒于食品安全考慮，外源細菌的致病性和致腐性值得關注，研究發(fā)現(xiàn)3 種食用菌外源細菌中存在部分條件致病菌及腐敗菌，條件致病菌有腐生葡萄球菌[20]、木糖氧化無色桿菌[21]、不動桿菌屬細菌[22]、金黃桿菌屬細菌[23]、以及蒼白桿菌屬細菌[24]。同時在杏鮑菇、蟹味菇外源細菌中存在Arcobacter，一種人畜共患的病原菌，與人類胃腸炎和菌血癥有關[25]。腐敗細菌主要有美洲愛文菌[26]、拉恩氏菌屬細菌[27]、假單胞菌屬細菌[28-29]、泛菌屬細菌[30]、乳球菌屬細菌[31]、腸桿菌屬細菌[31]以及歐文氏菌屬細菌[31]。有報道在杏鮑菇子實體腐敗組織中分離到泛菌屬細菌[30]，本實驗同樣在杏鮑菇中分離到；此外，有報道稱美洲愛文菌是雙孢蘑菇柄壞死的主要病原菌。從食品安全角度講，應當對食用菌鮮品經(jīng)過高溫處理，減少外源細菌數(shù)量，避免有害細菌對人體的傷害。

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Dynamic Changes of Exogenous Bacteria in Marketed Fresh Mushrooms

WANG Qiongying, GAO Wei, ZHAO Mengran, WU Xiangli, CHEN Qiang, QU Jibin, HUANG Chenyang*
(Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Edible mushrooms are popular with consumers due to their rich nutrition, tasty and health benefits. Fresh edible mushrooms are usually placed at room temperature in the market. Fresh mushrooms are readily infected with exogenous microbes for their rich nutrition, tender surface structure and lack of a protective structure. In this paper, fresh mushrooms of Flammulina valutipes, Pleurotus eryngii, and Hypsizygus marmoreus were studied. The exogenous bacterial number, species and community diversity were analyzed as a function of storage time at ambient temperature. Results showed that the amount of exogenous bacteria in F. valutipes, P. eryngii and H. marmoreus increased significantly by 29, 417 and 4 116 times,respectively. Besides, the abundance of different exogenous bacteria also changed during the storage period of 5 days, with the highest increase of Pseudomonas spp. in H. marmoreus and decline of Lactococcus spp. in F. valutipe being observed.According to Shannon index, exogenous bacterial diversity of F. valutipe was significantly lower than that of P. eryngii, and H. marmoreus. Principal component analysis results showed that the microbial community structure was similar at different times of storage within each species, and H. marmoreus and P. eryngii showed some similarities, while differences between F. velutipes and the other two species were observed.

storage period; high throughput sequencing; diversity; pathogenic bacteria; spoilage bacteria

10.7506/spkx1002-6630-201721013

S646

A

1002-6630（2017）21-0080-06

王瓊英, 高巍, 趙夢然, 等. 市售食用菌鮮品外源細菌的動態(tài)變化分析[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 80-85.

10.7506/spkx1002-6630-201721013. http://www.spkx.net.cn

WANG Qiongying, GAO Wei, ZHAO Mengran, et al. Dynamic changes of exogenous bacteria in marketed fresh mushrooms[J]. Food Science, 2017, 38(21): 80-85. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721013. http://www.spkx.net.cn

2017-03-09

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD16B03）

王瓊英（1993—），女，碩士研究生，研究方向為食用菌遺傳育種。E-mail：735665861@qq.com

*通信作者：黃晨陽（1977—），男，副研究員，博士，研究方向為食用菌遺傳育種。E-mail：huangchenyang@caas.cn