潘春青，岳田利，王鐵成，王 媛，袁亞宏,*，李雨娟

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

氣體沿面放電低溫等離子體對擴(kuò)展青霉孢子殺滅效果

潘春青1，岳田利1，王鐵成2，王 媛1，袁亞宏1,*，李雨娟2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

目的：研究氣體沿面放電低溫等離子體對擴(kuò)展青霉孢子的殺菌效果。方法：以擴(kuò)展青霉標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC 40658和擴(kuò)展青霉分離菌株F-LPH10-06為目標(biāo)菌株，探討2 株菌在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中的生長和產(chǎn)毒特性；應(yīng)用自制的氣體沿面放電低溫等離子體殺菌設(shè)備，探討處理時間、電源電壓及孢子不同初始濃度對殺菌效果的影響；并應(yīng)用掃描電子顯微鏡對孢子形態(tài)變化進(jìn)行觀察。結(jié)果：擴(kuò)展青霉CICC 40658和F-LPH10-06培養(yǎng)14 d后的菌體干質(zhì)量分別為28.6 mg和128.7 mg，展青霉素含量分別為912.40 μg/L和147.97 mg/L，F(xiàn)-LPH10-06產(chǎn)毒量幾乎是CICC 40658產(chǎn)毒量的162 倍。氣體沿面放電低溫等離子體21 min能全部殺死樣品中CICC 40658孢子（初始濃度為3.4×106個/mL）；處理30 min，能使樣品中F-LPH10-06孢子（初始濃度為1.5×106個/mL）減少4.58 lg（個/mL）。在相同的處理時間下，隨著電源電壓升高和初始孢子濃度降低，殺菌效果逐漸提高。掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，孢子表面形態(tài)經(jīng)過放電處理后被改變，這可能與放電過程中產(chǎn)生的高能電子和活性氧有關(guān)。結(jié)論：氣體沿面放電低溫等離子體對擴(kuò)展青霉孢子有一定殺滅作用，這為低溫殺菌技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

低溫等離子體；氣體沿面放電；擴(kuò)展青霉；殺菌效果；展青霉素

展青霉（毒）素（patulin）又稱棒曲霉（毒）素、珊瑚青霉素，是由曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和絲衣霉屬（Byssochlamys）等多種真菌代謝產(chǎn)生的一種具有神經(jīng)毒性的次級代謝產(chǎn)物[1-2]。展青霉素對動物組織和細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性，小鼠經(jīng)皮下注射展青霉素會引起腎淤血、肺水腫、呼吸困難、腹腔和胸腔積液、組織壞死等癥狀。人體攝入過量的展青霉素會引發(fā)腸炎、痙攣、潰瘍、抽搐、呼吸困難、癌變等一系列的急性和慢性病癥[3]。

在食品生產(chǎn)中普遍存在展青霉素污染的問題。大量研究表明，蘋果、梨、獼猴桃等水果在收獲、貯藏及加工過程中均有可能受到展青霉素產(chǎn)生菌的污染[4-7]。Zhu Yan等[8]在草酸對獼猴桃貯藏過程中對擴(kuò)展青霉抑制作用的研究中表明，獼猴桃在貯藏過程中易感染霉菌而患貯積病，尤其是表面有破損的果實(shí)極易被青霉菌污染[9-10]。在所有水果中，蘋果及其制品受展青霉素的污染最為嚴(yán)重。病原微生物主要通過破損的組織或傷口進(jìn)入果實(shí)內(nèi)部，在適宜的條件下，病原微生物迅速繁殖，引起水果腐爛和病變。有研究表明，在干酪和谷物產(chǎn)品[11]如小麥、大麥、谷物根部、飼料[12]中也可檢測出展青霉素。鑒于展青霉素對人體的危害，世界各國相繼制定了食品中展青霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)。GB 14974—2003《蘋果和山楂制品中展青霉素限量》中明確規(guī)定了蘋果、山楂制品中展青霉素的最大容許量不得超過50 μg/L[13]，歐盟第455/2004指令規(guī)定，果汁、果酒及其果肉發(fā)酵制品中展青霉素質(zhì)量濃度小于50 μg/L，可使用蘋果及固體產(chǎn)品中展青霉素限量為25 μg/L，兒童食用蘋果汁和嬰幼兒食品中展青霉素限量則更低，毒素質(zhì)量濃度要小于10 μg/L[14-15]。目前，對食品中展青霉素的控制主要集中在兩個方面，一方面是在加工過程中通過原料挑選、清洗、吸附、輻射、過濾、微波及紫外處理去除食品中的展青霉素[16-19]；另一方面是通過各種物理、化學(xué)、生物方法殺滅各種展青霉素產(chǎn)生菌，從源頭上控制展青霉素的產(chǎn)生。化學(xué)滅菌法主要是利用有機(jī)化學(xué)試劑進(jìn)行殺菌，殺菌效果好、使用方便、設(shè)備投資少，但是長期使用會增加微生物的抗藥性，同時毒性大、有腐蝕性，會對環(huán)境造成污染。生物滅菌法由于成本較高、技術(shù)掌握困難，目前處于理論研究階段[20]。常用的滅菌方法是物理滅菌法，包括加熱滅菌法和低溫滅菌法。加熱滅菌法是比較傳統(tǒng)的滅菌方法，但殺菌的同時也會對食品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值造成一定的破壞。低溫等離子體滅菌法作為一種新型的低溫滅菌方法，具有很高的研究價值。

低溫等離子體是氣體介質(zhì)在高壓放電條件下所激發(fā)出的離子，是區(qū)別于液態(tài)、固態(tài)、氣態(tài)所存在的物質(zhì)的第4種狀態(tài)[20]。低溫等離子體滅菌技術(shù)作為一種新型的低溫滅菌方法在污水治理[21]、空氣凈化[22]、醫(yī)療器械消毒[23]、材料表面改性等方面有廣泛的應(yīng)用，但在食品領(lǐng)域應(yīng)用較少。低溫等離子體的滅菌機(jī)理主要是利用在放電過程中產(chǎn)生的帶電粒子的物理破壞作用[24-25]、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的氧化作用[26]以及紫外光的輻射作用[27-28]。低溫等離子體技術(shù)作為一種安全、快速、低溫、環(huán)保的滅菌方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究以2 株擴(kuò)展青霉CICC 40658和F-LPH10-06作為目標(biāo)菌株，探討了2 株菌產(chǎn)生展青霉素的產(chǎn)毒特性，以氣體沿面放電低溫等離子體對其進(jìn)行處理，初步研究了處理時間、電源電壓及孢子不同初始濃度對滅菌效果的影響，并通過掃描電子顯微鏡初探氣體沿面放電低溫等離子體的滅菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）CICC 40658購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；擴(kuò)展青霉（P. expansum）F-LPH10-06由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵動力學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯汁1 000 mL、葡萄糖20.0 g、瓊脂20 g，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。其中馬鈴薯汁的制備方法為馬鈴薯去皮，挖芽眼，洗凈，切片，稱取200 g放入1 000 mL蒸餾水中用文火煮沸10～20 min，雙層紗布過濾，濾液加水補(bǔ)至1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：PDA培養(yǎng)基不加瓊脂。

葡萄糖 西隴化工股份有限公司；瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDS2012示波器 美國Tektronix公司；LC-2010A高效液相色譜儀 日本島津公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；CX31顯微鏡 日本奧林巴斯公司；BCN-1360B生物潔凈工作臺哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司；ES-315高壓蒸汽滅菌器日本Tomy公司；MP-160B霉菌培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

圖1 放電等離子體反應(yīng)系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of discharge plasma reaction system

氣體沿面放電低溫等離子體殺菌設(shè)備（圖1），與Wang Tiecheng等[29]用氣相沿面放電等離子體降解腐殖酸實(shí)驗(yàn)中所用設(shè)備相似。放電電源采用交流高壓電源發(fā)生器（頻率50 Hz，電源電壓0～40 kV，可調(diào)，由大連理工大學(xué)環(huán)境等離子體研究室提供）；反應(yīng)器是一個內(nèi)徑5 cm、高35 cm的有機(jī)玻璃圓桶；高壓電極由一個內(nèi)徑12 mm、厚1.5 mm的石英玻璃管組成，內(nèi)部連接有一根直徑1 mm的螺旋狀不銹鋼絲，放電長度為17 cm；被處理的樣品作為接地電極，氣體沿石英管放電，放電氣體介質(zhì)為干燥的空氣。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將1.1節(jié)菌株接種到PDB培養(yǎng)基，25～28 ℃培養(yǎng)5 d后，劃線轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，25～28 ℃培養(yǎng)5 d后，轉(zhuǎn)接至PDA試管，25～28 ℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水將孢子洗下，接種于裝有100 mL PDA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25～28 ℃培養(yǎng)10 d后，4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 孢子懸液的制備

用無菌水洗下三角瓶中PDA表面的孢子，漩渦振蕩器振蕩后，無菌脫脂棉過濾，制備孢子懸浮液。

1.3.3 菌株生長特性研究

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，取適量孢子懸液加到滅過菌的PDB培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中孢子濃度為5×105個/mL，混勻后，將菌液分裝到50 mL離心管中，每管20 mL，25 ℃靜置培養(yǎng)，每2 d取一次樣，每個樣品3 個平行，濾紙過濾，恒質(zhì)量法（80 ℃烘干）測菌體干質(zhì)量，共測14 d。

1.3.4 菌種產(chǎn)毒特性研究

濾紙過濾后的濾液，用于培養(yǎng)液中展青霉素含量的檢測。采用濾紙過濾法除去培養(yǎng)液中的菌體和雜質(zhì)成分，依照SN/T 1859—2007《飲料中棒曲霉素和5-羥甲基糠醛的液相色譜-質(zhì)譜測定方法》處理和檢測濾液中展青霉素的含量[30]。色譜條件為：Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）、柱溫30 ℃、流動相為乙腈-水（10∶90，V/V）、流速1.0 mL/min、進(jìn)樣量20 μL、檢測波長276 nm。

1.3.5 低溫等離子體處理

孢子懸液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，加入到350 mL無菌水中，使稀釋后的樣品中孢子濃度為104～106個/mL。低溫等離子體處理?xiàng)l件為工作頻率50 Hz、氣體流量160 L/h，放電介質(zhì)為干燥的空氣，在室溫、常壓條件下進(jìn)行處理。

1.3.6 滅菌效果檢測

滅菌效果用處理后存活菌數(shù)的對數(shù)值表示。孢子存活數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別取不同處理時間下1 mL樣品進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度，取100 μL菌懸液涂布于PDA平板上，每個稀釋度3 個平行，25～28 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

將處理前和經(jīng)等離子體處理3 min的樣品經(jīng)4 ℃、2 820×g離心10 min，棄去上清液，加入1 mL 4%戊二醛固定液常溫條件下固定2 h。然后用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行漂洗，5、10、15、20、25、30 min時各沖洗一次。再用1%鋨酸常溫固定2 h，再用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行漂洗，5、10、15、20、25、30 min，各沖洗一次。之后用乙醇進(jìn)行梯度脫水，分別用30%、50%、70%、80%、90%乙醇各脫水一次，每次15 min，最后用100%乙醇脫水2 次，每次30 min。制片、自然晾干、噴金，在5 kV、5 000 倍掃描電子顯微鏡視野下觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在擴(kuò)展青霉生長特性和產(chǎn)毒特性的測定實(shí)驗(yàn)中，每次取3 個樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果取其平均值。在不同因素對擴(kuò)展青霉殺滅效果的影響實(shí)驗(yàn)中，每個時間點(diǎn)取樣1 mL進(jìn)行梯度稀釋，選擇3 個合適的梯度進(jìn)行平板涂布，每個梯度做3 個平行。采用Origin 9.0軟件作圖，用SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株生長特性

圖2 2 株擴(kuò)展青霉在不同培養(yǎng)時間的菌體干質(zhì)量Fig. 2 Dry weight biomass of P. expansum after different culture time

如圖2所示，前4 d為P. expansum CICC 40658的生長適應(yīng)期，在此期間，菌體生長遲緩，菌體干質(zhì)量增加緩慢；從第4天開始進(jìn)入快速生長時期，菌體干質(zhì)量迅速增加，在第6天時達(dá)到最大值（28.6 mg），之后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體干質(zhì)量達(dá)到穩(wěn)定并稍有下降。P. expansum F-LPH10-06經(jīng)過短暫的延滯期后迅速進(jìn)入快速生長時期，從第2天到第10天均為快速生長時期，在第10天菌體干質(zhì)量達(dá)到最大值（128.7 mg），之后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。Taniwaki等[31]對不同體積分?jǐn)?shù)CO2環(huán)境下毛霉的生長特性的研究結(jié)果也表現(xiàn)出相似的生長規(guī)律。從2 株菌的生長情況來看，F(xiàn)-LPH10-06的菌體干質(zhì)量是CICC 40658菌體干質(zhì)量的4.5 倍，這可能與2 株菌的種間差異有關(guān)。

2.2 不同菌株產(chǎn)毒特性

圖3 2 株擴(kuò)展青霉在不同培養(yǎng)時間的展青霉素質(zhì)量濃度Fig. 3 Concentrations of patulin produced by two strains of P. expansum after different culture times

由圖3可知，2 株擴(kuò)展青霉菌株均為展青霉素產(chǎn)生菌。從產(chǎn)毒曲線上可以看出，2 株擴(kuò)展青霉產(chǎn)毒量均呈遞增趨勢。不同的是，P. expansum F-LPH10-06 從第4天開始產(chǎn)生展青霉素，隨著培養(yǎng)時間的延長，產(chǎn)毒量逐漸增加，在第14天時達(dá)到147.97 mg/L；而CICC 40658從第6天才有展青霉素檢出，且產(chǎn)毒量只有33.5 μg/L，隨著培養(yǎng)時間的延長，CICC 40658的毒素含量有一定的積累，在第12天達(dá)到最大值（912.40 μg/L），之后略微降低。Dombrink-Kurtzman等[32]對擴(kuò)展青霉在幾種不同培養(yǎng)基上產(chǎn)毒情況的研究結(jié)果也表現(xiàn)出相同的產(chǎn)毒規(guī)律。從產(chǎn)毒速率上看，第4～10天是F-LPH10-06的快速產(chǎn)毒時期，之后，產(chǎn)毒速率有所下降，產(chǎn)毒量增加緩慢，逐步趨于穩(wěn)定；而CICC 40658的快速產(chǎn)毒時期為第6～10天，之后產(chǎn)毒速率下降，產(chǎn)毒量趨于穩(wěn)定。

把同一菌株的生長特性和產(chǎn)毒特性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，前6 d主要是CICC 40658菌體的適應(yīng)和快速生長時期，在此期間并沒有展青霉素的檢出；之后菌體的生長逐漸趨于穩(wěn)定，開始代謝產(chǎn)生展青霉素，隨著時間的延長，展青霉素含量逐漸增加。對于F-LPH10-06，其適應(yīng)期較短，之后迅速進(jìn)入快速生長期，展青霉素的代謝從第4天逐漸開始；第4天之后，菌體生物量和展青霉素含量開始同步增加，在第10天同時達(dá)到穩(wěn)定。

對三組入選對象均實(shí)施盆底超聲檢查，行盆底超聲檢查前要求入選對象排空大小便，將褲子脫掉后仰臥于檢查床上，且指導(dǎo)入選對象將體位正確擺放成截石位。探頭涂抹耦合劑后將對其包裹一層消毒薄膜（避孕套），再將耦合劑涂抹于避孕套后對入選對象實(shí)施盆底超聲檢查。檢查時將探頭放置于會陰部尿道外口與陰道口之間，左右旋轉(zhuǎn)掃查；指導(dǎo)患者分別做平靜呼吸和縮肛動作，觀察兩種狀態(tài)下的尿道、膀胱、陰道、宮頸以及直腸與肛門連接部；每個切面需重復(fù)測量2次后取平均值。

2.3 處理時間對殺菌效果的影響

實(shí)驗(yàn)中選取放電電壓20.3 kV、頻率50 Hz、氣體流量160 L/h，對已制好的樣品進(jìn)行處理，樣品中2 株菌的孢子濃度分別為3.4×106、1.5×106個/mL。處理過的樣品用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)存活孢子數(shù)，以樣品處理時間為橫坐標(biāo)，存活孢子數(shù)對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制2 株擴(kuò)展青霉的殺菌動力學(xué)曲線（圖4）。

圖4 氣體沿面放電低溫等離子體對2 株擴(kuò)展青霉孢子的殺菌動力學(xué)曲線Fig. 4 Kinetic curves of low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge for killing spores of two strains of P. expansum

由圖4可知，隨著作用時間的延長，樣品中的孢子數(shù)逐漸減少，處理6 min時，CICC 40658孢子數(shù)降低1.0 lg（個/mL），樣品中存活孢子數(shù)對數(shù)值開始極顯著下降（P＜0.01），處理18 min時，孢子數(shù)對數(shù)值下降5.2 lg（個/mL），大多數(shù)孢子被殺死，進(jìn)一步延長時間到21 min時，檢出限范圍內(nèi)未檢出活孢子（檢出限為10 個）。隨著處理時間的延長F-LPH10-06樣品中孢子數(shù)也呈現(xiàn)遞減的趨勢，9 min時，孢子數(shù)減少1.8 lg（個/mL），樣品中孢子數(shù)對數(shù)值極顯著降低（P＜0.01），21 min時減少3.1 lg（個/mL），30 min時，1 mL樣品中僅剩余40 個孢子。由此可見，氣體沿面放電低溫等離子體對擴(kuò)展青霉孢子有很好的殺滅效果[24]。

2.4 孢子不同初始濃度對殺菌效果的影響

由圖5、6可知，在不同的孢子初始濃度條件下，氣體沿面放電低溫等離子體對擴(kuò)展青霉孢子都有明顯的殺菌效果（P＜0.01）。樣品中CICC 40658初始濃度分別為3.4×106、1.2×105、1.4×104個/mL，當(dāng)孢子初始濃度為104個/mL時，經(jīng)過6 min的低溫等離子體處理后，在檢出限范圍內(nèi)未有活孢子檢出；當(dāng)孢子初始濃度為105個/mL時，殺死樣品中全部孢子需要12 min；當(dāng)孢子初始濃度為106個/mL時，殺死全部孢子所需時間延長到21 min（圖5）。

圖5 不同孢子濃度的擴(kuò)展青霉CICC 40658對低溫等離子體滅菌效果的影響Fig. 5 Effect of initial spore concentration on fungicidal effect of low-temperature plasma against spores of P. expansum CICC 40658

圖6 不同孢子濃度的擴(kuò)展青霉F-LPH10-06對低溫等離子體滅菌效果的影響Fig. 6 Effect of initial spore concentration on fungicidal effect of low-temperature plasma against spores of P. expansum F-LPH10-06

F-LPH10-06初始濃度分別為1.5×106、1.3×105、1.4×104個/mL。當(dāng)F-LPH10-06孢子初始濃度為104個/mL時，經(jīng)過18 min的低溫等離子體處理能將孢子全部殺死；當(dāng)孢子濃度為105個/mL時，低溫等離子體處理30 min，可以將孢子全部殺死；當(dāng)孢子濃度為106個/mL時，低溫等離子體處理30 min，樣品中孢子數(shù)下降了4.58 lg（個/mL）（圖6）。從圖5、6可知，降低樣品中孢子濃度，可以明顯縮短殺菌時間。鄭超[33]用脈沖放電低溫等離子體處理不同濃度的大腸桿菌菌懸液，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞初始濃度為7×104CFU/mL時，放電處理0.5 min后細(xì)菌即被全部殺死，這對低溫等離子體殺菌技術(shù)在實(shí)際生活中的應(yīng)用具有重要意義。從圖5、6也可以看出，在相同的放電處理?xiàng)l件下，F(xiàn)-LPH10-06較CICC 40658更難殺死，這可能是因?yàn)镕-LPH10-06孢子比CICC 40658孢子細(xì)胞壁或細(xì)胞膜較厚[24]，在處理的過程中更難被破壞，需對其進(jìn)一步研究探討。

2.5 電壓對殺菌效果的影響

通過調(diào)節(jié)電源控制面板調(diào)節(jié)反應(yīng)器上的電壓分別為10.3、12.8、15.3、17.8、20.3 kV，考察氣體沿面放電低溫等離子體反應(yīng)體系中放電電壓對低溫等離子體滅菌效果的影響，得到兩株擴(kuò)展青霉孢子在處理時間內(nèi)的存活曲線，如圖7、8所示。2 株擴(kuò)展青霉初始孢子濃度分別為2.9×105個/mL（CICC 40658）和1.4×106個/mL（F-LPH10-06），從存活曲線可以看出，放電電壓越高，滅菌效率越高。放電電壓為10.3 kV時，什么低溫等離子體處理21 min后，CICC 40658孢子濃度只能下降3 lg（個/mL）；當(dāng)電壓分別提高到12.8 kV和15.3 kV時，殺死樣品中全部孢子需要的時間分別為18 min和15 min；繼續(xù)升高電壓到17.8 kV，殺死全部孢子的時間縮短到12 min；進(jìn)一步升高電壓到20.3 kV時，殺死全部孢子所需的時間并沒有進(jìn)一步縮短（圖7）。對15.3、17.8、20.3 kV 3 個電壓條件下不同時間點(diǎn)的孢子存活數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)電壓為15.3、17.8 kV時，在9 min以內(nèi)各時間點(diǎn)的殺菌效果并無明顯差異，僅在12 min時才表現(xiàn)出明顯的殺菌效果；當(dāng)處理電壓為17.8、20.3 kV時，2 個電壓條件下的殺菌效果也只在6 min時有明顯差異，其他時間點(diǎn)差異均不明顯。究其原因，可能是因?yàn)楫?dāng)電壓升高到一定程度時繼續(xù)提高電壓，電壓達(dá)到了一定的飽和狀態(tài)，此時的殺菌效率不會繼續(xù)提高。

圖7 不同放電電壓對擴(kuò)展青霉CICC 40658孢子殺菌效果的影響Fig. 7 Effect of discharge voltage on fungicidal effect of plasma against spores of P. expansum CICC 40658

圖8 不同放電電壓對擴(kuò)展青霉F-LPH10-06孢子殺菌效果的影響Fig. 8 Effect of discharge voltage on fungicidal effect of plasma against spores of P. expansum F-LPH10-06

從圖8也可以看出，在相同的放電電壓條件下，孢子濃度隨處理時間的延長而減少；在相同的處理時間下，隨電源電壓逐漸升高，F(xiàn)-LPH10-06孢子存活率也越來越低。當(dāng)放電電壓為10.3 kV時，低溫等離子體處理30 min，F(xiàn)-LPH10-06孢子濃度下降1.70 lg（個/mL），升高電壓到12.8 kV時，樣品中孢子數(shù)對數(shù)值明顯降低，進(jìn)一步升高電壓到15.3、17.8 kV時，存活孢子對數(shù)值與12.8 kV時殺菌效果相比無明顯差異，繼續(xù)提高電壓為20.3 kV時，樣品中孢子數(shù)對數(shù)值下降，絕大多數(shù)的孢子能被殺死。對于不同放電方式殺菌，電源電壓都是影響殺菌效果的一個重要因素，張錚等[34]在常壓介質(zhì)阻擋放電殺滅金黃色葡萄球菌的研究中也表明，隨著電源電壓升高，殺菌效果逐漸提高并最終趨于穩(wěn)定。

2.6 掃描電子顯微鏡結(jié)果

圖9 低溫等離子體處理前后2 株擴(kuò)展青霉孢子的掃描電子顯微鏡圖Fig. 9 Scanning electron micrographs of spores of P. expansum (CICC 40658 and F-LPH10-06) before and after low-temperature plasma exposure

由圖9可知，正常的P. expansum CICC 40658孢子形態(tài)為規(guī)則的橢球形，表面粗糙，周邊完整，形態(tài)飽滿，擁有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖9A）；P. expansum F-LPH10-06孢子形態(tài)與CICC 40658孢子形態(tài)相比較圓，為規(guī)則的球形，同樣表面粗糙，形態(tài)飽滿，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整（圖9C）。Ye Shengying等[35]在連續(xù)直流電暈放電對擴(kuò)展青霉孢子的殺滅研究中也表明，正常的擴(kuò)展青霉孢子形狀為橢圓形，表面完整光滑；而經(jīng)電暈放電處理的孢子，細(xì)胞膜被破壞，孢子表面出現(xiàn)很多深孔，孢子形狀變得不規(guī)則。Luo Ying等[36]用掃描電子顯微鏡對吸附展青霉素的酵母細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果表明正常的酵母細(xì)胞在掃描電子顯微鏡下表現(xiàn)為完整的圓形或橢圓形。經(jīng)沿面放電低溫等離子體處理3 min后，可明顯觀察到部分霉菌孢子細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)外溢，細(xì)胞表面皺縮、凹陷[37]，失去原有形態(tài)，還有部分細(xì)胞破碎后僅殘存一些細(xì)胞碎片[24]（圖9B、D），這與Ye Shengying等[35]用電暈放電處理擴(kuò)展青霉孢子效果一致。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)中采用的是一種新型的介質(zhì)阻擋放電方式——?dú)怏w沿面放電。在電源電壓20.3 kV、頻率50 Hz、氣體流量160 L/h、處理時間30 min的條件下，氣體沿面放電對液體樣品中擴(kuò)展青霉CICC 40658和F-LPH10-06孢子有很好的殺菌效果。電源電壓、處理時間、孢子的不同初始濃度都是氣體沿面放電低溫等離子體殺菌效果的有效影響因素。在其他條件不變的情況下，延長作用時間或是增大放電電壓都能使更多的能量[33-34]、ROS、RNS、帶電粒子注入到反應(yīng)器中，從而增大與孢子細(xì)胞的作用幾率，導(dǎo)致樣品中孢子殺滅效果增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，降低樣品中的孢子濃度，可以明顯縮短殺菌時間，主要是因?yàn)楫?dāng)孢子濃度降低后，平均作用于單個孢子的能量會相應(yīng)提高，從而使得孢子能更快地被殺死。除此之外，反應(yīng)器的規(guī)格（如螺旋電極的長度[38-40]、低壓電極結(jié)構(gòu)[38]、曝氣孔的大小[39]、氣體流速[40]）也是影響反應(yīng)體系殺菌效果的重要因素。本實(shí)驗(yàn)中采用的是固定參數(shù)的放電電極，在未來的研究中可以通過改變電極參數(shù)來檢測殺菌效果。

低溫等離子體所包含的成分復(fù)雜，其滅菌的機(jī)理包括放電過程中產(chǎn)生的帶電粒子和高能電子對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生的蝕刻作用[33]；羥自由基、原子氧、O3、H2O2等ROS的氧化作用[26]、紫外光的物理輻射作用[27-28]以及RNS和其在水中副產(chǎn)物（NO2-、NO3-）的酸化作用[41]。Moisan等[42]認(rèn)為活性粒子和紫外輻射在放電的過程中破壞了微生物的細(xì)胞膜化學(xué)成分及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)，起了主要的殺菌作用。放電氣體和放電方式不同，在放電過程中發(fā)揮主要作用的物質(zhì)也不相同。所以究竟是哪種物質(zhì)在滅菌過程中起主要作用，目前還沒有明確的結(jié)論。掃描電子顯微鏡的結(jié)果顯示，經(jīng)低溫等離子體處理過的孢子表面出現(xiàn)了明顯的皺縮、凹陷，也有部分孢子在高壓放電后細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂成碎片，表明了沿面放電主要是通過破壞正常的菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)殺菌的。李兆杰等[24]在輝光放電低溫等離子體技術(shù)對微生物的殺菌動力學(xué)及殺菌機(jī)制研究中指出，由于放電氣體為氬氣，不存在ROS的氧化作用，引起細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂的主要原因是帶電粒子和高能電子的蝕刻作用。張錚等[34]通過介質(zhì)阻擋放電空氣等離子體對金黃色葡萄球菌殺滅效果及機(jī)理的研究，也得出了相同的結(jié)論。至于是蝕刻作用、氧化作用還是紫外輻射作用，還需在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明。

與傳統(tǒng)的加熱殺菌和化學(xué)消毒方法相比，沿面放電低溫等離子體殺菌技術(shù)具有安全、快速、低溫、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[38]，擁有較大的研究價值和應(yīng)用前景。目前，低溫等離子體滅菌技術(shù)作為一種新型的低溫滅菌方法在皮膚組織的消毒[33]及有害染料的降解[29]等方面得到了廣泛的應(yīng)用并取得了良好的效果，在未來的研究中應(yīng)該擴(kuò)大低溫等離子滅菌技術(shù)在食品行業(yè)的應(yīng)用范圍；在已有報道中，大多學(xué)者專家的研究對象主要集中在細(xì)菌和酵母，對霉菌的研究較少，因此要進(jìn)一步擴(kuò)大菌種的研究范圍。同時，為了探究低溫等離子體引起細(xì)胞死亡的原因，也要對等離子體的滅菌機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Killing Effect of Low-Temperature Plasma Generated by Gas Phase Surface Discharge on Penicillium expansum Spores

PAN Chunqing1, YUE Tianli1, WANG Tiecheng2, WANG Yuan1, YUAN Yahong1,*, LI Yujuan2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;2. College of Natural Resources and Environment, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Objective: This study was conducted to evaluate the fungicidal effect of low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge on the spores of Penicillium expansum. Methods: Two strains (CICC 40658 and F-LPH10-06)of P. expansum were used to investigate their growth and patulin-producing characteristics in potato dextrose broth medium. Low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge sterilizer was developed and used to study the effect of treatment time, power supply voltage and initial spore concentration on its fungicidal effect against P. expansum.Furthermore, the morphological changes of P. expansum spores were characterized using scanning electron microscopy(SEM). Results: The biomass (dry weight) of P. expansum CICC 40658 and F-LPH10-06 were 28.6 and 128.7 mg after 14 days of culture, respectively. The concentration of patulin produced by P. expansum F-LPH10-06 was 147.97 mg/L at the end of incubation, which was nearly 162 times higher than that produced by CICC 40658 (912.40 μg/L). CICC 40658 at an initial concentration of 3.4 × 106spores/mL could be completely killed after 21 min treatment by low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge. For F-LPH10-06 (1.5 × 106spores/mL), a reduction of 4.58 lg(spores/mL) was observed after treatment for 30 min. In addition, the fungicidal effect was enhanced with the increase in discharge voltage or decrease in initial spore concentration after the same treatment time. SEM observation showed that the morphology of spores changed after treatment, which may be related to the charged particles with high energy and reactive oxygen species produced during high voltage discharge. Conclusion: Low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge has strong fungicidal effect against P. expansum, which may provide an important theoretical basis for the development and application of low-temperature sterilization technology.

low-temperature plasma; gas phase surface discharge; Penicillium expansum; fungicidal effect; patulin

2016-08-14

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371814）；國家科技基礎(chǔ)性研究專項(xiàng)（2013FY113400）

潘春青（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩刂萍夹g(shù)。E-mail：pancq326@163.com

*通信作者：袁亞宏（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭こ谈咝录夹g(shù)、食品發(fā)酵工程及食品安全控制技術(shù)。E-mail：yuanyh@nwsuaf.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201721001

TS201.3；TS255.44

A

1002-6630（2017）21-0001-07

潘春青, 岳田利, 王鐵成, 等. 氣體沿面放電低溫等離子體對擴(kuò)展青霉孢子殺滅效果[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 1-7.

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PAN Chunqing, YUE Tianli, WANG Tiecheng, et al. Killing effect of low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge on Penicillium expansum spores[J]. Food Science, 2017, 38(21): 1-7. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721001. http://www.spkx.net.cn