付遠志,胡根海,張許柯,雷硯峰,楊靖,孫海燕

利用正交設(shè)計優(yōu)化倒掛金鐘的增殖培養(yǎng)

付遠志1,2,胡根海1,2,張許柯1,2,雷硯峰1,2,楊靖1,2,孫海燕1,2

（1.河南科技學(xué)院棉花研究所,河南新鄉(xiāng)453003；2.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003）

為了獲得倒掛金鐘中間繁殖體增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基,采用L9（34）正交試驗,選用MS為基本培養(yǎng)基,比較分析3種重要因素6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（α-奈乙酸）和蔗糖,在不同質(zhì)量濃度下對倒掛金鐘叢生芽增殖的影響.結(jié)果表明：培養(yǎng)基中6-BA、NAA、蔗糖的質(zhì)量濃度分別為1.5 mg/L、0.05 mg/L、30 g/L時,對倒掛金鐘分化和增殖的效果最好,各因素對增殖作用的影響主次水平依次為蔗糖＞6-BA＞NAA.蔗糖質(zhì)量濃度過高易導(dǎo)致叢生芽褐化,過低易導(dǎo)致叢生芽玻璃化、黃化；6-BA和NAA質(zhì)量濃度過低時,易導(dǎo)致叢生芽褐化,6-BA質(zhì)量濃度高時易導(dǎo)致叢生芽玻璃化.試驗確立了倒掛金鐘中間繁殖體增殖的最優(yōu)方案.

倒掛金鐘；增殖；快繁

倒掛金鐘（Fuchsia hybida）又名吊鐘海棠、燈籠花,柳葉菜科,倒掛金鐘屬,原產(chǎn)南美洲的秘魯、北美洲的墨西哥等熱帶高原地區(qū),為落葉亞灌木狀多年生草本,株高50～80 cm,花萼和花瓣有紅、粉、紫等顏色,整個花朵下垂,形似吊鐘[1],是很好的園藝花卉觀賞資源.倒掛金鐘常規(guī)條件下大多扦插繁殖[2-3],但扦插繁殖其增殖系數(shù)低,速度慢,且受季節(jié)限制,繁殖周期長,不利于工廠化育苗.通過倒掛金鐘的組織培養(yǎng)能提高增殖效率,解決以上難題,但目前倒掛金鐘的組培快繁報道非常少[4],研究的內(nèi)容也很有限,尚未深入研究其增殖快繁要素.

植物組織或細胞在離體培養(yǎng)條件下,通常需要添加外源生長素和細胞分裂素,來調(diào)節(jié)內(nèi)源激素平衡和代謝,促進器官的形態(tài)建成.生長素和細胞分裂素的比例在植物組織培養(yǎng)中對增殖效果起著至關(guān)重要的作用,細胞分裂素配合一定比例的生長素有利于外植體的增殖,植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA在植物組織培養(yǎng)中一直廣為應(yīng)用.如張紅兵等[5]研究發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛莖段腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 3.0 mg/L,誘導(dǎo)率達到95%；NAA與6-BA配合可顯著促進高山紅景天雄株葉片愈傷組織的生長和分化[6-7]；當(dāng)6-BA和NAA的質(zhì)量濃度分別為4.0 mg/L、0.2 mg/L時最有利于鳳頭姜試管苗的增殖[8]；在MS培養(yǎng)基中加入NAA能顯著促進大櫻桃組培苗的生根[9]；金花等[10]研究發(fā)現(xiàn),KC培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L的NAA和0.5 mg/L的BA可顯著促進玉花蘭根狀莖的增殖.有研究表明,在激素水平不變的條件下,合理的蔗糖用量也可以大大提高叢芽的增殖率和試管苗的生根率[11].

植物組織培養(yǎng)中,除了要盡量提高叢芽的增殖率外,還要重點防范經(jīng)常出現(xiàn)的褐化、污染以及玻璃化問題[12-13].褐化主要是由于酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下被氧化形成醌而引起的[14].董艷山[15]研究發(fā)現(xiàn),蔗糖是影響褐化的主要因素,且濃度越高越容易引起紅豆杉細胞培養(yǎng)的褐化,可能是因為蔗糖促進了酚類化合物的氧化.而合適比例的細胞分裂素和生長素可以抑制褐化的產(chǎn)生[16-17].玻璃化苗由于其組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常,分化增殖能力低且生根困難,嚴重影響著組培苗的規(guī)?；a(chǎn).

本試驗選取影響增殖的常見重要因素6-BA、NAA和蔗糖,利用正交設(shè)計,優(yōu)化倒掛金鐘的增殖培養(yǎng)基,了解倒掛金鐘的褐化和玻璃化規(guī)律,以期為倒掛金鐘快繁的集約化、工廠化生產(chǎn)提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

市場出售的盆栽倒掛金鐘.

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理 剪取當(dāng)年生的倒掛金鐘幼嫩枝條,去除枝條上帶有的葉子以及葉柄.將剪下的枝條用質(zhì)量分數(shù)為1%的洗衣粉溶液洗去表面殘留的泥土和灰塵,然后放在自來水下沖洗30 s,將洗干凈的枝條放入培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)入超凈工作臺.在超凈工作臺中首先用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液浸泡枝條30 s,然后用無菌水沖洗3～5次,再用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的氯化汞溶液消毒8 min,用無菌水沖洗4～6次.將經(jīng)過初步處理的枝條轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中,然后用無菌濾紙吸干枝條表面殘留的無菌水.切掉枝條兩端受傷比較嚴重的部分,余下的部分剪成帶1～2個腋芽的莖段接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng),30 d后獲得無菌叢生芽,作為正交試驗的外植體.

1.2.2 培養(yǎng)基配制與接種以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,添加適量瓊脂,采用L9（34）設(shè)計三因素三水平（見表1）的正交試驗,考察不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA、蔗糖對倒掛金鐘不定芽增殖的影響.培養(yǎng)基配制后,調(diào)節(jié)pH值為5.8,分裝完成后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌（121℃,20 min）.在超凈工作臺上,將經(jīng)腋芽誘導(dǎo)萌發(fā)產(chǎn)生的無菌叢生芽切割下來,挑選1.5～2.0 cm長度、生長比較健壯且長勢較一致的腋芽切下,盡量使腋芽基部保持完整,接入冷卻后的培養(yǎng)基中,每瓶接入3個腋芽,每種培養(yǎng)基接6瓶,重復(fù)3次.材料接種后,在培養(yǎng)溫度為25±1℃,光照強度為2 000 lx,光照時間為12 h/d的條件下培養(yǎng).每隔10 d觀察記錄一次,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計結(jié)果.

表1 增殖培養(yǎng)基L9（34）正交設(shè)計的因素與水平Tab.1 Factors and levels ofL9（34）orthogonal design for value-added medium

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel整理數(shù)據(jù),SPSS19.0軟件進行極差分析和方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體生長狀況

不同激素配比處理倒掛金鐘30 d后不定芽的增殖情況見表2.

表2 不同激素配比處理倒掛金鐘的不定芽增殖情況Tab.2 The added value offuchsia under different ratioofhormone

接種培養(yǎng)10 d后觀察發(fā)現(xiàn),各培養(yǎng)基配方中的植株長勢已經(jīng)有非常明顯的變化.其中,3號、7號、9號培養(yǎng)基中的植株抽生出較多腋芽,且葉片濃綠,整體較健壯；1號和5號培養(yǎng)基中的植株與試驗初始相比有稍微增殖現(xiàn)象；2號和6號培養(yǎng)基中的植株大部分葉片發(fā)黑枯死,長勢比較弱；4號和8號培養(yǎng)基中的植株葉片稀疏.接種培養(yǎng)20 d后觀察發(fā)現(xiàn),不同培養(yǎng)基配方中的植株長勢已經(jīng)拉開比較明顯的差距,并且與10 d時的觀察結(jié)果有所不同.1號、6號、8號培養(yǎng)基中的植株葉片邊緣黃化嚴重,大且稀疏,新生葉比較少；3號、4號、5號、7號培養(yǎng)基中的植株長勢比較均勻,葉片濃綠,分化出較多的腋芽,長勢健壯；2號和9號培養(yǎng)基中的植株與上次的觀察結(jié)果相比,無明顯的增殖現(xiàn)象,但葉片顏色變?yōu)榈G色.接種培養(yǎng)30 d后觀察發(fā)現(xiàn),增殖倍數(shù)和生長狀況較好的培養(yǎng)基配方有4號、5號、3號,小苗長勢健壯,葉片濃綠較大；而8號、1號、6號培養(yǎng)基中的植株增殖率最低,生長狀況也最差.由觀察可知4號培養(yǎng)基配方為最佳,即6-BA、NAA、蔗糖的質(zhì)量濃度分別為1.5 mg/L、0.05 mg/L、30 g/L時,倒掛金鐘外植體的生長狀況最佳（見表 2）.

2.2 極差分析

正交試驗的極差分析結(jié)果見表3.

K值、k值反映了某一因素在不同質(zhì)量濃度時對倒掛金鐘叢生芽增殖作用的大小,K值或k值最大的一項為該因素的最佳質(zhì)量濃度[5].從表3可以看出,A2、B1、C23個水平對應(yīng)的K值或k值均最大,說明6-BA、NAA、蔗糖質(zhì)量濃度分別為1.5 mg/L、0.05 mg/L、30 g/L時對倒掛金鐘叢生芽增殖的促進作用最大.極差值R越大,說明某一因素的質(zhì)量濃度變化對試驗結(jié)果的影響也越大.從極差值來看,對倒掛金鐘影響最重要的因素是蔗糖,在20 g/L的各組合培養(yǎng)基中新生莖節(jié)數(shù)最少,增殖效果基本不明顯,隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加,叢生芽增殖系數(shù)逐漸增大,但當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度大于30 g/L時,增殖系數(shù)有所下降；其次為6-BA,在相同蔗糖質(zhì)量濃度配比的情況下,1.5 mg/L的6-BA更有助于倒掛金鐘叢生芽的分化；而NAA的影響作用很小.從增殖倍數(shù)看,4號培養(yǎng)基中倒掛金鐘叢生芽的增殖倍數(shù)最高,為5.06倍.因此,可以得出倒掛金鐘叢生芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組合為A2B1C2,即最佳配比中6-BA、NAA、蔗糖的質(zhì)量濃度分別為1.5 mg/L、0.05 mg/L、30 g/L,和觀察結(jié)果一致.

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3 Results oforthogonal esperiment

2.3 方差分析

為進一步探討處理間及各因子水平之間的差異,故進行方差分析,結(jié)果見表4.

表4 方差分析Tab.4 Variance analysis

由表4中的F檢驗結(jié)果可知,C因素質(zhì)量濃度水平對倒掛金鐘叢生芽增殖有極顯著影響,A因素質(zhì)量濃度水平有顯著影響,而B因素質(zhì)量濃度水平對增殖的影響不明顯,兩個區(qū)組間差異極顯著.即蔗糖質(zhì)量濃度變化對倒掛金鐘的增殖效果有非常明顯的作用,6-BA質(zhì)量濃度變化對倒掛金鐘增殖作用顯著,NAA質(zhì)量濃度水平對倒掛金鐘增殖無明顯作用.

3 結(jié)論與討論

本試驗以MS為基本培養(yǎng)基,選取影響倒掛金鐘快繁的3種重要因素6-BA、NAA與蔗糖,通過正交試驗得出最佳增殖培養(yǎng)基中6-BA、NAA、蔗糖的質(zhì)量濃度分別為1.5 mg/L、0.05 mg/L、30 g/L,各因素對增殖作用影響的主次水平依次為蔗糖＞6-BA＞NAA.另外,蔗糖質(zhì)量濃度過高則組培苗容易褐化,過低則組培苗容易玻璃化、黃化；6-BA和NAA比例過低時,組培苗容易褐化,6-BA質(zhì)量濃度高時組培苗容易玻璃化.本研究為倒掛金鐘的增殖快繁及工廠化育苗提供了重要的理論依據(jù).

方差分析結(jié)果顯示,蔗糖在倒掛金鐘組織培養(yǎng)中,起著非常顯著的作用.較低質(zhì)量濃度（20 g/L）時會不利于組培苗的正常生長,在培養(yǎng)初期就開始抑制組培苗的正常生長,不僅增殖系數(shù)過低,莖節(jié)間距大,還會出現(xiàn)嚴重的玻璃化、黃化現(xiàn)象；而較高質(zhì)量濃度（40 g/L）時則會抑制組培苗的增殖作用；以30 g/L的蔗糖增殖效果最好,此時組培苗植株健壯,長勢旺盛,抽生出較多新芽且葉片顏色較綠.

試驗觀察還發(fā)現(xiàn),當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度過高,或6-BA與NAA質(zhì)量濃度比值過低時,組培苗就會出現(xiàn)比較嚴重的褐化.蔗糖質(zhì)量濃度過低或6-BA質(zhì)量濃度過高,也會導(dǎo)致組培苗一定程度的玻璃化,這與韓淑蘭等[18]、張春華等[19]的結(jié)果一致.蔗糖質(zhì)量濃度過低會導(dǎo)致培養(yǎng)基的滲透勢較低,因此容易引起玻璃化,而6-BA或許從激素水平調(diào)控了玻璃化.

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Optimization for propagation culture of Fuchsia hybida on orthogonal design

FU Yuanzhi1,2,HU Genhai1,2,ZHANG Xuke1,2,LEI Yanfeng1,2,YANG Jing1,2,SUN Haiyan1,2
（1.Cotton Research Institute,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China；2.Collaborative Innovation Center ofModern Biological Breeding,Henan Province,Xinxiang453003,China）

The rapid propagation of Fuchsia hybida in vitro was studied to gain the optimal formula of three main factors that influencing the propagule value-added in this paper.According to the L9（34） orthogonal test table,MS medium was used as basic medium,three factors of 6-BA,NAA and sucrose under different concentrations were analyzed the effect to F.hybida bud value-added.The results showed that the medium 6-BA（1.5 mg/L）,NAA（0.05 mg/L）,sucrose （30 g/L） was the best one for F.hybida differentiation and proliferation,and it was concluded that different factors on the value-added role of primary and secondary level,followed by sucrose,6-BA and NAA.Another high sucrose concentration was easy to go brown,low concentration easy vitrification,yellow；It was easy to go brown when the proportion of 6-BA and NAA was too low,the vitrification was easy when 6-BA concentration was high.So the optimal solutions for the F.hybida rapid propagation was established.

Fuchsia hybida；propagation；rapid propagation

S685.99

A

1008-7516（2017）05-0016-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.05.003

2017-07-05

河南省科學(xué)技術(shù)研究重點項目（14A210006）

付遠志（1978―）,女,河南睢縣人,碩士,實驗師.主要從事生物技術(shù)育種研究.

（責(zé)任編輯：鄧天福）