田有秋， 武奔月， 謝廣杰， 吳 昊， 賈金霞， 束 旭， 王昱灃,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 南京 210095；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院， 江蘇 南京 211800)

一種淡紅側(cè)耳多糖的制備工藝

田有秋1， 武奔月1， 謝廣杰1， 吳 昊2， 賈金霞1， 束 旭1， 王昱灃1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 南京 210095；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院， 江蘇 南京 211800)

研究了淡紅側(cè)耳多糖的提取工藝條件，并對其進(jìn)行脫色脫蛋白處理。以單因素實驗為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化多糖的提取條件；選用大孔陰離子交換樹脂D315脫色、Sevage法脫蛋白。建立的淡紅側(cè)耳多糖較佳提取工藝條件為提取溫度95 ℃，提取時間3.9 h，固液比(g∶mL)1∶30.6，在此條件下淡紅側(cè)耳多糖的平均得率為13.44%；D315的脫色率為81.37%，多糖保留率為82.21%；Sevage法蛋白脫除率為61.39%，多糖保留率為93.29%。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化及脫色脫蛋白處理，可獲得得率高且色素蛋白含量低的淡紅側(cè)耳多糖。

淡紅側(cè)耳； 多糖； 優(yōu)化； 脫色; 脫蛋白

淡紅側(cè)耳隸屬擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬[1]，別名桃紅側(cè)耳、紅平菇。其色鮮味美，且具有蟹香[2]；蛋白質(zhì)、粗纖維含量豐富，分別為22.55%、32.40%，且富含維生素和氨基酸[3]。淡紅側(cè)耳子實體多糖是淡紅側(cè)耳的重要活性成分，具有抗氧化等活性[4]。目前國內(nèi)外對淡紅側(cè)耳的研究主要集中在菌絲體多糖[5-7]、深層發(fā)酵[8]、馴化栽培[9-11]、產(chǎn)漆酶活性[12]、營養(yǎng)成分分析[13-16]以及采用原生質(zhì)體技術(shù)選育優(yōu)良菌株[17-19]等方面。

淡紅側(cè)耳作為一種兼食用、藥用及觀賞的食用菌正在逐步被人們所接受，研究其深加工有利于拓寬淡紅側(cè)耳的商業(yè)用途及推廣價值。本研究建立其子實體多糖的較佳提取工藝，并對其進(jìn)行脫色脫蛋白，為淡紅側(cè)耳多糖的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡紅側(cè)耳，購于廣東銀新現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司；無水乙醇，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸和苯酚，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；丙酮和無水乙醚，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RHP- 400型打粉機(jī)，浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海維誠儀器有限公司；TDZ5-WS型低速離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠； EU-2600R型紫外可見分光光度計，上海昂拉儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1工藝流程

取淡紅側(cè)耳子實體干品250.0 g，用清水洗凈，室溫自然干燥后，于80 ℃烘箱中烘干；置于打粉機(jī)中粉碎2 min。取2.0 g細(xì)粉，以蒸餾水為溶劑，按設(shè)定條件(固液比、提取溫度、提取時間)進(jìn)行多糖提取。將提取后的混合液進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，時間為10 min)，收集上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中(45 ℃)濃縮至約20 mL。將3倍體積的95%乙醇加入到濃縮液中(邊加邊攪拌)，得茶褐色絮狀沉淀，于4 ℃冰箱中靜置12 h。將無水乙醇、丙酮、無水乙醚依次加入到醇沉液中，進(jìn)行抽濾，重復(fù)此操作3次，抽濾完成后得灰白色粗多糖，置于干燥器中備用。將粗多糖用蒸餾水復(fù)溶，在設(shè)定條件下脫色、脫蛋白；將脫色、脫蛋白后的多糖液旋蒸濃縮至約20 mL，去離子水透析24 h后，于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得子實體粗多糖。

1.3.2多糖的提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素實驗

固定3 h和85 ℃的提取條件，研究固液比(g∶mL)1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60(即淡紅側(cè)耳粉末質(zhì)量與蒸餾水體積的比例)對得率的影響；固定1 ∶30和85 ℃ 的提取條件，研究時間1，2，3，4 h對得率的影響；固定1∶30和3 h的提取條件，研究溫度75，80，85，90，95 ℃對得率的影響。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗

通過分析單因素實驗結(jié)果，分別選擇固液比、提取溫度以及提取時間的某一水平作為響應(yīng)面試驗的中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

1.3.2.3 多糖含量測定和得率計算

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚硫酸法，在490 nm處測定吸光度，并以吸光度對葡萄糖質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸分析，得回歸方程y=0.015 4x-0.005 6(R2=0.999 4)；將淡紅側(cè)耳粗多糖用蒸餾水復(fù)溶，稀釋至0.05 mg/mL，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖的質(zhì)量濃度C。按式(1)計算多糖得率。

(1)

式(1)中，C為多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為粗多糖的稀釋后體積，mL；M為提取所用淡紅側(cè)耳粉的質(zhì)量，g。

1.3.3多糖的脫色

選用大孔陰離子交換樹脂D315對多糖進(jìn)行動態(tài)脫色。按較佳提取條件制備粗多糖，配制1 mg/mL的粗多糖溶液；將大孔樹脂濕法裝柱，分別考察上樣流速10，30，50，70 mL/h對脫色率和多糖保留率的影響；選取較佳上樣流速，考察上樣體積對脫色率和多糖保留率的影響。

在450 nm下，分別測定多糖溶液脫色前后的吸光度，按式(2)計算脫色率，式(3)計算多糖保留率。

(2)

(3)

式(2)中，A為吸光度值；式(3)中，m為多糖的質(zhì)量，mg。

1.3.4多糖的脫蛋白

采用Sevage法對脫色后的多糖溶液進(jìn)一步脫蛋白。將多糖溶液與Sevage試劑按4∶1(體積比)混合，于磁力攪拌器中混勻30 min，5 000 r/min離心后，靜置于分液漏斗中，收集上層溶液，重復(fù)上述步驟，直至中間層無變性蛋白產(chǎn)生，測定脫蛋白率和多糖保留率。

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，在595 nm處測定吸光度，并以吸光度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸分析，得回歸方程y=0.005x-0.021 5(R2=0.991 4)；取脫蛋白后的多糖溶液，稀釋至0.1 mg/mL，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量，按式(4)計算蛋白脫除率，式(3)計算多糖保留率。

(4)

式(4)中，m為蛋白質(zhì)的質(zhì)量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實驗的均值；SAS 8.0進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)，Design-Expert 7.1.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，Orgin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1固液比對多糖得率的影響

在提取溫度85 ℃、提取時間3 h的條件下，研究不同固液比對多糖得率影響的實驗結(jié)果，見圖1。

不同小寫字母表示不同固液比之間在p<0.05水平上有顯著性差異。圖1 固液比與多糖得率的關(guān)系Fig.1 Effect of solid-liquid ratios on extraction yield of polysaccharide

由圖1可知，固液比為1∶50時的多糖得率與1∶60 g/mL時的得率相比無顯著性差異(p>0.05)，但與1∶20，1∶30，1∶40時的得率相比差異顯著；固液比1∶20，1∶30，1∶40之間的得率差異顯著(p<0.05)。當(dāng)固液比較低時，淡紅側(cè)耳細(xì)粉與水不能充分混合，使多糖得率較低；當(dāng)固液比從1∶20變化到1∶40時，得率從4.28%增加到9.88%；固液比繼續(xù)增加，多糖得率開始下降，可能原因是旋蒸時損失了一部分多糖，也可能是在水浴浸提過程中，多糖由于不均勻吸熱而溶解不完全所致[20]，因此1∶40為多糖提取的較佳固液比。

2.1.2提取溫度對多糖得率的影響

在固液比1∶30、提取時間3 h的條件下，研究不同提取溫度對多糖得率影響的實驗結(jié)果，見圖2。

不同小寫字母表示不同提取溫度之間在p<0.05水平上有顯著性差異。圖2 提取溫度與多糖得率的關(guān)系Fig.2 Effects of temperature on extraction yield of polysaccharide

由圖2可知，提取溫度為80, 85, 95 ℃時的多糖得率之間無顯著性差異(p>0.05)，但與75 ℃和95 ℃時的得率相比差異顯著(p<0.05)。溫度從75 ℃升高到90 ℃時，多糖得率逐漸增加；繼續(xù)升高到95 ℃時，得率從90 ℃時的11.26%下降到10.54%，這可能是部分多糖在高溫下結(jié)構(gòu)被破壞所致。因此90 ℃為較佳提取溫度。

2.1.3提取時間對多糖得率的影響

在固液比1∶30、提取溫度85 ℃的條件下，研究不同提取時間對多糖得率影響的實驗結(jié)果，見圖3。

不同小寫字母表示不同提取時間之間在p<0.05水平上有顯著性差異。圖3 提取時間與多糖得率的關(guān)系Fig.3 Effects of time on extraction yield of polysaccharide

由圖3可知，提取時間為3 h和4 h時的多糖得率之間無顯著性差異(p>0.05)，但與1 h和2 h時的得率相比差異顯著(p<0.05)。提取時間少于3 h時，隨時間增加的同時，多糖得率持續(xù)增加；3 h時達(dá)到10.66%；4 h時，得率下降到10.10%，可能由于提取時間過長部分多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致得率變低。因此3 h為多糖提取的較佳提取時間。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及數(shù)據(jù)分析

對單因素實驗結(jié)果進(jìn)行分析，將1∶40，90 ℃，3 h作為固液比、提取溫度和提取時間在響應(yīng)面試驗中的中心點(diǎn)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以多糖得率為響應(yīng)值。利用Design-Expert 7.1.6對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，見表1。

2.2.2回歸方程及方差分析

通過對表1中多糖得率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得回歸方程：R=6.34+0.011A+0.37B+0.070C-0.17AB-0.32AC+0.24BC-0.24A2-0.28B2-0.33C2，可通過此方程來預(yù)測多糖得率。

由方差分析結(jié)果可知，模型p<0.000 1，且相關(guān)系數(shù)R=0.997 1，說明回歸模型極顯著；失擬項p=0.221 9>0.05，說明失擬項不顯著，即得率的實際值高度擬合于經(jīng)軟件計算所得的預(yù)測值。

由各因素及其交互項的p值，可得其對多糖得率的影響程度大小。其中因素A即固液比的p=0.546 5>0.05，說明固液比對多糖得率影響不顯著；因素C即提取時間的p=0.005 6<0.01；交互項AB的p=0.000 2<0.01；其余各項的p值均小于0.000 1，即影響顯著。所以，對各因素及交互項影響多糖得率的程度由大到小依次為：B，AC，BC，A2，B2，C2，AB，C，A。由于各交互項和二次項均對多糖得率有影響且影響顯著，說明各因素并不是單一影響著得率的大小，而是存在著交互作用。

2.2.3驗證實驗結(jié)果分析

利用Design-Expert 7.1.6軟件分析可得，淡紅側(cè)耳多糖的較佳提取條件為提取時間3.91 h，固液比1∶30.62，提取溫度95 ℃；理論最大得率為13.28%。為了方便實驗操作，將其修改為：提取時間3.9 h，固液比1∶30.6，提取溫度95 ℃；在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，得率均值為13.44%，與理論值僅相差1.19%，說明實驗建立的模型較準(zhǔn)確。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3 多糖脫色條件的確定

2.3.1上樣流速對脫色效果的影響

不同上樣流速對多糖脫色率和保留率影響的實驗結(jié)果，分別見圖4和圖5。

圖4 上樣流速與脫色率的關(guān)系Fig.4 Effect of sample loading flow rates on decolorization rate

圖5 上樣流速與多糖保留率的關(guān)系Fig.5 Effect of sample loading flow rates on polysaccharide retention rate

由圖4和圖5可以看出，在同一上樣體積下，上樣流速越快，多糖的脫色率越小，而多糖保留率越大。這是由于流速越快，多糖與樹脂接觸越不充分所致。綜合脫色率和多糖保留率兩個指標(biāo)，選擇30 mL/h作為上樣流速。

2.3.2上樣體積對脫色效果的影響

在上樣流速為30 mL/h的條件下，不同上樣體積對多糖脫色率和保留率影響的實驗結(jié)果，見圖6。

圖6 上樣體積與脫色效果的關(guān)系Fig.6 Effect of sample loading amounts on decolorization effect

如圖6，隨著上樣體積的不斷增加，脫色率逐漸降低，而多糖保留率則逐漸增加。當(dāng)上樣體積為80 mL時，脫色率為81.37%，多糖保留率為82.21%；上樣體積繼續(xù)增加時，脫色率繼續(xù)降低，而且多糖保留率增加不明顯，所以選取80 mL為較佳上樣體積。大孔樹脂在脫色的同時也能脫蛋白，在上樣流速30 mL/h、上樣體積80 mL的條件下，蛋白質(zhì)的脫除率為76.68%。

2.4 多糖脫蛋白條件的確定

經(jīng)大孔陰離子交換樹脂D315脫色后，多糖的蛋白含量為5.62%。為進(jìn)一步降低蛋白含量，在此基礎(chǔ)上，采用Sevage法繼續(xù)脫蛋白，經(jīng)5次處理后，蛋白脫除率達(dá)61.39%，多糖保留率為93.29%，此時的蛋白含量僅為2.17%。

3 結(jié) 論

多糖的得率受多種條件的影響，綜合考慮了固液比，提取溫度和提取時間，通過單因素實驗及響應(yīng)面試驗對淡紅側(cè)耳多糖的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，經(jīng)響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取條件后，多糖得率可以達(dá)到13.44%，較大地提高了多糖的得率。多糖中色素和蛋白質(zhì)的存在不僅會使多糖的純度降低，還會阻礙多糖的進(jìn)一步研究，經(jīng)大孔樹脂脫色后，多糖的脫色率為81.37%，保留率為82.21%，多糖由茶褐色變?yōu)榻咏鼰o色；脫色的同時還可脫除部分蛋白，經(jīng)Sevage法繼續(xù)脫蛋白后，多糖中的蛋白含量僅為2.17%。本實驗研究結(jié)果有利于對淡紅側(cè)耳多糖的深入研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

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StudyonPreparationTechnologyofPolysaccharidefromPleurotusdjamor

TIAN Youqiu1, WU Benyue1, XIE Guangjie1, WU Hao2, JIA Jinxia1, SHU Xu1, WANG Yufeng1,*
(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,NanjingAgricultureUniversity,Nanjing210095,China;2.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing211800,China)

In this study, the extraction of polysaccharides fromPleurotusdjamorand its decolorization and deproteinization were investigated. The optimal extraction conditions were obtained by RSM. Macroporous anion exchange resin D315 was used to decolorize polysaccharides and moreover Sevage method was adopted to deproteinize it. The optimum extraction conditions were as followed: temperature 95 ℃, time 3.9 h, and the solid-liquid ratio 1∶30.6 (g∶mL). Under these conditions, the yield was 13.44 %. Decoloration rate of D315 was 81.37% and polysaccharide retention rate was 82.21%. While the deproteinization rate was 61.39% and polysaccharide retention rate was 93.29%.Pleurotusdjamorpolysaccharide with a high yield and a low content of pigment and protein could be obtained by the established extraction process, decolorization and deproteinization together.

Pleurotusdjamor; polysaccharides; optimization; decolorization; deproteinization

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.05.012

2095-6002(2017)05-0072-06

田有秋，武奔月，謝廣杰，等. 一種淡紅側(cè)耳多糖的制備工藝[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2017,35(5):72-77.

TIAN Youqiu, WU Benyue, XIE Guangjie, et al. Study on preparation technology of polysaccharide fromPleurotusdjamor[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(5):72-77.

TS201.2

A

2017-05-11

江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(SBK2017020717)；江蘇省科技項目蘇北科技專項(BN2015071)；江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻新項目(BY2014005-07)。

田有秋，女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)與工程；

*王昱灃，男，副教授，博士，主要從事生物工程和食品科學(xué)方面的研究工作，通信作者。

(責(zé)任編輯：李 寧)