章銀良 ，蔡亞玲 ，李 鑫

（1.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；

2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

L-賴氨酸-D-阿拉伯糖美拉德反應產(chǎn)物抗氧化活性研究

章銀良1，2，蔡亞玲1，2，李 鑫1

（1.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；

2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

以DPPH自由基清除率和還原力作為美拉德反應產(chǎn)物（MRPs）抗氧化活性指標分析模擬體系L-賴氨酸-D-阿拉伯糖MRPs的抗氧化活性?？疾炝瞬煌绊懸蛩兀ǚ磻獪囟?、反應時間、反應初始pH和反應底物物質(zhì)的量之比）對MRPs抗氧化活性的影響，再通過均勻試驗得到最佳工藝條件。通過單因素和均勻試驗分析，確定了該模擬體系在溫度110℃、反應時間68 min、反應初始pH為8、反應底物物質(zhì)的量之比為1∶2的條件下，MRPs對DPPH自由基的清除率由原來的80.69%提高到89.81%，其抗氧化活性增強。

L-賴氨酸；D-阿拉伯糖；MRPs；抗氧化活性

0 引言

隨著健康飲食觀念的不斷普及，人們對食品的質(zhì)量與安全問題也越發(fā)重視。而食品在加工和貯藏過程中，會不斷地和空氣中的氧氣發(fā)生氧化反應，從而導致食品中的油脂酸敗、褐變及營養(yǎng)物質(zhì)損失，甚至會產(chǎn)生影響人體健康的物質(zhì)，食品的營養(yǎng)價值不僅會因此降低，而且其安全性也會受到影響。為了防止食品在加工過程中的氧化腐敗，延長食品的貯藏期，在食品中添加具有抗氧化活性的天然物質(zhì)已成為科研工作者的主要研究方向。

美拉德反應（Maillard reaction，MR）是一種非常普遍的非酶褐變反應，游離的氨基和羰基是MR過程的主要參與者。MR會產(chǎn)生大量的紫外吸收中間體、具有特殊風味的物質(zhì)和高分子褐變聚合物類黑精[1-4]等，把這些物質(zhì)歸類為美拉德反應產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）。 無論是在食品的顏色和風味，還是在食品在貯藏過程中的穩(wěn)定性和貨架期等方面[5]，這些產(chǎn)物均發(fā)揮著重要的作用。大量研究表明，MR的程度和溫度、時間、系統(tǒng)中的組分、水分活度以及pH有關[6]。由此可見，MRPs不僅對食品的顏色、風味、貨架期和穩(wěn)定性等發(fā)揮著非常關鍵的作用，而且具有多種多樣的生物活性，如抗氧化、抗增殖、抗病毒、抗誘變和降血壓等。目前對MRPs抗氧化活性的研究已經(jīng)成為熱點，其常用于食品加工、生產(chǎn)與儲藏過程當中。

還原糖是MR的主要底物之一，五碳糖褐變速度是六碳糖的10倍[7]。劉海燕等[8]以阿拉伯糖與賴氨酸或甘氨酸為原料，制備了一系列不同反應條件下的MRPs，以硫氰酸鐵法為抗氧化測定指標和合成抗氧化劑TBHQ相對比。結果發(fā)現(xiàn)，阿拉伯糖-賴氨酸體系MRPs的抗氧化活性高于阿拉伯糖-甘氨酸體系，且在一定的濃度條件下，模擬體系所制備出的MRPs的抗氧化能力比TBHQ好。而在羰基化合物中，堿性的氨基酸要比中性和酸性的氨基酸和蛋白質(zhì)反應要快。Jayathilakan K等[9]研究了葡萄糖與5種不同的氨基酸（甘氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬氨酸和賴氨酸）的模擬體系，在5種組合中發(fā)現(xiàn)葡萄糖和賴氨酸或甘氨酸的組合具有良好的抗氧化活性。而在目前的研究中，對賴氨酸和阿拉伯糖模擬體系的研究相對較少。由此，本研究通過L-賴氨酸-D-阿拉伯糖在恒溫油浴槽內(nèi)進行MR，以DPPH自由基清除率和還原力作為測定指標考察其抗氧化活性，后采用均勻試驗進行優(yōu)化試驗，從而得到最佳的L-賴氨酸和D-阿拉伯糖模擬MR條件，以便為日后開發(fā)天然的抗氧化劑及更深入地研究L-賴氨酸和D-阿拉伯糖MRPs的其他功能特性提供基礎研究和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

L-賴氨酸、D-阿拉伯糖：Solarbio試劑公司；生化試劑；無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵和DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基）等均為分析純；去離子水。

1.2 主要設備

SQP電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HJ-3恒溫磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽：鞏義市予華儀器有限責任公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HH-S型水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗制備美拉德反應產(chǎn)物[10-11]

參考大量的研究結果，綜合考慮各個因素對MR過程的影響，以溫度、時間、pH和底物物質(zhì)的量之比4個主要因素對L-賴氨酸和D-阿拉伯糖進行研究。制備MRPs的具體操作過程如下所示：

（1）反應溫度對MRPs抗氧化活性的影響：準確稱取L-賴氨酸1.480 5 g和D-阿拉伯糖1.519 5 g（物質(zhì)的量之比為1∶1），溶解于90 mL去離子水中，分別用6 mol/L的NaOH溶液和4 mol/L的HCl溶液調(diào)整pH為9，并用調(diào)好的pH值為9的去離子水定容至100 mL，充分混勻后取10 mL溶液轉(zhuǎn)移至25 mL具塞試管中，密封好后，分別將配制好的反應液置于 45、60、75、90、105、120、135 ℃的恒溫油浴槽內(nèi)反應30 min。反應結束后將制備好的樣品放置在流動水中沖涼后進行相關測定，并將剩余樣品冷凍在冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）反應時間對MRPs抗氧化活性的影響：準確稱取L-賴氨酸1.480 5 g和D-阿拉伯糖1.519 5 g（物質(zhì)的量之比為1∶1），溶解于90 mL去離子水中，分別用6 mol/L的NaOH溶液和4 mol/L的HCl溶液調(diào)整反應物的pH值為9，并用調(diào)好的pH值為9的去離子水定容至100 mL，充分混勻后取10 mL溶液轉(zhuǎn)移至25 mL具塞試管中，密封好后，在 105 ℃恒溫油浴槽內(nèi)分別反應 20、30、60、90、120、150、180、210、240、270 min。 反應結束后將制備好的樣品放置在流動水中沖涼后進行相關測定，并將剩余樣品冷凍在冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）初始pH對MRPs抗氧化活性的影響：準確稱取L-賴氨酸0.296 1 g和D-阿拉伯糖0.303 9 g（物質(zhì)的量之比為 1∶1），溶解于 20 mL去離子水中，分別用6 mol/L的NaOH溶液和4 mol/L的HCl溶液調(diào)整 pH 為 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，并用調(diào)好相對應pH值的去離子水定容至20 mL，充分混勻。然后依次將配好后的各pH值溶液分別量取10 mL移至25 mL具塞試管中，密封好后，一起固定在105℃恒溫油浴槽內(nèi)反應30 min。反應結束后將制備好的樣品放置在流動水中沖涼后進行相關測定，并將剩余樣品冷凍在冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）L-賴氨酸與D-阿拉伯糖物質(zhì)的量之比對MRPs抗氧化活性的影響：準確稱取一定量的L-賴氨酸和D-阿拉伯糖，使它們的物質(zhì)的量之比分別為 1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5，先溶解在15 mL的去離子水中，用6 mol/L的NaOH溶液和4 mol/L的HCl溶液調(diào)整pH為9，再用調(diào)好的pH為9的去離子水定容至20 mL，充分混勻后量取10 mL反應溶液轉(zhuǎn)移至25 mL具塞試管中，密封好后，一起固定在105℃恒溫油浴槽內(nèi)反應30 min。反應結束后將制備好的樣品放置在流動水中沖涼后進行相關測定，并將剩余樣品冷凍在冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定

參考Mohsen等[12]的方法，并稍作修改來研究MRPs對DPPH自由基清除率的影響。取1 mL經(jīng)10倍稀釋后的樣品溶液和配好的2 mL DPPH無水乙醇溶液（0.1 mmol/L，每次都現(xiàn)用現(xiàn)配），充分混勻后在室溫黑暗條件下反應30 min。最后在517 nm處測定該吸光度值，記為A樣品。同操作、同條件下，以1 mL去離子水代替稀釋后的樣品溶液，作為空白組，記為A空白；以無水乙醇代替DPPH溶液作為對照組，記為A對照。MRPs對DPPH自由基清除率用下式計算：

DPPH 清除率 （%）=［1-（A樣品-A對照）/A空白]×100。

1.3.3 MRPs還原能力的測定

MRPs還原力的測定采用鐵氰化鉀還原法進行評價，參考章銀良等[13]的測定方法。首先取1 mL不同反應條件下的MRPs經(jīng)10倍稀釋、加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，以上反應液在10 mL離心管中經(jīng)充分混勻后放在恒溫水浴鍋中（50℃）反應20 min，迅速冷卻后加2.5 mL的TCA溶液（10%），然后在3 000 r/min的條件下離心10 min。完成后，取上清液2.5 mL，并加2.5 mL去離子水和1 mL三氯化鐵溶液（0.1%），充分混勻后在700 nm波長下測定其吸光度值。一般情況下，還原力的大小和抗氧化能力呈正相關關系。即吸光度值越大，MRPs還原能力越強，表明其抗氧化能力也越強。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 加熱溫度對MRPs抗氧化活性的影響

加熱溫度對MRPs抗氧化活性的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著加熱溫度的升高，無論是MRPs的還原能力還是對DPPH自由基的清除率都呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢。當加熱溫度低于90℃時，MRPs的抗氧化能力非常弱，DPPH自由基清除率低于24.91%，當加熱溫度為105℃時，DPPH自由基的清除率則上升至61.21%，并且隨著加熱溫度的不斷升高清除率持續(xù)增大，這說明MRPs中具有抗氧化活性的物質(zhì)在高溫條件下更利于生成。

圖1 反應溫度對MRPs抗氧化性的影響Fig.1 Changes in antioxidant activity of MRPs at different temperatures

2.1.2 反應時間對MRPs抗氧化活性的影響

不同反應時間對MRPs抗氧化活性的影響見圖2。

圖2 反應時間對MRPs抗氧化活性的影響Fig.1 Changes in antioxidant activity of MRPs heated for different durations

由圖2可知，隨著時間的延長，MRPs的抗氧化活性整體呈現(xiàn)先增加后變緩的趨勢。在反應前60 min內(nèi)，無論是DPPH自由基清除率還是MRPs的還原力都與反應時間呈正比，其中DPPH自由基的清除率由45.20%增至76.51%，之后MRPs抗氧化活性增加趨勢變緩。這說明MRPs中具有抗氧化活性的物質(zhì)形成于反應初期，并在反應體系中保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.1.3 反應初始pH對MRPs抗氧化活性的影響

反應初始pH值對MRPs抗氧化活性的影響見圖3。由圖3可知，一定的初始pH條件有利于L-賴氨酸和D-阿拉伯糖MR抗氧化活性物質(zhì)的生成，相對于其他范圍內(nèi)的pH值，在8～10的范圍內(nèi)MRPs具有相對較強的抗氧化活性，DPPH自由基的清除率在pH=8時達到最大，為60.50%，還原力在pH=10時達到最大，其吸光度值為0.788。MRPs的DPPH自由基清除率和還原力分別在初始pH值為8和10時測定為最強，這表明了還原力的變化趨勢和DPPH自由基清除率在表征抗氧化能力大小上具有一定的差異，即其在測定抗氧化性的機理上是不同的。

圖3 不同反應初始pH對MRPs抗氧化性的影響Fig.3 Changes in antioxidant activity of MRPs wnder different reaction initial pH values

2.1.4 底物物質(zhì)的量之比對MRPs抗氧化活性的影響

底物物質(zhì)的量之比對MRPs抗氧化活性的影響見圖4。

圖4 反應底物物質(zhì)的量之比對MRPs抗氧化性的影響Fig.4 Changes in antioxidant activity of MRPs under different molar ratio

從圖4可以看出，底物的物質(zhì)的量之比（L-賴氨酸∶D-阿拉伯糖）對MRPs的抗氧化活性的影響沒有一定的規(guī)律可循，但總體上D-阿拉伯糖含量即羰基含量的增加，更有利于產(chǎn)物抗氧化能力的增強。通過對數(shù)據(jù)的分析，可以看到底物物質(zhì)的量之比對試驗的影響較小，DPPH自由基的清除率從3∶1時的41.28%增加到1∶3時的 69.75%，還原力的大小從3∶1時的0.543增加到1.5∶1時的 0.789。

2.2 均勻試驗

2.2.1 均勻試驗因素水平設計

根據(jù)單因素試驗結果，選取合適的反應溫度、時間、反應液初始pH值和底物物質(zhì)的量之比4個因素進行均勻試驗，以DPPH自由基清除率作為檢測指標來優(yōu)化L-賴氨酸和D-阿拉伯糖的MRPs，對均勻試驗的設計表采用U7（74），對各個因素水平的設計見表1。

表1 U7（74）均勻試驗因素與水平Table 1 Levels and factors of U7（74）uniform experiment

2.2.2 均勻試驗結果

根據(jù)表1在相應的條件下分別進行反應得到相應的MRPs，并依照1.3.2的方法對每組試驗所得的MRPs進行DPPH自由基清除率的測定，結果如表2所示。

表2 均勻試驗結果Table 2 Results of uniform experiment

2.2.3 軟件分析

對均勻試驗得出的結果采用Mathematics 4.0軟件進行分析，結果如表3、表4所示。

表3 回歸參數(shù)Table 3 Regression parameters

表4 回歸方差分析Table 4 Regression variance analysis

由Mathematics 4.0軟件分析表明，反應初始pH對MRPs抗氧化活性具有顯著影響，加熱時間與反應溫度、初始pH與反應溫度之間均具有極顯著交互作用。影響MRPs抗氧化活性的主次因素順序為：pH（X3）>溫度（X4）>時間（X1）>底物物質(zhì)的量之比（X2）?；貧w方程：Y（自由基清除率）=210.0+14.85X10.2-0.000 114 2X12X4+0.270 0X32-0.000 9251 X31.1X42。在測試條件范圍內(nèi)，從回歸方程可得到最佳條件為：溫度110℃、反應時間68 min、反應初始pH 8、L-賴氨酸與D-阿拉伯糖物質(zhì)的量之比為1∶2，此時從理論上計算出MRPs對DPPH自由基的清除率為93.51%，抗氧化活性最強。經(jīng)實際試驗驗證，在此優(yōu)化條件下得到的MRPs對DPPH自由基的清除率為89.81%，與理論值的相對誤差為3.70個百分點。說明均勻試驗優(yōu)化后的最優(yōu)條件組合制備的MRPs具有強的抗氧化活性，優(yōu)化結果可靠。

3 結論

本試驗以L-賴氨酸與D-阿拉伯糖為底物，通過普通油浴加熱制備不同反應條件的MRPs，以DPPH自由基清除率為檢測指標來表征MRPs的抗氧化活性。結果表明：反應初始pH對MRPs抗氧化活性具有顯著影響，加熱時間與反應溫度、初始pH與反應溫度之間均具有極顯著交互作用。優(yōu)化反應條件為溫度110℃、反應時間68 min、反應初始pH 8、L-賴氨酸與D-阿拉伯糖物質(zhì)的量之比為1∶2，經(jīng)過均勻試驗優(yōu)化后所制備出的MRPs其抗氧化能力得到顯著提高，對DPPH自由基的清除率為89.81%，其抗氧化能力比各試驗組都強。

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STUDY ON ANTIOXIDANT ACTIVITY OF MAILLARD REACTION PRODUCTS DERIVED FROML-LYSINE ANDD-ARABINOSE

ZHANG Yinliang1，2，CAI Yalin1，2，LI Xin1
（1.School of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou450002，China；2.Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety in Henan Province，Zhengzhou450001，China）

The purpose of this paper was to study the antioxidant activity of Maillard reaction products（MRPs）derived fromL-lysine andD-arabinose. In this experiment，DPPH radical scavenging rate and reducing power were used as the antioxidant activity index of MRPs. First，we studied the influences of different factors (reaction temperature，reaction time，initial pH and substrate molar ratio) on the antioxidant activity of MRPs，then detemrined the optimum conditions through uniform experiments. Results showed that the optimum conditions were as follows: temperature 110 ℃ ，reaction time 68 min，initial pH 8，substrate molar ratio (L-lysine：DArabinose) 1: 2. Under the optimum conditions，DPPH radical scavenging rate of MRPs was improved from 80.69% to 89.81%，therefore，the antioxidant activity was enhanced.

L-lysine；D-arabinose；maillard reaction products；antioxidant activity

TS 201.2 文獻標志碼：B

1673-2383(2017)05-0063-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.024.html

網(wǎng)絡出版時間：2017-10-30 9:36:38

2017-02-12

食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心研究生創(chuàng)新基金（FCICY201610）

章銀良（1963—），男，浙江上虞人，教授，博士，主要研究方向為食品科學與質(zhì)量安全。