陳美群，李寶海，周建設(shè)，潘瑛子，扎西拉姆，王萬良

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850032)

尖裸鯉病變死亡后微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析

陳美群1，李寶海2*，周建設(shè)1，潘瑛子1，扎西拉姆1，王萬良1

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850032)

【目的】本文探討了尖裸鯉因水霉菌病變死亡后的微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征。【方法】采用Illumina-Miseq高通量測序技術(shù)對尖裸鯉健康個體和因水霉菌病變死亡個體的表皮皮膚粘液及腸道內(nèi)容物的微生物多樣性進(jìn)行分析。【結(jié)果】尖裸鯉因水霉菌病變死亡后其表皮皮膚和腸道中細(xì)菌群落多樣性減少，而其真菌多樣性增加。尖裸鯉病變死亡后其表皮皮膚粘液中Pseudomonassp.、Vagococcussp.、Providenciasp.、Morganellasp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes等8種優(yōu)勢微生物菌群減少，而Acinetobactersp.、Proteussp.、Carnobacteriumsp.和Malasseziasp.等4種優(yōu)勢微生物菌群增加。同時，尖裸鯉病變死亡后其腸道中Acinetobactersp.、Flavobacteriumsp.、Vagococcussp.、Carnobacteriumsp.、Bacillussp.和Malasseziasp.等6種優(yōu)勢微生物菌群減少，而Pseudomonassp.、Tremellales和Agaricomycetes等3種優(yōu)勢微生物菌群增加?！窘Y(jié)論】細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)變化是尖裸鯉病變死亡的主要原因。

高通量測序；尖裸鯉；微生物群落；水霉病

【研究意義】尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewarti)屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚亞科(Schizothoracinae)、尖裸鯉屬(Oxygymnocypris)，俗稱斯氏裸鯉魚，僅分布于我國西藏地區(qū)3600 m以上的雅魯藏布江中游及其支流中，為我國特有物種[1]。尖裸鯉肉質(zhì)細(xì)膩、脂質(zhì)含量高，是西藏地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前有關(guān)尖裸鯉的研究主要集中在生物地理學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、種群生態(tài)學(xué)、胚胎發(fā)育、食性組成和肌肉營養(yǎng)組成等方面[2-4]，而對其微生物群落的分析研究未見報道。大量研究表明魚類腸道及其表皮微生物群落是魚類的重要組成部分，可直接影響魚類的正常生長發(fā)育、生理平衡和病理變化等[5-6]，深入研究魚類微生物群落組成多樣性對其人工馴化和疾病防控具有重要意義。【本研究切入點(diǎn)】本文采用高通量測序技術(shù)研究分析西藏尖裸鯉因水霉菌引起病變死亡前后其表皮和腸道中微生物群落的變化特征?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討在尖裸鯉病變死亡過程中起主要作用的微生物種類，以期為尖裸鯉的人工養(yǎng)殖及其疾病防控提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

健康尖裸鯉樣品于2015年3月用拖網(wǎng)法采集于雅魯藏布江貢嘎江段，然后于西藏農(nóng)科院水產(chǎn)養(yǎng)殖基地馴養(yǎng)池馴養(yǎng)2個月；病變死亡尖裸鯉樣品于2015年5月采集于西藏農(nóng)科院水產(chǎn)養(yǎng)殖基地馴養(yǎng)池，在尖裸鯉死亡后1 h內(nèi)采集樣品(病變死亡尖裸鯉病理特征主要表現(xiàn)為表皮皮膚斑點(diǎn)狀潰瘍并長有白色水霉菌，斑點(diǎn)狀潰瘍病變皮膚較易脫落并顯露肌肉組織，背鰭和尾鰭等部位出現(xiàn)紅色小斑點(diǎn)并伴有肌肉組織腐爛、殘缺等癥狀)。在無菌條件下分別用50 mL滅菌離心管收集5條健康尖裸鯉[體重：(161.7 ± 2.0 )g，體長：(26 ± 0.8 )cm] 和5條病變死亡尖裸鯉 [體重：(159.5 ± 1.5)g，體長：(28 ± 0.7)cm]的表皮皮膚粘液及腸道內(nèi)容物樣品，分別編號為試驗(yàn)樣品5號(健康尖裸鯉表皮皮膚粘液樣品)、試驗(yàn)樣品6號(健康尖裸鯉腸道內(nèi)容物樣品)、試驗(yàn)樣品7號(病變死亡尖裸鯉表皮斑點(diǎn)狀潰瘍區(qū)皮膚粘液樣品)、試驗(yàn)樣品8號(病變死亡尖裸鯉腸道內(nèi)容物樣品)，所有樣品于-20 ℃保藏備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用TIANGEN公司土壤基因組DNA提取試劑盒(DP336)提取尖裸鯉表皮皮膚粘液和腸道內(nèi)容物樣品中微生物的總DNA，具體步驟按說明書操作。所提取的DNA于-20 ℃保藏備用。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA-V3區(qū)的PCR擴(kuò)增及測序 用提取的總DNA為模板，采用細(xì)菌V3區(qū)通用引物 338F/518R(表1)擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增體系(50 μl)如下：10×Buffer 5 μl，dNTP(2.5 mM)4 μl，引物各1 μl，TakaRaTaq(5 U/μl) 0.25 μl，模板1 μl，無菌水37.75 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取2 μl PCR產(chǎn)物，2 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.2.3 真菌18S rDNA部分片段的PCR擴(kuò)增及測序 用提取的總DNA為模板，采用巢式PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增真菌18S rDNA區(qū)目的片段。巢式PCR第一輪擴(kuò)增采用GeoA2/Geo11引物(表1)，PCR擴(kuò)增體系(50 μl)如下：10×Buffer 5 μl，dNTP(2.5 mM) 4 μl，引物各1 μl，TakaRaTaq(5 U/μl) 0.25 μl，模板1μl，無菌水37.75 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物采用Min Elute PCR Purefication Kit 純化后4 ℃保存。巢式PCR第二輪擴(kuò)增采用F-Primer/R-Primer引物(表1)，PCR擴(kuò)增體系(50 μl)如下：10×Buffer 5 μl，dNTP(2.5 mM) 4 μl，引物各1 μl，TakaRaTaq(5 U/μl) 0.25 μl，模板38.75 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，47 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。取2 μl PCR產(chǎn)物，2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用CASAVA(v1.8.2)軟件對原始測序結(jié)果圖像進(jìn)行圖像堿基識別，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除低質(zhì)量的序列后應(yīng)用Pandaseq(v2.7)和Trimmomatic(v0.33)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化分析，獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。計(jì)算在 97 % 的相似水平上每個樣本的操作分類單元(OTU)數(shù)量，并繪制稀疏曲線[7]。利用Qiime(v1.9)軟件計(jì)算樣品包括Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)的α多樣性值，其Chaol指數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高，Shannon指數(shù)值越高表明群落物種的多樣性越高[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品物種豐度及多樣性分析

通過 Illumina高通量測序，5號樣品得到的高質(zhì)量細(xì)菌和真菌序列分別為225 662和97 654條，6號樣品分別為15 828和203 285條，7號樣品分別為82 362和19 187條，8號樣品分別為42 880和14 592條。所有樣品在給定非相似度97 %的水平上進(jìn)行OTU歸并，5號樣品分別得到6133個細(xì)菌OTU和742個真菌OTU，6號樣品分別得到1701個細(xì)菌OTU和1375個真菌OTU，7號樣品分別得到2850個細(xì)菌OTU和367個真菌OTU，8號樣品分別得到1832個細(xì)菌OTU和148個真菌OTU。從圖1可見，6號細(xì)菌樣品的稀釋曲線(rarefaction curves)未進(jìn)入平臺期，表明隨著測序數(shù)量的增加新的細(xì)菌種類將被發(fā)現(xiàn)；其余樣品的稀釋曲線均已未進(jìn)入平臺期，能夠較好的反映樣品中微生物群落組成多樣性。

表1 擴(kuò)增所用PCR引物

表2 各組樣品的OTUs數(shù)量及Alpha多樣性

通過Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)對樣品的豐度及多樣性進(jìn)行比較分析(表2)，5號樣品的細(xì)菌和真菌Chaol指數(shù)數(shù)值均較7號樣品高，可見5號樣品的細(xì)菌和真菌含量均大于7號樣品；5號樣品的細(xì)菌Shannon指數(shù)數(shù)值大于7號樣品，而5號樣品的真菌Shannon指數(shù)數(shù)值小于7號樣品，可見5號樣品較7號樣品具有較高的細(xì)菌群落多樣性和較低的真菌群落多樣性。6號樣品的細(xì)菌Chaol指數(shù)小于8號樣品，其真菌Chaol指數(shù)大于8號樣品，可見6號樣品的細(xì)菌含量小于8號樣品(可能是由于6號細(xì)菌樣品測序深度不夠，導(dǎo)致其細(xì)菌OTU數(shù)量偏少)，而其真菌含量大于8號樣品；6號樣品的細(xì)菌Shannon指數(shù)數(shù)值大于8號樣品，而6號樣品的真菌Shannon指數(shù)數(shù)值小于8號樣品，可見6號樣品較8號樣品具有較高的細(xì)菌群落多樣性和較低的真菌群落多樣性。α多樣性指數(shù)分析表明：尖裸鯉病變死亡后其表皮皮膚和腸道中細(xì)菌群落多樣性減少，而其真菌多樣性增加。

2.2 尖裸鯉病變死亡后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

將各樣品中豐度較高的細(xì)菌16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST同源性比較分析。在屬分類水平上，5號樣品優(yōu)勢類群(相對豐度>2.0 %)主要包括漫游球菌屬(Vagococcussp. 36.37 %)、普羅威登斯菌屬(Providenciasp. 20.24 %)、摩根氏菌屬(Morganellasp. 16.20 %)、假單胞桿菌屬(Pseudomonassp. 12.46 %)和不動桿菌屬(Acinetobactersp. 4.96 %)。7號樣品優(yōu)勢類群主要包括漫游球菌屬(32.18 %)、變形桿菌屬(Proteussp. 25.91 %)、摩根氏菌屬(11.99 %)、假單胞桿菌屬(7.95 %)、不動桿菌屬(6.65 %)和肉桿菌屬(Carnobacteriumsp. 4.83 %)。5和7號樣品比較分析表明：尖裸鯉病變死亡后其表皮皮膚粘液中Pseudomonassp.、Vagococcussp.、Providenciasp.、Morganellasp.等4種優(yōu)勢菌群減少，相對豐度分別減少4.51 %、4.19 %、19.41 %和4.21 %；同時Acinetobactersp.、Proteussp.、Carnobacteriumsp.等3種優(yōu)勢菌群增加，相對豐度分別增加1.69 %、25.26 %和4.11 %。6號樣品優(yōu)勢類群主要包括假單胞桿菌屬(55.64 %)、不動桿菌屬(9.38 %)、黃桿菌屬(Flavobacteriumsp. 7.47 %)、漫游球菌屬(6.09 %)、肉桿菌屬(5.42 %)和芽孢桿菌屬(Bacillussp. 4.36 %)，8號樣品優(yōu)勢類群為假單胞桿菌屬(94.70 %)。6和8號樣品比較分析表明：尖裸鯉病變死亡后其腸道中Acinetobactersp.、Flavobacteriumsp.、Vagococcussp.、Carnobacteriumsp.和Bacillussp.等5種優(yōu)勢菌群減少，相對豐度分別減少7.85 %、7.37 %、5.89 %、5.38 %和4.27 %；同時Pseudomonassp.優(yōu)勢菌群增加，其相對豐度增加39.06 %(表3)。

圖1 尖裸鯉樣品中細(xì)菌和真菌的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction analysis of pyrosequencing reads in bacteria and fungi from Oxygymnocypris stewart samples

序號Sequencenumber屬名Genericname相對豐度(%)Relativeabundance5號樣品6號樣品7號樣品8號樣品1Pseudomonas12.4655.647.9594.702Vagococcus36.376.0932.180.203Providencia20.240.490.830.294Morganella16.201.2011.990.365Acinetobacter4.969.386.651.536Proteus0.651.5625.910.167Carnobacterium0.725.424.830.048Rhodoplanes0.981.021.490.479Nitrospira1.021.641.200.3810Streptococcus1.210.840.600.1811Flavobacterium0.407.470.140.1012Serratia1.000.181.080.1413Bacillus0.514.360.580.0914Balneimonas0.780.930.790.2615Chryseobacterium0.561.600.770.2916Skermanella0.500.580.850.2117Lysobacter0.420.310.640.1018Devosia0.320.760.640.1419Mycobacterium0.400.270.500.1520Steroidobacter0.300.270.390.20

2.3 尖裸鯉病變過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

將各樣品中豐度較高的真菌18S rDNA 序列進(jìn)行BLAST同源性比較分析。在各分類水平上，5號樣品優(yōu)勢類群(相對豐度>1.0 %)主要包括馬拉色霉菌屬(Malasseziasp. 84.337 %)、格孢腔菌目(Pleosporales 5.384 %)、毛霉目(Mucorales 4.234 %)、銀耳目(Tremellales 1.948 %)和傘菌綱(Agaricomycetes 1.149 %)，7號樣品優(yōu)勢類群主要為馬拉式霉菌屬(95.158 %)和銀耳目(1.347 %)。5號和7號樣品比較分析表明：尖裸鯉病變死亡后其表皮皮膚粘液中Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes等4種優(yōu)勢菌群減少，相對豐度分別減少5.157 %、4.223 %、0.601 %和0.635 %；同時Malasseziasp.優(yōu)勢菌群增加，其相對豐度增加10.821 %。6號樣品優(yōu)勢類群為馬拉色霉菌屬(95.193 %)和銀耳目(1.508 %)，8號樣品優(yōu)勢類群為馬拉式霉菌屬(81.579 %)、銀耳目(10.526 %)和傘菌綱(2.632 %)。6號和8號樣品比較分析表明：尖裸鯉病變死亡后其腸道中Malasseziasp. 菌群減少，相對豐度減少13.614 %，同時Tremellales和Agaricomycetes優(yōu)勢菌群增加，其相對豐度增加分別為8.748 %和1.818 %(表4)。

此外樣品中還發(fā)現(xiàn)有蛛形綱(Arachnida)、類帕金蟲生物(Pseudoperkinsidae)、線蚓科(Enchytraeidae) 和硬骨魚綱(teleostei)等動物的存在。其中8號樣品中蛛形綱(Arachnida)豐度明顯高于其他3個樣品，可能是因?yàn)榧饴沲幩劳龊笃淠c道微生態(tài)環(huán)境失衡，被尖裸鯉當(dāng)做食物攝取的蛛形綱等動物的殘存受精卵開始發(fā)育導(dǎo)致。Pseudoperkinsidae[9]是一類類似帕金蟲生物的病原生物，在尖裸鯉死亡過程中可能起重要作用。線蚓科(Enchytraeidae) 和硬骨魚綱(teleostei)的存在為尖裸鯉攝食所致。由此表明尖裸鯉死亡過程中真菌、病原原生生物和寄生腐生動物都起著不可估量的作用。

表4 樣品中排名前20的真菌OUTs的相對豐度

3 討論與結(jié)論

大量研究發(fā)現(xiàn)魚類腸道菌群的失衡可以導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，而疾病的發(fā)生也會導(dǎo)致魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[10-11]。同時潰瘍病、爛鰭病等[12]頻發(fā)性皮膚疾病也是造成魚類病變死亡的重要因素，是魚類人工繁育工作的重要威脅。本文采用Illumina高通量測序技術(shù)對尖裸鯉健康個體和因水霉菌病變死亡個體的表皮皮膚粘液及腸道內(nèi)容物的微生物多樣性組成進(jìn)行了系統(tǒng)分析，首次從宏基因組水平較全面的探討了尖裸鯉病變死亡前后微生物群落變化特征。本研究發(fā)現(xiàn)尖裸鯉因水霉菌病變死亡后其表皮皮膚和腸道中細(xì)菌群落多樣性減少，而其真菌多樣性增加。張正等[13]研究半滑舌鰨腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)變化指出發(fā)生疾病后的魚腸道細(xì)菌多樣性較健康個體明顯減少，與本文研究相一致。尖裸鯉病變死亡后其表皮皮膚粘液中Pseudomonassp.、Vagococcussp.、Providenciasp.、Morganellasp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes等8種優(yōu)勢微生物菌群在減少，而Acinetobactersp.、Proteussp.、Carnobacteriumsp. 和Malasseziasp.等4種優(yōu)勢微生物菌群在增加，其中Providenciasp.(19.41 %)、Pleosporales(5.157 %)、Mucorales(4.223 %)菌群的減少和Proteussp.(25.26 %)、Pseudomonassp. (10.821 %)菌群的增加尤為顯著。假單胞桿菌屬細(xì)菌(Pseudomonassp.)是低溫腐敗菌[14]，其大量繁殖條件與本文中尖裸鯉的低溫生存環(huán)境相符。漫游球菌屬(Vagococcussp.)最早由Collins MD等[15]從河流中分離得到，隨后在病死鮭魚、死亡海豹等水生生物中大量發(fā)現(xiàn)，是一種革蘭氏陽性、能運(yùn)動的水棲病原菌。普羅威登斯菌屬(Providenciasp.)是一類革蘭氏陰性條件致病腸桿菌，能夠引起腸道感染等疾病[16]。摩根氏菌屬(Morganellasp.)是一類腐生菌，能夠引起養(yǎng)殖動物皮膚、肌肉潰爛，器官淤血腫脹等疾病[17]。不動桿菌屬(Acinetobactersp.)具有較好的抗藥性，是一類致病性較強(qiáng)的廣譜抗藥病原微生物[18]。黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)和肉桿菌屬(Carnobacteriumsp.)是造成冷藏魚類腐敗變質(zhì)的重要微生物類群[19]。馬拉色霉菌屬真菌(Malasseziasp.)[20]是一類嗜脂性條件致病菌，是造成動物多種皮膚疾病的常見菌群。同時，尖裸鯉病變死亡后其腸道中Acinetobactersp.、Flavobacteriumsp.、Vagococcussp.、Carnobacteriumsp.、Bacillussp.和Malasseziasp.等6種優(yōu)勢微生物菌群減少，而Pseudomonassp.、Tremellales和Agaricomycetes等3種優(yōu)勢微生物菌群增加，其中Malasseziasp. (13.614 %)菌群的減少和Pseudomonassp.(39.06 %)、Tremellales(8.748 %)、Agaricomycetes(1.818 %)菌群的增加較為明顯。此外研究中還發(fā)現(xiàn)有Pseudoperkinsidae等病原動物存在于尖裸鯉皮膚和腸道中，表明尖裸鯉病變死亡是由細(xì)菌、真菌和病原動物共同作用的結(jié)果。

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ChangesofMicrobialCommunityafterOxygymnocyprisstewartiDeath

CHEN Mei-qun1， LI Bao-hai2*， ZHOU Jian-she1， PAN Ying-zi1， ZHAxilamu1， WANG Wan-liang1

(1.Institute of Fisheries Research, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Tibet Lhasa 850032, China；2.Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Tibet Lhasa 850032, China)

【Objective】The present paper aims to explore the changes of microorganisms community between healthy individuals and diseased individuals ofOxygymnocyprisstewarti. 【Method】The skin mucus and intestinal contents ofOxygymnocyprisstewartiby using Illumina-Miseq high-throughput sequencing technology were studied. 【Result】The bacterial diversity in the skin mucus and intestinal contents afterOxygymnocyprisstewartideath were decreased, however, the fungi diversity were increased; The dominant microbial ofPseudomonassp.,Vagococcussp.,Providenciasp.,Morganellasp., Pleosporales, Mucorales, Tremellales and Agaricomycetes in the skin mucus were decreased, meanwhile the dominant microbial ofAcinetobactersp.,Proteussp.,Carnobacteriumsp. andMalasseziasp. were increased; The dominant microbial ofAcinetobactersp.,Flavobacteriumsp.,Vagococcussp.,Carnobacteriumsp.,Bacillussp. andMalasseziasp. in the intestinal contents were decreased, meanwhile the dominant microbial ofPseudomonassp., Tremellales and Agaricomycetes were increased. 【Conclusion】The bacterial and fungal community structure changes were the main causes ofOxygymnocyprisstewarti. death.

High-throughput sequence;Oxygymnocyprisstewarti; Microbial community; Saprolegniasis

1001-4829(2017)5-1233-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.043

2016-05-20

西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金(13-44)；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201403012-05)

陳美群(1986-)，女，廣西南寧人，碩士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究工作，E-mail:cmq1986007@163.com，Tel：13989986804；*為通訊作者：李寶海(1956-)，男，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)、水產(chǎn)養(yǎng)殖，E-mail：lbh0891@163.com。

S965.116

A

(責(zé)任編輯 陳 虹)