封亞青，張 燕，蘇宏華，楊益眾*

(1.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省灌南縣農(nóng)技推廣中心，江蘇連云港 222500；3.江蘇省南通市出入境檢驗檢疫局，江蘇南通 226000)

大氣CO2不同濃度對灰飛虱獲毒與傳毒的影響研究

封亞青1，2，張 燕1，3，蘇宏華1，楊益眾1*

(1.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省灌南縣農(nóng)技推廣中心，江蘇連云港 222500；3.江蘇省南通市出入境檢驗檢疫局，江蘇南通 226000)

本世紀初，由灰飛虱Laodelphaxstriatellus傳播的條紋病毒(RSV)引起的條紋葉枯病在長江中下游廣大稻區(qū)肆虐，給這些地區(qū)的水稻生產(chǎn)帶來了災難性影響。本文采用模擬氣室法，研究了大氣CO23個濃度(370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L)對媒介害蟲灰飛虱獲毒與傳毒的影響。結(jié)果表明，灰飛虱獲毒個體數(shù)與灰飛虱的取食時間成正比，在有毒稻株上取食時間越長，獲毒的灰飛虱個體數(shù)越多。不同CO2濃度間，取食相同時間后的灰飛虱獲毒個體數(shù)雖有差異，但沒有達到顯著水平。鑒于稻株獲得RSV與病毒病的癥狀顯現(xiàn)之間存在較長的時間差，本文通過提取水稻植株體內(nèi)的RNA并借助RT-PCR技術(shù)，研究判定被害稻株是否已經(jīng)獲得了RSV，從而間接證明灰飛虱的傳毒力。研究結(jié)果顯示，CO2濃度對灰飛虱的傳毒力有影響：470 μL/L CO2濃度條件下灰飛虱的傳毒力最強。研究還發(fā)現(xiàn)，在處理的3個CO2濃度范圍內(nèi)，灰飛虱只要取食為害稻苗1 h，水稻中就能檢測到條紋病毒(RSV)。說明灰飛虱的傳毒速率還是較快的。

CO2濃度；灰飛虱；條紋病毒(RSV)；傳毒與獲毒

當今，以CO2為主的溫室氣體濃度的上升速度明顯加快。據(jù)測定，大氣CO2的濃度已由19世紀七十年代的280 μL/L上升至現(xiàn)在的406 μL/L，上升了45%。還有研究認為，大氣CO2濃度正以每年0.4%左右的速度不斷上升，到本世紀末將達到540-970 μL/L(IPCC，2013)。大氣CO2濃度升高可影響植物的生長及其一系列的生理特征。研究認為，高CO2濃度可增加光合作用效率、植物的葉面積、地上生物量，進而導致碳水化合物的增加和對水分的利用效率的提高。同時，高CO2濃度可極大降低植物葉片的含氮量，改變植物的化學防御物質(zhì)等(Lindrothetal.，1993)，從而影響植食性昆蟲對植物的取食。一些專家學者對大氣CO2濃度升高影響植物的光合呼吸作用與產(chǎn)量構(gòu)成曾做了大量研究探索(王為民等，2000；趙天宏等，2003；范桂枝等，2008)；也有部分學者研究了棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner、棉蚜AphisgossypiiGlover等害蟲對大氣CO2濃度升高的響應(陳法軍等，2004；吳剛等，2006)。還有一些學者研究闡述了大氣CO2濃度與禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi、西花薊馬Frankliniellaoccidentalis、粘蟲Mythimnaseparata等害蟲之間的關系(張鈞等，2002；劉建業(yè)等，2014；陳曉燕等，2017)。

由媒介昆蟲灰飛虱Laodelphaxstriatellus(Fallén)傳播的條紋病毒(RSV)引起的條紋葉枯病曾是上世紀六十年代長江中下游地區(qū)水稻上嚴重發(fā)生的病害，以后就銷聲匿跡。進入二十一世紀后，條紋葉枯病在長江中下游廣大稻區(qū)再度大流行，給長江中下游地區(qū)的水稻生產(chǎn)帶來了災難性影響，成為這些稻區(qū)水稻生產(chǎn)上最重要和最嚴重的病毒病害(程兆榜等，2007)。本世紀初灰飛虱種群密度的迅速擴大和條紋葉枯病的大面積發(fā)生是否與大氣CO2濃度的漸漸升高有關，未見前人研究闡述；大氣CO2不同濃度對介體灰飛虱的獲毒與傳毒是否有影響，也未見研究報道。本文采用模擬氣室法，研究了大氣CO23個濃度(370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L)對媒介害蟲灰飛虱獲毒與傳毒的影響，現(xiàn)將初步研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用水稻品種為“武運粳7號”。由江蘇省武進市農(nóng)業(yè)科學研究所提供。

灰飛虱采自揚州大學實驗農(nóng)牧場小麥田內(nèi)，帶回室內(nèi)群體飼養(yǎng)在即將分蘗的“武運粳7號”稻苗上。稻苗種植在直徑15 cm、高25 cm的大燒杯中，杯口以紗布封住。待灰飛虱交配后，選出雌性成蟲放入內(nèi)有稻苗的試管中進行單管飼養(yǎng)，4 d后逐個測定單管中灰飛虱的帶毒率并標記。若成蟲帶毒，這只試管中的后代基本全帶毒；若成蟲不帶毒，這支試管中的后代基本不帶毒。經(jīng)過幾代分離選育和各代蟲體獲毒率測定，篩選出帶毒與不帶毒的灰飛虱個體作為試驗蟲源(張開玉等，2008)。

1.2 試驗方法

1.2.1CO2濃度的控制

本試驗以普通鋼瓶供給氣體，以PYX-300Q-B型人工氣候箱(中國哈爾濱東聯(lián)電子公司生產(chǎn))為空間，形成一個密閉的動態(tài)氣室，同時以eSENSE-D型CO2濃度控制儀(Sense Air Company, Sweden)和XMT605智能顯示儀表(江蘇南京法派電器有限公司生產(chǎn))監(jiān)控該氣室內(nèi)的CO2濃度(陳法軍等，2005)。本試驗設定人工氣候箱中的溫度為25℃，相對濕度60%-80%，光暗比L ∶D=14 ∶10(L=8 ∶00-22 ∶00；D=22 ∶00-8 ∶00)。

設置CO2濃度處理3個：470 μL/L、570 μL/L，另以人工氣候箱中的CO2濃度(約370 μL/L)為對照。通過XMT605智能顯示儀表全天候監(jiān)測，結(jié)果顯示各處理的CO2濃度日波動小于30 μL/L。

1.2.2稻株獲取RSV與灰飛虱蟲體再獲RSV的培養(yǎng)

將種植于燒杯中的苗期水稻分別置于CO2濃度為370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L人工氣候箱中，待水稻進入分蘗期，各處理接入帶毒率為87%-90%的灰飛虱成蟲若干頭，分兩組處理：一是取食1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h后分批剔除取食的蟲源，48 h后摘取水稻葉片測定稻株的帶毒率；二是繼續(xù)讓帶毒飛虱取食至48 h、水稻整體獲得條紋病毒(RSV)后剔除帶毒蟲源(林莉等，1996)作為有毒稻株。

以上述的有毒稻株為試驗材料，繼續(xù)放入CO2不同濃度處理的人工氣候箱中，接入饑餓處理 4 h、不帶毒的灰飛虱成蟲若干，于取食1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、32 h后回收蟲源，每個處理回收30頭，存入-20℃冰箱中，待測蟲體獲毒率。不同CO2濃度處理試驗均重復3次。

1.2.3蟲體獲毒率與稻株帶毒率檢測

1.2.3.1 蟲體獲毒率測定

斑點免疫檢測結(jié)合DIBA法(周益軍等，2004)。試劑盒由江蘇省農(nóng)科院提供。

基本方法與步驟：測試前用純凈水將0.1 M PBST洗滌緩沖液稀釋10倍為0.01 M，再用0.01 M PBST洗滌緩沖液稀釋脫脂奶粉至1%濃度放于冰箱冷藏室備用?；绎w虱處理：將1頭灰飛虱放在0.2 mL離心管中，然后加入100 μL碳酸鹽包被緩沖液，用牙簽搗碎(每一個處理換一次牙簽)，5000 rpm離心3 min，取上清液3 μL點在硝酸纖維素膜正方格中，常溫晾干；將晾干的膜浸入1%脫脂奶粉封閉液中，37℃搖床，30 min；取出膜，浸入用封閉液稀釋20000-40000倍的單抗中，37℃搖床，1.5 h；取出膜，用0.01 M PBST洗3次，每次洗3 min；將膜浸入用封閉液稀釋2500-3000倍的辣根過氧化物酶標記的二抗中，37℃搖床，1.5 h；取出膜再用0.01 M PBST洗3次，每次洗3 min；將膜浸入新配置的底物溶液中，底物溶液為：10 mL 0.02 MPBS底物緩沖液+7 μL 30%雙氧水，37℃搖床，30 min；顯色后，用自來水沖洗，常溫晾干。

1.2.3.2 水稻葉片帶毒率檢測

采用嵇朝球等(2005)創(chuàng)制的RT-PCR法。其步驟為：

病毒總RNA的提?。篢rizol法。選取植株葉片0.07 g在液氮中研磨至細粉，將細粉移入1.5 mL LEP管中，加入已預冷的Trizol提取液1 mL，震蕩均勻，放置5 min后加入200 μL氯仿，劇烈搖晃后，靜置5 min，在4℃、12000 rpm條件下離心15 min，取上層液體350 μL于干凈離心管，加入相同體積的異丙醇混勻，沉淀10 min，然后在4℃、12000 rpm條件下離心5 min，RNA沉淀于管壁和底部，去掉上清液，室溫干燥10 min，加入30 μLDEPC水溶解RNA。

PCR引物的設計：由上海生工生物技術(shù)工程服務有限公司幫助完成。

一步法RT-PCR方法鑒定RSV：一步法RT-PCR試劑盒(丁新倫等，2008)。以CP為引物對病毒RNA進行RT-PCR擴增，反應體系參照試劑盒說明書。擴增條件是：50℃ RT反應30 min、94℃ Rtase預變性2 min；94℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸1 min，共進行35個循環(huán)；最后72℃保溫10 min。18℃保存。

水稻條紋病毒CP蛋白基因的檢測。取上述擴增的PCR產(chǎn)物6 μL，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE公司)觀察和分析電泳結(jié)果，所有感染病毒的稻葉在990 bp附近有一條清晰條帶，而正常稻葉條帶不顯。

1.3 統(tǒng)計分析

DPS 7.05版本統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，并以Office辦公軟件Excel和Word為輔助工具。不同處理間的差異顯著性比較采用Duncan，s新復極差方法檢驗(李娟等，2008)。

2 結(jié)果與分析

研究發(fā)現(xiàn)，在370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L 3個CO2濃度條件下，灰飛虱的獲毒個體數(shù)均與取食時間有關。即在設定的3個CO2濃度范圍內(nèi)，灰飛虱的獲毒個體數(shù)均隨著取食時間的延長而增加，取食32 h時間后的灰飛虱獲毒個體數(shù)與取食4 h及短于4 h后的獲毒個體數(shù)之間存在顯著差異(ν1=5，ν2=12，F(xiàn)=5.30>F0.05=3.11)，對于470 μL/L濃度處理，取食16 h后的灰飛虱獲毒個體數(shù)就與取食4 h及短于4 h后的獲毒個體數(shù)之間存在顯著差異(P<0.05)；其他時間處理間灰飛虱獲毒個體數(shù)盡管有差異，但沒有達到顯著水平。研究還發(fā)現(xiàn)，3個不同CO2濃度處理對灰飛虱的獲毒個體數(shù)影響不明顯。除取食4 h的處理外，相同取食時間、不同CO2濃度處理之間灰飛虱的獲毒個體數(shù)雖有差異但都沒有達到顯著水平(ν1=2，ν2=6，F(xiàn)=0.60

2.2 大氣CO2不同濃度對灰飛虱傳毒的影響

圖1 相同時間不同CO2濃度條件下的灰飛虱獲毒個體數(shù)Fig.1 The number of Laodelphax striatellus (Fallén) acquired viruses in different carbon dioxide concentrations at the ame time

圖2 相同CO2濃度不同處理時間條件下的灰飛虱獲毒個體數(shù)Fig.2 The number of Laodelphax striatellus (Fallén) acquired viruses in the same carbon dioxide concentration and different treatment time

研究指出，不同的CO2濃度條件對灰飛虱的傳毒力有影響。在所設定的3個CO2濃度中，470 μL/L傳毒能力最強。無論是帶毒灰飛虱在無毒水稻上取食2.0 h、4.0 h還是8.0 h，稻苗的獲毒比例均是470 μL/L處理表達量最大，且與對照(370 μL/L)和570 μL/L之間均存在顯著差異，而對照(370 μL/L)與570 μL/L處理之間沒有顯著差異。研究結(jié)果還顯示，在設定的3個CO2濃度下，帶毒灰飛虱只要取食無毒稻株1.0 h，水稻中就能檢測到條紋病毒，說明灰飛虱的傳毒速度是相當快的。當然，稻苗獲毒的比例與灰飛虱在稻株上的取食為害時間有關：如CO2570 μL/L的濃度處理，灰飛虱為害8.0 h后稻株體內(nèi)的獲毒量是取食為害1.0 h的20倍(圖3)。

水稻條紋病毒CP蛋白基因檢測的結(jié)果還顯示，本研究除個別稻株內(nèi)沒有檢測到病毒存在(圖4(3)的A2處理)，絕大多數(shù)處理的稻葉中都檢測到病毒。說明本試驗采用的檢測方法既靈敏、也能作為檢測灰飛虱傳毒速率的重要手段。

圖3 不同CO2濃度對灰飛虱取食水稻1 h、2 h、4 h、8 h后稻株內(nèi)RSV相對actin表達量的影響Fig.3 The quantity of rice carried RSV relative to actin after fed by Laodelphax striatellus for 1 h, 2 h, 4 h, 8 h

(1)370 μL/L(CK)處理(CK treatment)

(2)470 μL/L處理(470 μL/L treatment)

(3)570 μL/L處理(570 μL/L treatment)

注：每個處理重復3次，如A1、A2、A3。Note:Each treatment with three replicates, such as A1, A2 and A3.

3 結(jié)論與討論

Awmack等(1996)在研究CO2濃度升高對取食韌皮部害蟲的影響時指出，處理較短時間，害蟲的歷期不會發(fā)生變化；而處理多個世代后，其生長發(fā)育受到極大影響，發(fā)育速率明顯加快。朱橙(2009)的研究也發(fā)現(xiàn)，CO2濃度增加對灰飛虱的存活沒有明顯的影響，但是到第3代時存活率明顯提高。由此可見，大氣CO2濃度升高對昆蟲的作用表現(xiàn)出一個長期的影響、多代的效應。本研究結(jié)果顯示，不同CO2濃度處理對當代灰飛虱獲毒的影響很小。至于灰飛虱在不同濃度的CO2條件下連續(xù)飼養(yǎng)幾代后的獲毒率是否發(fā)生變化值得進一步研究。

不同大氣CO2濃度對灰飛虱獲毒力的影響前人沒有相關研究報道。本研究表明，3個不同的CO2濃度對灰飛虱的獲毒影響小。如果設置更高的CO2濃度，對灰飛虱的獲毒是否有影響還需要做進一步探討；同時本研究用的是分蘗期的水稻，灰飛虱在水稻不同生育期取食對獲毒率有沒有影響也需要作深入分析。

營養(yǎng)補償假說(Nutrient Complementation Hypothesis)指出，高CO2濃度能導致植物營養(yǎng)成分的改變，即植株含氮量降低和C:N比值增加(Bernd and Martine，1999)；林舜華等(1997)對遼東櫟的研究表明，高CO2濃度下暗呼吸略微下降但不明顯。郭建平等(2002)研究結(jié)果表明：高溫、高濃度CO2會加快植物的生長進程，促進植物生長速度。本研究結(jié)果顯示：在570 μL/L CO2濃度條件下，稻株的獲毒比例小，而370 μL/L(CK)、470 μL/L CO2濃度條件下稻株的獲毒比例高。推測原因可能有二：一是高濃度的CO2條件抑制了灰飛虱的取食；二是高濃度的CO2條件干擾了寄主植物(水稻)的新陳代謝，進而影響稻株體內(nèi)條紋病毒的表達，具體原因還有待于深入研究。

2）反思日志：反思日志是最常用的方法，對日常教學進行有規(guī)律的記錄。日志內(nèi)容可包括對教學內(nèi)容、過程、方法以及效果的思考與反思，記錄典型教學案例并進行反思，在反思的同時會提出相應的解決方案。反思日志是日后教師進行反思的基礎，。

據(jù)觀察，長江中下游稻區(qū)近幾年發(fā)生的水稻條紋葉枯病主要是由攜毒的遷出代灰飛虱成蟲傳播的，而從攜毒灰飛虱為害稻株到植株顯示病害癥狀最快需要12 d，最慢需要38 d(孫祥良等，2008)。芮明方等(2007)研究也指出，水稻條紋病毒在稻株體內(nèi)的潛伏期較長。所以如何快速、準確地對稻苗、越冬寄主植物和灰飛虱是否帶毒進行檢測意義重大：第一，如果掌握了灰飛虱和越冬寄主植物的帶毒情況，就可以進一步預測遷入秧苗田的灰飛虱的帶毒情況；第二，如果掌握了水稻秧苗是否帶毒，就能主動出擊，采取及時、有效的措施控制病害發(fā)生。因此，有必要對灰飛虱、主要越冬寄主植物及稻苗帶毒情況進行檢測。本研究采用提取水稻RNA的方法進行測定，在灰飛虱為害1 h后就能檢測到稻株體內(nèi)是否獲毒，而且精度比較高，讓快速、準確掌握水稻或越冬寄主植物體內(nèi)帶毒情況成為可能，更為精準測報稻田內(nèi)條紋葉枯病的發(fā)生提供了預警與防范。

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TheimpactofdifferentCO2concentrationsontheacquisitionandtransmissionofvirusesinLaodelphaxstriatellus(Fallén)

FENG Ya-Qing1,2, ZHANG Yan1,3, SU Hong-Hua1, YANG Yi-Zhong1*

(1. School of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China; 2. GuanNan Agricultural Technology Extension and Service Center, Lianyungang 222500, Jiangsu Province, China; 3. Nantong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, NanTong 226000, Jiangsu Province, China)

In this early century, stripe virus disease which was caused by rice stripe virus (RSV) transmitted by the small brown planthopperLaodelphaxstriatellus(Fallén), had brought great damages to rice production in Yangtze River region. Effects of CO2concentration in the atmosphere (370 μL/L (the current concentration), 470 μL/L and 570 μL/L) on the acquisition and transmission of viruses inL.striatelluswere studied using a simulation chamber method. The results showed that the number ofL.striatellusthat acquired viruses was proportional to their feeding time, that is, the longer they fed on infected rice plants, the moreL.striatellusacquired viruses. Although there was a difference in the number of infectedL.striatellusafter identical feeding times under different CO2concentrations, this difference was not statistically significant. Due to a long lag between RSV acquisition of rice and symptom occurrence, the RNA of rice plants was extracted to analyze the transmission of viruses inL.striatellususing RT-PCR technique. The results showed that CO2concentration had some influence on the transmissibility of viruses inL.striatellusand that the transmissibility of viruses inL.striatelluswas highest under 470 μL/L CO2. Furthermore, as long asL.striatellusfed on the rice plants for 1 h, RSV could be detected in the plants under the three concentrations of CO2, which indicates that the transmission of viruses byL.striatellusis very rapid.

CO2concentration;Laodelphaxstriatellus(Fallén); rice stripe virus (RSV); virus acquisition and transmission

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Q968.1;S433.39

A

1674-0858(2017)05-1048-06

國家自然科學基金項目(30771416)；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程(SXGC[2016]246)

封亞青，女，1983年生，江蘇灌南人，碩士研究生，研究方向為昆蟲生態(tài)學，E-mail：260459269@qq.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: yzyang@yzu.edu.cn

Received: 2016-05-13; 接受日期Accepted: 2017-06-12