馬永生，張曉冬，尹彥超，周姍，胡婷，高智強(qiáng)，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100102

烏拉爾甘草查耳酮異構(gòu)酶基因多態(tài)性分析

馬永生，張曉冬，尹彥超，周姍，胡婷，高智強(qiáng)，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100102

目的：對(duì)烏拉爾甘草黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶查耳酮異構(gòu)酶（CHI）進(jìn)行基因克隆及多態(tài)性分析。方法：取5株烏拉爾甘草新鮮根樣，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，利用特異引物克隆烏拉爾甘草CHI基因，測序并對(duì)所得序列進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果：共獲得62條全長為690bp的烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列，編碼229個(gè)氨基酸殘基。多態(tài)性分析顯示62條CHI基因cDNA序列存在47個(gè)變異位點(diǎn)，可分為20種不同單倍型（單倍型1～20），其相似度為99.62％；氨基酸序列存在30個(gè)變異位點(diǎn)，可分為16種類型（AA1～AA16），一致性為98.99％。CHI基因編碼蛋白為穩(wěn)定性親水蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為24 400，等電點(diǎn)為5.3～6.7，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)卷曲為主。同源性分析顯示，該基因序列與豆科植物大豆的CHI基因親緣性最近。結(jié)論：克隆了烏拉爾甘草CHI基因并對(duì)其進(jìn)行了多態(tài)性分析，為進(jìn)一步探究CHI基因?qū)Ω什蒈丈锖铣傻姆肿诱{(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

烏拉爾甘草；查耳酮異構(gòu)酶；甘草苷；基因克??；多態(tài)性分析

烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）為豆科甘草屬植物。2015版《中國藥典》規(guī)定栽培甘草的檢測指標(biāo)為：甘草酸含量不低于2.0％，甘草苷含量不低于0.50％[1]，因此甘草苷是評(píng)價(jià)甘草質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。大量藥理學(xué)研究表明，甘草苷具有抗癌、抗糖尿病、抗病毒、抗抑郁等多種藥理活性[2]。《中國藥典》規(guī)定甘草有3種基原植物，即烏拉爾甘草、光果甘草（G.glabra L.）及脹果甘草（G.inflata Bat.）。本課題組前期對(duì)這3種基原甘草進(jìn)行了4種主要黃酮類化合物的含量分析[3]，發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草中甘草苷含量明顯高于其他2種基原植物。因此，對(duì)烏拉爾甘草中甘草苷的生物合成途徑開展相關(guān)研究，將有助于揭示高甘草苷積累的分子機(jī)制。

多種酶參與甘草苷的生物合成，其中查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）催化分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，是甘草苷生物合成的關(guān)鍵酶之一[4]。1987年，研究者利用抗體技術(shù)首次從法國豌豆（Pisum sativum L.）中分離得到CHI基因[5]，隨后陸續(xù)從矮牽牛（Petunia hybrida Vilmorin）[6]、菜豆（Phaseo?lus vulgaris L.）[7]、野茶樹（Camellia sinensis K.）[8]等植物中克隆得到該基因。迄今，GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊了1164條植物CHI的DNA序列及278條cDNA序列。有報(bào)道顯示，過表達(dá)CHI基因的甘草毛狀根中黃酮類化合物的含量明顯提高[9]，從而證明了CHI基因?qū)Ω什蔹S酮生物合成的明確影響。然而，CHI基因在同一植物中通常以多拷貝形式存在，關(guān)于CHI基因多態(tài)性對(duì)黃酮代謝途徑影響的相關(guān)研究尚未見諸報(bào)道。

我們對(duì)烏拉爾甘草中甘草苷生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因CHI進(jìn)行了克隆及多態(tài)性分析，并對(duì)其主流單倍型做生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步揭示CHI基因多態(tài)性對(duì)甘草苷生物合成的影響機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為篩選甘草優(yōu)良基因、分子育種、提高栽培甘草質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取5株新鮮烏拉爾甘草主根，立即液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD-19T載體、ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、M-MLV（Rnase H-）反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司；LA-Taq DNA聚合酶、oligo（dT）購于TaKaRa公司。微量移液器（Eppendorf公司）；1-13000型離心機(jī)（Sigma公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；BG-gdsAUTO510型凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）；酶標(biāo)儀（Biotek Epoch公司）。

1.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

取新鮮烏拉爾甘草主根于液氮中迅速研磨成細(xì)粉，取適量用ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒逐步提取總RNA，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，用酶標(biāo)儀對(duì)所得RNA的D260nm/D280nm值及濃度進(jìn)行測定，以確定RNA的純度和濃度。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以oligo（dT）為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3 烏拉爾甘草CHI基因擴(kuò)增及測序

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，用Primer 5.0設(shè)計(jì)上游引物GF（5′-ATGGCGGGAGCAGCACCAGTA-3′）、下 游引物 GR（5′-TCAGTTTCCGTTTCCAAT-3′），采用50μL反應(yīng)體系[包括模板cDNA 2.0μL、10×緩沖液 5.0μL、dNTP（2.5mmol/L）5.0μL、引物 GF和 GR 各 2.0μL（5μmol/L）、LA-Taq 酶 1.0μL、無RNase的水33.0μL]進(jìn)行PCR（反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min；95℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存），經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。將膠回收產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含有氨芐西林（Amp，50 mg/L）的LB平板上培養(yǎng)，每個(gè)樣品隨機(jī)挑取20個(gè)以上單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測至飽和。

1.4 烏拉爾甘草CHI生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN對(duì)所得CHI序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用Editseq將其翻譯成氨基酸序列，通過DNASTAR7.0、ExPASy等分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及基本理化性質(zhì)，并通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫查找其他物種的CHI序列，利用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 烏拉爾甘草CHI的克隆及序列分析

共獲得62條長度約為690bp的烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列（圖1），與目標(biāo)條帶長度一致。測序結(jié)果顯示，所得62條cDNA序列長度均為690bp。DNAMAN比對(duì)結(jié)果顯示62條cDNA序列中存在47個(gè)變異位點(diǎn)，可確定為20種單倍型（1～20），一致性為99.62％，各單倍型變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)于表1。20種烏拉爾甘草CHI單倍型均編碼229個(gè)氨基酸殘基，可確定為16種氨基酸序列類型（AA1～AA16），一致性為 98.99％，存在 30個(gè)變異位點(diǎn)，詳見表2。

表1 20種烏拉爾甘草CHI基因單倍型變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表

在GenBank中對(duì)20種烏拉爾甘草CHI單倍型進(jìn)行注冊，序列登錄號(hào)及各序列所占比例見表3。在62條烏拉爾甘草CHI cDNA序列中，單倍型3為19條，出現(xiàn)頻率最高（30.7％），為主流單倍型；單倍型3、8、13、18及20編碼相同的氨基酸序列，即AA3，其所占比例可達(dá)43.5％，為主流氨基酸序列類型，推測其在甘草苷生物合成中起關(guān)鍵作用。

2.2 烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列理化性質(zhì)分析

通過ExPASy在線分析了16種烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列的基本理化性質(zhì)，結(jié)果如表4。烏拉爾甘草CHI編碼蛋白由229個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為24 400，等電點(diǎn)為5.3～6.7；總平均親水性（GRAVY）均為負(fù)值，表明烏拉爾甘草CHI為親水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，表明其為穩(wěn)定性蛋白；半衰期為30h

圖1 烏拉爾甘草CHI擴(kuò)增結(jié)果

表2 16種烏拉爾甘草CHI氨基酸序列變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表

2.3 烏拉爾甘草CHI的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

以主流氨基酸序列AA3為目標(biāo)序列，利用DNASTAR7.0和ExPASy分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2，α螺旋占34.06％，β轉(zhuǎn)角占11.79％，延長鏈占21.40％，無規(guī)卷曲占32.75％。SWISS-MODEL在線預(yù)測的AA3三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3，表明CHI含有較多的α螺旋和無規(guī)卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測相符。

2.4 烏拉爾甘草CHI同源性分析

按照親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，從NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選了有代表性的17個(gè)物種的CHI氨基酸序列，利用DNAMAN將本研究獲得的16條烏拉爾甘草CHI氨基酸序列與其進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)相似度最高的為豆科植物大豆（Glycine max）（75.55％），相似度最低的為單子葉植物大葉藻（Zostera mari?na L.）（13.28％）。利用 ClustalW1.8和 MAGA5.1，將上述33條CHI氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），所有序列聚類可聚為3支，所有豆科植物聚為1支，其他雙子葉植物聚為1支，單子葉植物聚為1支。在豆科植物中，16條烏拉爾甘草CHI氨基酸序列單獨(dú)聚為1小支。整體而言，烏拉爾甘草CHI氨基酸序列與大豆在進(jìn)化關(guān)系上相距最近，而與大葉藻和玉米在進(jìn)化關(guān)系上最遠(yuǎn)，這與序列比對(duì)分析結(jié)果相符。

表3 烏拉爾甘草20種CHI單倍型GenBank登錄號(hào)及所占比例

表4 烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列理化性質(zhì)

圖2 烏拉爾甘草CHI二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3 烏拉爾甘草CHI三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

甘草作為我國最常用的大宗藥材之一，國內(nèi)外需求量巨大。但由于野生甘草資源匱乏，近年來國務(wù)院明令禁止采挖野生甘草，因此栽培甘草已成為商品甘草的主流產(chǎn)品。本課題組前期對(duì)來自全國7個(gè)甘草主產(chǎn)區(qū)的532株兩年生栽培甘草樣品的調(diào)查研究顯示，栽培甘草中甘草苷的含量差異十分顯著，分布范圍為0.058％～3.43％，且60％左右的栽培甘草中甘草苷的含量難以達(dá)到藥典規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重影響到栽培甘草的質(zhì)量。而功能基因的多態(tài)性是影響甘草質(zhì)量的重要分子基礎(chǔ)，因此對(duì)甘草黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵功能基因開展研究，對(duì)于提高栽培甘草質(zhì)量具有深遠(yuǎn)意義。

CHI作為黃酮類化合物生物合成的關(guān)鍵酶之一，是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的類黃酮生物合成的相關(guān)酶。目前，CHI已經(jīng)在矮牽牛[11]、銀杏（Ginkgo bi?loba L.）[12]、百合（Lilium speciosum T.）[13]等多種植物中得到克隆。此外，在一些細(xì)菌和真菌中也克隆到CHI基因[14]。本研究共克隆得到62條烏拉爾甘草CHI序列，可分為20種單倍型，其一致性相對(duì)較好，為99.62％，主流單倍型為單倍型3，所占比重為30.7％。20種CHI單倍型編碼16條氨基酸序列，一致性為98.99％，主流氨基酸序列類型為AA3，所占比重為43.5％，因此推測AA3在甘草苷的生物合成中起關(guān)鍵作用。但是，CHI在不同物種間同源性相對(duì)較低，聚類分析顯示同源性相對(duì)最近的大豆CHI與本實(shí)驗(yàn)中所得烏拉爾甘草CHI序列的一致性也只有75.55％，因此給同源克隆造成一定的難度。

植物CHI是否表達(dá)及表達(dá)量的高低都會(huì)影響黃酮含量的變化，如缺乏CHI的玉米突變體，其查耳酮積累下降，導(dǎo)致玉米呈現(xiàn)古銅色[15]；通過對(duì)黃芩毛狀根CHI基因過表達(dá)或基因沉默處理，發(fā)現(xiàn)其黃酮含量相應(yīng)地增加或減少[16]；將紅花CHI轉(zhuǎn)到擬南芥中過表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥中黃酮含量比野生型擬南芥高2.3倍[17]；此外，還有研究表明，在西紅柿中超量表達(dá)矮牽牛CHI，結(jié)果導(dǎo)致果皮中黃酮醇含量比對(duì)照品高78倍[18]。這些研究在一定程度上說明了CHI在黃酮代謝途徑中的重要性。本研究克隆得到20種甘草CHI單倍型，這將為進(jìn)一步分析甘草中CHI基因多態(tài)性與甘草苷生物合成的相關(guān)性，以及提高栽培甘草中甘草苷的含量奠定基礎(chǔ)。

圖4 CHI系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

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Polymorphism Analysis of Chalcone Isomerase Gene of Glyc?yrrhiza uralensis Fisch.

MA Yong-Sheng,ZHANG Xiao-Dong,YIN Yan-Chao,ZHOU Shan,HU Ting,GAO Zhi-Qiang,LIU Ying*
School of Life Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China
*Corresponding author,E-mail:liuyliwd@sina.com

Objective:To clone and analyze chalcone isomerase（CHI） gene of Glycyrrhiza uralensis Fisch.Meth?ods:RNA was extracted from the fresh root of G.uralensis,cDNA was reversely transcribed,and then CHI was cloned using specific primers.The obtained CHI cDNA sequences were analyzed using bioinformatics.Results:Six?ty-two CHI cDNA sequences with a full length of 690bp were obtained.Forty-seven variable sites were present in these CHI cDNA sequences,and twenty haplotypes were determined,the similarity of which was 99.62％.Thir?ty variable sites were present in the amino acid sequences,and sixteen types were determined,the similarity of which was 98.99％.Bioinformatic analysis shows that G.uralensis CHI cDNA sequence has a complete open read?ing frame,encoding a stable hydrophilic protein with 229 amino acids.Its isoelectric point is between 5.3 and 6.7,molecular weight is about 24.4 kD.Most of secondary structure are α-helix and random coil.The homolo?goue analysis indicates it has the closest relationship to Glycine max.Conclusion:The CHI cDNA of G.uralensis was successfully cloned and analyzed.And we hope this work will provide a basis for exploring the function of CHI and revealing the molecular regulation mechanisms of liquiritinin biosynthesis in G.uralensis.

Glycyrrhiza uralensis Fisch.;chalcone isomerase;liquiritinin;clone;polymorphism analysis

Q943.2

A

1009-0002（2017）04-0471-07

2017-01-12

北京中醫(yī)藥大學(xué)杰出青年人才項(xiàng)目（2016JYBXJQ002）

馬永生（1993- ），男，碩士研究生，（E-mail）mayscn@126.com

劉穎，（E-mail）liuyliwd@.sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.013