劉美琳，董佳悅，安太勇，李楊，張梅

不同提取方法對波棱瓜子多糖提取率的影響

劉美琳，董佳悅，安太勇，李楊，張梅*

目的：考察用不同提取方法(回流提取法、超聲波輔助提取法)對波棱瓜子多糖提取率的影響。方法：用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交實驗確定最佳提取工藝條件。結(jié)果：回流提取的最佳工藝條件為在100 ℃的水浴條件下，1：40(g：mL)的料液比，提取3 h，提取2次，多糖提取率為1.47%。超聲波輔助提取的最佳工藝條件為在60 ℃水溫條件下，以1：10(g：mL)的料液比，超聲強(qiáng)度300 W、超聲處理時間20 min，超聲1次，多糖提取率為1.32%。結(jié)論：通過對兩種方法最佳工藝的比較，回流法較超聲法多糖提取率提高11%，回流法優(yōu)于超聲法，但差異無顯著性。

波棱瓜子；多糖；正交實驗；回流提取法；超聲波輔助提取法

波棱瓜子系葫蘆科波棱瓜屬植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall. (H. pedunculosum(Ser.) Baill) 的干燥成熟種子，是一種常用藏藥。具有清腑熱，膽熱的功效，用于治療赤巴入臟腑，肝、膽熱癥(肝炎，膽囊炎)，消化不良等癥[1]。波棱瓜子中主要含脂肪油、木脂素、多糖類等活性成分[2-4]。課題組前期研究表明，波棱瓜子多糖具有抗免疫性肝損傷作用。為進(jìn)一步深入開展波棱瓜子多糖的研究，本文在前期實驗基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，對波棱瓜子多糖提取方法進(jìn)行考察。分別采用熱水回流提取法、超聲波輔助提取法提取波棱瓜子中的多糖，比較波棱瓜子多糖的提取率，獲得最佳的提取工藝條件。

1 材料

1.1 藥材

波棱瓜子，2015年10月購于四川甘孜，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院裴瑾教授鑒定為葫蘆科植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall．的干燥成熟種子。

1.2 儀器

UV-2600型紫外-可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；BT 125D型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試劑

D-無水葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201205)，濃硫酸、苯酚、正丁醇、三氯甲烷、無水乙醇、石油醚(60-90℃) 等均為分析純；蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 回流法 波棱瓜子粉碎(過10目篩)，石油醚回流脫脂，濾渣按一定比例加入蒸餾水，水浴回流提取，減壓濃縮，Savage法除蛋白，加入6倍體積的無水乙醇，醇沉過夜（靜置24 h），濾過。取沉淀，精密稱取25 mg，加蒸餾水溶解并定容至25 mL。精密吸取上述溶液4 mL，加蒸餾水定容至25 mL。

2.1.2 超聲波輔助提取法 取波棱瓜子粉末，除提取方式為超聲提取，其余同 “2.1.1”項下相同方法處理。

2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10 mg，加蒸餾水溶解制成0.1 mg/mL貯備液。分別準(zhǔn)確吸取上述溶液5、10、15、20、25、30、35、40 mL于50 mL容量瓶中，定容。準(zhǔn)確吸取2 mL置于10 mL具塞試管中，分別加入新制成5%的苯酚溶液0.2 mL，搖勻，迅速加入4 mL濃硫酸，充分搖勻，另取2 mL蒸餾水按同樣顯色條件作空白對照，置60 ℃水浴15 min，冰水浴冷卻至室溫。在400-600 nm內(nèi)掃描，最大吸收波長為488 nm。在488 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖對照品溶液濃度(μg/mL)作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度(A)作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.0126 X+0.0014 (n=6，r=0.9995)。結(jié)果表明在10～80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 波棱瓜子多糖含量測定 精密量取供試品溶液2 m L，置10 m L具塞刻度試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法測定吸光度，從回歸方程中求出供試品溶液中葡萄糖的濃度，計算公式如下[8]：

（其中，V：樣品溶液體積（ml）；C：多糖供試液中葡萄糖的濃度（μg/ml）；D：樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m：稱取樣品的質(zhì)量（mg））

2.3 正交實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以料液比、時間、溫度、提取次數(shù)等為考察因素，設(shè)計L9(34)正交實驗來確定回流提取法(表1)、超聲波輔助提取法(表2)提取波棱瓜子多糖的最佳提取工藝。

表1 回流提取法正交實驗各因素水平表

表2 超聲輔助提取法正交實驗各因素水平表

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 回流提取法提取波棱瓜子多糖工藝的研究 根據(jù)單因素實驗確定回流提取法提取波棱瓜子多糖的適宜條件為：料液比1∶60，提取時間2 h，提取溫度100 ℃，提取次數(shù)固定為2次，在此基礎(chǔ)上以提取率作為評價指標(biāo)進(jìn)行正交實驗，結(jié)果見表3、表4。

由表3可知，影響波棱瓜子多糖提取的主要因素依次為：A＞C＞B，即提取溫度＞料液比＞提取時間，由表4的進(jìn)一步方差分析得知，提取溫度對波棱瓜子多糖得率的影響最大，達(dá)顯著水平。根據(jù)正交實驗結(jié)果，波棱瓜子多糖多糖回流提取最佳方案為A3B2C1，即提取溫度100 ℃，提取時間3 h，料液比1：40。在最佳工藝方案下回流提取多糖的提取率為1.48%。

表3 正交實驗設(shè)計與結(jié)果分析

k2 1.0998 1.0660 0.9483 k3 1.3917 1.0204 1.0517 R 0.7701 0.0456 0.1091

表4方差分析表

2.4.2 超聲波輔助提取法提取波棱瓜子多糖工藝的研究 根據(jù)單因素實驗確定超聲波輔助提取法提取波棱瓜子多糖的適宜條件為：固定超聲功率300 w，料液比1：10，超聲時間60 min，提取溫度80 ℃，超聲次數(shù)1次，在此基礎(chǔ)上以提取率作為評價指標(biāo)進(jìn)行正交實驗，結(jié)果見表5、表6。

表5 正交實驗設(shè)計與結(jié)果分析

表6 方差分析表

由表5可知，各因素影響順序依次為：C＞A＞B，即料液比＞超聲溫度＞超聲時間，由表6的進(jìn)一步方差分析得知，超聲溫度和料液比對波棱瓜子多糖提取有顯著性影響。根據(jù)正交實驗結(jié)果，波棱瓜子多糖超聲提取最優(yōu)方案是A1B1C1，即在60 ℃水溫，超聲功率300 W的條件下，以料液比1：10，超聲提取20 min。在最優(yōu)提取方案下超聲提取多糖的提取率為1.39%。

2.4.3 驗證實驗

表7 不同方法提取波棱瓜子多糖的比較(n=3)

3 結(jié)論與討論

本實驗比較了2種不同方法提取波棱瓜子多糖，回流提取法所得工藝的最優(yōu)組合是在100 ℃水浴條件下，以料液比1：40(g：mL)，提取時間3 h，提取2次，波棱瓜子多糖的平均提取率為 1.47 %。超聲波輔助提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為在60 ℃水溫，300 w超聲功率條件下，以1：10(g：mL)的料液比，提取1次，每次提取20 min，波棱瓜子多糖的平均提取率為 1.32 %，回流提取法提取率比超聲法提取率高11%，但差異性不顯著。

回流提取多糖成本較低，不需要特殊設(shè)備，但需較高溫度，提取時間較長。而超聲法提取多糖能源消耗少，提取時間短，操作簡單，但超聲波的機(jī)械剪切作用，可能導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)的改變。綜上所述，不同的提取工藝各具優(yōu)勢，在今后的研究和生產(chǎn)中可根據(jù)實際情況選擇合適的提取工藝。

[1] 楊永昌.藏藥志[M].青海人民出版社.第一版,1991：441.

[2] 陳璐,張梅,李春沁,等. 波棱瓜子乙酸乙酯提取物對小鼠免疫性肝損傷的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2014,03：111-113.

[3] 陳璐,張梅,雷有成,等. 波棱瓜子脂肪油抗免疫性肝損傷的譜效關(guān)系研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,11：123-126.

[4] 李春沁,王紫燕,唐慧君,等. 波棱瓜子多糖對刀豆蛋白A所致小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中藥藥理與臨床，2015,04：94-97.

[5] 程振玉,宋海燕,楊英杰,等. 不同提取方法對北五味子多糖提取率的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,01：159-163+167.

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[7] 王月囡,辛廣,翁霞. 兩種不同方法提取枸杞多糖的比較研究[J]. 鞍山師范學(xué)院學(xué)報,2010,04：39-43.

[8] 勾建剛,劉春紅. 白茅根多糖超聲提取的優(yōu)化[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2007,11：2749-2750.

Study on the effect of different extraction process on extraction ratio of polysaccharide from Bolengguazi/

LIU Mei-lin,DONG Jia-yue, AN Tai-yong, LI Yang, ZHANG Mei//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: The effect of various extraction (re fl ux extraction, ultrasonic assisted extraction) process on extraction ratio of polysaccharide from Bolengguazi was studied. Method: The content of polysaecharides were detected by phenol—sulfuirc acid colorimetrictitration method. The best extraction process was determined by orthogonal experiment based on the result of single factor experiment. Result: The best extraction process for reflux extraction method was to extract 2 times (3 h/times) with the ratio of material to liquid for 1：40 (g：mL) in 100 ℃water bath. The extraction rate of polysaccharide reached 1.47% under the best condition. The best process for the ultrasonic assisted extraction method was to extract 1 times (20 min/times) with the ratio of material to liquid for 1：10 (g：mL) in 60℃ water bath, ultrasonic power 300 W. And the extraction rate of polysaccharide reached 1.32% under the best condition. Conclusion: The re fl ux extraction yield increase nearly 11% compared with that of ultrasonic assisted extraction. However, there is no significant difference between the two extraction methods in extraction efficiency of Bolengguazi polysaccharide .

Bolengguazi; polysaccharide; orthogonal test; re fl ux extraction；ultrasonic assisted extraction

R 283.6

A

1674-926X(2017)04-008-03

四川省科技支撐項目(2013SZ0114)

成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地 四川 成都 611137

劉美琳，中藥學(xué)專業(yè)在讀碩士Tel：18782984265 Email：674894419@qq.com

張梅，教授，博士生導(dǎo)師Tel：028-61800231 Email： zhangmei63@126.com

2017-1-15

(責(zé)任編輯：傅舒)