徐陌，陳志軍，桂照華，陳丹蕾，趙浩東，楊帆，汪思應(yīng)*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，合肥 230032； 2. 重慶市云陽縣人民醫(yī)院，重慶4045000)

研究報告

飲酒促進(jìn)TA2小鼠乳腺癌的發(fā)生及機制探討

徐陌1，陳志軍2，桂照華1，陳丹蕾1，趙浩東1，楊帆1，汪思應(yīng)1*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，合肥 230032； 2. 重慶市云陽縣人民醫(yī)院，重慶4045000)

目的探討酒精是否促進(jìn)小鼠乳腺癌的發(fā)生及可能的作用機制。方法建立飲酒TA2小鼠模型，用ANALOX AM1酒精分析儀檢測TA2小鼠血液的酒精濃度，確保動物模型的建立；觀察比較酒精組TA2小鼠(飲用含2%酒精的無菌水)與對照組TA2小鼠(飲用不含酒精的無菌水)的乳腺癌發(fā)生率、腫瘤的生長速度以及腫瘤的大??；酶聯(lián)免疫法(ELASA)檢測兩組小鼠血清中雌激素水平的差異。結(jié)果飲酒組TA2小鼠自發(fā)乳腺癌的比例顯著增加(P<0.05)，成瘤平均天數(shù)明顯縮短(P<0.05)，生成腫瘤的重量和體積均有增加但差異無顯著性 (P>0.05)。飲酒組TA2小鼠體內(nèi)的雌激素水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)論酒精促進(jìn)TA2小鼠乳腺癌的發(fā)生，該作用可能通過雌激素水平的增加來實現(xiàn)。

酒精；TA2小鼠；乳腺癌；雌激素

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中排名第一[1]。已確定酒精是促發(fā)乳腺癌的重要危險因素，現(xiàn)有的流行病學(xué)和實驗研究表明酒精與乳腺癌風(fēng)險之間存在正相關(guān)性[2-4]。目前關(guān)于酒精促進(jìn)乳腺癌的研究主要集中在酒精可以促進(jìn)已有乳腺腫瘤的生長，增強乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[5-7]。實驗室前期也有相關(guān)研究，通過建立模擬人類飲酒狀況的飲酒小鼠(C57BL/6)模型，證明了一定濃度的乙醇(飲用水中含2%酒精)可以促進(jìn)小鼠乳腺腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，且酒精上調(diào)乳腺癌組織內(nèi)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的水平可能是酒精影響乳腺癌生長轉(zhuǎn)移的機制之一[8]。然而，目前還沒有直接的證據(jù)證明酒精可以促進(jìn)乳腺腫瘤的發(fā)生，相關(guān)的報道并不多見，具有一定的研究價值和意義。

近交系小鼠津白2(Tientsin Albinao 2, TA2)是天津醫(yī)科大學(xué)篩選培育多年建立的自發(fā)性乳腺癌高發(fā)模型。它于1969年成功繁殖，并于1984年由國際小鼠遺傳標(biāo)準(zhǔn)命名委員會認(rèn)證。TA2小鼠源于KM種小鼠，在無外部誘導(dǎo)劑或致癌物刺激時具有很高的自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率[9]。TA2經(jīng)產(chǎn)雌鼠自發(fā)乳腺癌的發(fā)生率為81%，見瘤鼠齡為330 d；未經(jīng)產(chǎn)雌鼠乳腺癌發(fā)生率為41%，見瘤鼠齡為435 d[10]。TA2自培育以來已作為動物模型成功用于多項乳腺腫瘤相關(guān)的研究：因其乳腺癌的生物學(xué)行為與人妊娠相關(guān)乳腺癌(pregnancy-associated breast cancer，PABC)極為相似，是研究PABC浸潤轉(zhuǎn)移機制的良好動物模型[11]；且有研究顯示TA2小鼠的乳腺癌細(xì)胞呈三陰性，是研究三陰性乳腺癌的理想模型[12]。

前期研究中，實驗室已成功掌握建立飲酒小鼠動物模型的方法(SPF級C57BL/6雌性小鼠)[8,13]，本實驗采用類似的方法建立飲酒TA2小鼠模型，并利用這一模型研究飲酒是否促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物

6～8周齡未經(jīng)產(chǎn)雌性TA2小鼠32只，體重18～22 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心【SCXK(晥) 2011-002】。飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心普通環(huán)境內(nèi)【SYXK(晥) 2011-007】，溫度22～25℃，晝夜明暗周期12 h/12 h。

1.1.2 主要試劑

無水乙醇(Sigma公司)；小鼠雌激素(E)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(北京華邁科生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1 TA2飲酒小鼠模型

TA2小鼠隨機分為兩組(對照組和模型組各16只)，酒精組(n=16)的小鼠自晚上8:00開始給予含2%酒精的飲用水(2 mL無水乙醇+98 mL滅菌水配制100 mL含2%酒精的飲用水)12 h，次日上午8:00更換為常規(guī)飲用水至晚上8:00，如此往復(fù)。對照組(n=16)的小鼠僅提供常規(guī)滅菌飲用水。每天監(jiān)測常規(guī)水與含酒精的水的消耗，對照組和酒精組之間的液體攝入差異無顯著性。在早上8:00用1 mL注射器收集小鼠尾靜脈血，用Analox AM1酒精分析儀(Analox Instruments，Lunenburg，MA)測定血液乙醇濃度(BEC)。

1.2.2 動物實驗

觀察記錄兩組TA2小鼠自發(fā)乳腺腫瘤的時間，待自發(fā)腫瘤后小鼠生長至瀕死狀態(tài)時(約1年的時間)，結(jié)束實驗，頸椎脫臼法處死小鼠，取出自發(fā)成瘤的腫瘤組織，稱取腫瘤組織的重量，并記錄腫瘤組織的體積，體積基于下式計算：V=1/2×a×b2(用刻度盤測量腫瘤的兩個垂直尺寸徑，a為腫瘤最長徑，b為腫瘤最短徑)。

1.2.3 TA2小鼠血清雌激素水平檢測

實驗結(jié)束后，小鼠眼球取血，室溫靜置1～2 h后4℃離心(一般4000 r/min,離心20 min)，得到的上清液即為血清，可小心將上清吸出(注意切勿吸出細(xì)胞成分)，分裝后置于-80℃保存或立即檢測，采用小鼠雌激素(E)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測小鼠血清雌激素水平，嚴(yán)格遵循說明書的步驟操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1飲酒對TA2小鼠腫瘤發(fā)生率的影響

根據(jù)實驗方法將具有自發(fā)乳腺癌特性的TA2小鼠分為酒精組和對照組，實驗結(jié)束時，酒精組TA2小鼠10只自發(fā)乳腺腫瘤，發(fā)生率為62.5%(10/16)，而對照組僅7只小鼠自發(fā)乳腺腫瘤，發(fā)生率為43.75%(7/16)。酒精組TA2小鼠的自發(fā)乳腺腫瘤的發(fā)生率明顯高于對照組。如圖1。

2.2飲酒對TA2小鼠腫瘤自然發(fā)生時間的影響

分別記錄實驗組與對照組各小鼠自發(fā)乳腺腫瘤的自然發(fā)生時間，對照組TA2小鼠平均見瘤鼠齡335 d，2%酒精組TA2小鼠平均見瘤鼠齡285 d。酒精組TA2小鼠自發(fā)乳腺腫瘤的時間較對照組明顯縮短(P<0.05)，差異具有顯著性。如圖2。

注：與對照組比，*P<0.05。圖1 飲酒對TA2小鼠腫瘤發(fā)生率的影響Note. Compared with the control group, *P<0.05.Fig.1 Effect of ethanol on the incidence of breast cancer in TA2 mice

注：與對照組比，*P<0.05。圖2 飲酒對TA2小鼠腫瘤自然發(fā)生時間的影響Note. Compared with the control group, *P<0.05.Fig.2 Effect of ethanol on the time of spontaneous mammary tumor formation

2.3飲酒對TA2小鼠自發(fā)腫瘤重量的影響

待TA2小鼠自發(fā)乳腺腫瘤后生長至瀕死狀態(tài)，處死小鼠，取出小鼠腫瘤組織測量其重量，2%酒精組TA2小鼠腫瘤的平均重量略高于對照組，但差異無顯著性(P>0.05)。如圖3。

2.4飲酒對TA2小鼠自發(fā)腫瘤體積的影響

按照實驗方法測量各腫瘤組織的最長徑和最短徑，并計算腫瘤體積大小，飲用2%酒精的小鼠腫瘤體積略大于對照組，但差異無顯著性(P>0.05)。如圖4。

2.5飲酒對TA2小鼠血清雌激素水平的影響

為了進(jìn)一步研究酒精促進(jìn)TA2小鼠自發(fā)乳腺腫瘤的機制，我們通過EILSA 實驗檢測小鼠血清中雌激素水平，結(jié)果顯示酒精組TA2小鼠的血清雌激素水平明顯高于對照組 (P<0.05)，差異有顯著性。如圖5。

圖3 飲酒對TA2小鼠自發(fā)腫瘤重量的影響Fig.3 Effect of ethanol on the tumor weight in the TA2 mice

圖4 飲酒對TA2小鼠自發(fā)腫瘤體積的影響Fig.4 Effect of ethanol on the tumor size in the TA2 mice

注：與對照組比，*P<0.05。圖5 飲酒對TA2小鼠血清雌激素水平的影響Note. Compared with the control group, *P<0.05.Fig.5 Effect of ethanol on the level of estrogen in the TA2 mice

3 討論

酒精是乳腺癌一個已確定的危險因素，并且以劑量依賴的方式增加乳腺癌風(fēng)險：Smith-Warner及其同事報道了酒精和乳腺癌之間的線性關(guān)系，每天飲用含有10 g酒精的飲品乳腺癌的發(fā)病率增加10%，且與飲用酒精量呈正相關(guān)(總量小于60 g/d)[2]。Singletary和Gapstur2001年也總結(jié)了酒精濫用或過度飲酒(≥3次/天)與女性乳腺腫瘤發(fā)病率增加之間的關(guān)系[3]。近年來關(guān)于飲酒與腫瘤的關(guān)系及酒精對腫瘤作用機制的研究不斷增加，但主要集中在酒精促進(jìn)腫瘤進(jìn)展及相關(guān)的分子機制的研究。本實驗室也曾在前期研究中模擬人類的飲酒狀況建立飲酒小鼠模型，并證明了一定濃度的乙醇(飲用水中含2%酒精)可以促進(jìn)C57BL/6小鼠乳腺腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，且酒精上調(diào)乳腺癌組織內(nèi)MCP-1的水平可能是酒精影響乳腺癌生長轉(zhuǎn)移的機制之一[8]。但酒精是否可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生還沒有確切的定論，相關(guān)報道也很少見。且目前的研究大都采用體外細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)⑷橄侔┘?xì)胞接種至免疫缺陷小鼠體內(nèi)，難以完全模擬人類飲酒的體內(nèi)生理狀況。本研究我們通過模擬人類的飲酒狀況建立TA2飲酒小鼠模型，并利用TA2小鼠的高發(fā)自發(fā)性乳腺癌的特性來探討飲酒與乳腺癌發(fā)生之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，當(dāng)TA2小鼠的日常無菌水中添加2%濃度的酒精后，小鼠自發(fā)乳腺癌的比例增加，發(fā)生率高達(dá)62.5%，并且成瘤平均天數(shù)縮短，生成腫瘤的重量和體積也有一定增加但不具有顯著性差異。以上結(jié)果證明了酒精可以促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。本研究為探討酒精與乳腺癌發(fā)生之間的關(guān)系提供了一種可能的實驗方法和動物模型，在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步研究酒精促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的可能作用機制。

目前已有證據(jù)證明雌激素水平的升高是乳腺癌的一個危險因素，高水平的雌激素可以通過激活雌激素途徑刺激細(xì)胞增殖從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[14]。流行病學(xué)研究顯示，飲酒的女性具有較高的雌激素水平[15]，因此有觀點認(rèn)為酒精可能通過雌激素途徑影響乳腺癌：酒精可能通過增加芳香化酶(一種將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的酶)來增加體內(nèi)的雌激素水平；也可能增加了其受體ERα的表達(dá)，使得酒精存在下乳腺癌細(xì)胞對雌激素更加敏感[4,5,16]。我們在TA2小鼠攝入酒精的同時監(jiān)測其血液的雌激素水平，飲酒組TA2小鼠體內(nèi)的雌激素水平明顯升高，這可能與更高的腫瘤發(fā)生率和腫瘤生長速率相關(guān)。

總之，酒精可以促進(jìn)TA2小鼠乳腺癌的發(fā)生，該作用可能通過增加雌激素水平而實現(xiàn)，相關(guān)作用機制還需進(jìn)一步研究和探討。鑒于越來越多的女性經(jīng)常性飲用酒精飲料，因此了解酒精如何促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，確定酒精影響乳腺癌的機制，可以為女性提供乳腺癌與酒精相關(guān)的預(yù)防建議及治療策略，降低其發(fā)生風(fēng)險，為其治療提供新的思路。

[1] Oeffinger KC, Fontham ET, Etzioni R, et al. Breast cancer screening for women at average risk: 2015 guideline update from the American Cancer Society [J]. JAMA, 2015, 314(15): 1599-1614.

[2] Smith-Warner SA, Spieflman D, Yaun SS, et al. Alcohol and breast cancer in women: a pooled analysis of cohort studies [J]. JAMA,1998, 279(7):535-540.

[3] Singletary KW, Gapstur SM. Alcohol and breast cancer: review of epidemiologic and experimental evidence and potential mechanisms [J]. JAMA, 2001, 286(17):2143-2151.

[4] Zhang SM, Lee IM, Manson JE, et al. Alcohol consumption and breast cancer risk in the women’s health study [J]. Am J Epidemiol, 2007, 165:667-676.

[5] Etique N, et al. Ethanol stimulates proliferation, ERalpha and aromatase expression in MCF-7 human breast cancer cells [J]. Int J Mol Med, 2004, 13(1):149-155.

[6] Wong AW, Dunlap SM, Holcolmb VB, et al. Alcohol promotes mammary tumor development via the estrogen pathway in estrogen receptor alpha-negative HER2/neu mice [J]. Alcohol Clin Exp Res, 2012, 36(4): 577-587.

[7] Wang Y,Xu M,Ke ZJ, et al. Cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced aggressiveness of breast cancer [J]. Pharmacol Res, 2016, 115:299-308.

[8] Wang S, Xu M, Luo J, et al. Ethanol promotes mammary tumor growth and angiogenesis: the involvement of chemoattractant factor MCP-1[J]. Breast Cancer Res Treat, 2012, 133(3):1037-1048.

[9] 林炳水，劉家勇，李華, 等. TA2系小鼠自發(fā)瘤的觀察 [J]。天津醫(yī)藥，1982，10(6): 345-347.

[10] 朱悅，張詩武，賈興紅，等. 津白Ⅱ小鼠自發(fā)乳腺癌病理相關(guān)特征分析 [J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，2(13): 149-150.

[11] Wang X, Huang C, Zhang D, et al. The effect of high gravidity on the carcinogenesis of mammary gland in TA2 mice [J]. Am J Reprod Immunol, 2010, 63(5): 396-409.

[12] Sun B, Zhang S, Zhang D, et al. Identification of metastasis-related proteins and their clinical relevance to triple-negative human breast cancer [J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(21): 7050-7059.

[13] 盧艷敏，李菲菲，楊金蓮，等. 飲酒小鼠動物模型建立及其對雌性激素的影響 [J]. 中國實驗動物學(xué)報，2012，20(5): 41-44.

[14] Tan H, Zhong Y, Pan Z. Autocrine regulation of cell proliferation by estrogen receptor-alpha in estrogen receptor-alpha-positive breast cancer cell lines [J]. BMC Cancer, 2009, 9: 31.

[15] Chen WY, Colditz GA, Rosner B, et al. Use of postmenopausal hormones, alcohol, and risk for invasive breast cancer [J]. Ann Intern Med, 2002, 137(10): 798-804.

[16] Yue W, Yager JD, Wang JP, et al. Estrogen receptor-dependent and independent mechanisms of breast cancer carcinogenesis [J]. Steroids, 2013, 78(2): 161-170.

AlcoholpromotesthetumorigenesisofspontaneousbreastcancerinTA2miceandthepossiblepotentialmechanism

XU Mo1, CHEN Zhi-jun2, GUI Zhao-hua1, CHEN Dan-lei1, ZHAO Hao-dong1, YANG Fan1, WANG Si-ying1*

(1. Department of Pathology and Pathophysiology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China； 2. Yunyang County People’s Hospital, Chongqing 404500)

ObjectiveTo explore whether alcohol promotes the development of breast cancer in TA2 mice and the possible potential mechanism.MethodsThirty-two 6-8-week old nulliparous female TA2 mice were randomly divided into control and ethanol-exposure groups, 16 mice in each group. The mice of the ethanol-exposure group were given 2% ethanol in drinking water, and the mice of control group

regular drinking water. Serum ethanol concentration in the TA2 mice was measured using an ANALOX AM1 alcohol analyzer. The incidence of breast cancer, tumor growth rate and tumor size of the ethanol-exposure and control groups were observed and compared. The estrogen levels of the two groups was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELASA).ResultsCompared with the control group, the tumor formation rate of spontaneous breast cancer in the alcohol-exposure group was significantly increased (62.5% vs. 43.75%,P<0.05), the average number of days of tumor formation was shortened (285 days vs. 335 days,P<0.05), the tumor weight and volume were increased but not significant (P>0.05), and the level of estrogen in the ethanol-exposure mice was significantly higher than that in the control group (P>0.05).ConclusionsAlcohol promotes the tumorigenesis of spontaneous breast cancer in TA2 mice, which may be associated to the increase of estrogen levels.

Ethanol; TA2 mouse; Breast cancer; spontaneous; Estrogen level

WANG Si-ying. E-mail： sywang@ahmu.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0563-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.017

2017-04-03

徐陌，女，研究生，E-mail： xumo820@foxmail.com

汪思應(yīng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。E-mail： sywang@ahmu.edu.cn