石功德 周 靜 李 敏 虞 立 金偉鋒 李曉紅 張宇燕（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

基于R語(yǔ)言的益氣活血方藥中丹酚酸B提取工藝研究*

石功德 周 靜 李 敏 虞 立 金偉鋒 李曉紅 張宇燕△（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

目的應(yīng)用正交試驗(yàn)法、R語(yǔ)言結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化益氣活血方藥組方丹參中水溶性成分丹酚酸B的提取工藝。方法以丹酚酸B的提取率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行提取考察。應(yīng)用R語(yǔ)言結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及遺傳算法對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行目標(biāo)尋優(yōu)，從而得到最佳提取工藝條件。結(jié)果丹酚酸B的最佳提取工藝條件為12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達(dá)70%。網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值為110.52mg/g，驗(yàn)證試驗(yàn)平均值為116.174 mg/g，相對(duì)誤差為4.87%，具有良好的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)性。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立的丹酚酸B提取工藝的數(shù)學(xué)模型可用于丹酚酸B提取工藝的分析和預(yù)測(cè)，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)中藥有效成分的目標(biāo)尋優(yōu)提供新的參考。

R語(yǔ)言 丹酚酸B正交設(shè)計(jì) 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 提取工藝

益氣活血方藥是由黃芪、丹參、川芎等中藥組成，臨床用于治療缺血性中風(fēng)已取得較好的療效，其主要組成藥物丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，丹參具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠狀動(dòng)脈血流量，防止心肌缺血和心肌梗死，加快微循環(huán)血流，促進(jìn)毛細(xì)血管網(wǎng)開(kāi)放，抑制心肌收縮，減少能量消耗，擴(kuò)張血管，降低膽固醇、血脂，抑制凝血，激活纖溶，穩(wěn)定紅細(xì)胞膜，提高缺氧耐受力，增加肝臟血流量，保護(hù)肝損傷細(xì)胞，抗肝纖維化，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及消炎抗菌等作用[2-5]。其脂溶性成分具有抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[6-7]。

丹參水溶性的酚酸成分主要有丹酚酸B，是研究較多的丹酚酸之一。丹酚酸B具有很強(qiáng)的抗氧化作用[8-10]，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，其作用強(qiáng)度高于維生素C、維生素E、甘露醇，是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的天然產(chǎn)物之一。藥理學(xué)研究表明，注射用丹參酚酸具有明顯的抗氧化、抑制血小板聚集及抑制血栓形成的作用，并能延長(zhǎng)缺氧條件下動(dòng)物的存活時(shí)間[11]。本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)方法考察丹酚酸B的提取工藝，進(jìn)而運(yùn)用R語(yǔ)言并結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法對(duì)正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，最后優(yōu)化得到丹酚酸B的最佳提取工藝，可為益氣活血方藥中藥新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為含有丹參類藥材及丹酚酸B的中藥制劑工藝研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 試藥與儀器

密封式恒溫可調(diào)式電加熱器（FD-2型，嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司）；低速離心機(jī)（SC-3610型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（XS205型，梅特勒-托利多儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2800/2802/2802S，上海恒科儀器有限公司）。丹參：購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)檢驗(yàn)為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。經(jīng)檢驗(yàn)符合2015年版《中國(guó)藥典（一部）》丹參項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。丹酚酸B（批號(hào)：PA0418RA，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇，分析純，衢州巨氏試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品2.44mg，置25mL容量瓶中，加75%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成97.6μg/mL的丹酚酸B對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 將丹酚酸B提取濃縮液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用75%甲醇定容，搖勻。精密移取0.5 mL溶液至25 mL容量瓶中，75%甲醇定容，即為供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5mL， 分別置10mL容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻；286 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=56.276X-0.2240，R=0.9997，線性范圍4.88～43.92μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn) 取丹酚酸B對(duì)照品，按上述含量測(cè)定方法檢測(cè)5次，測(cè)得吸收度。計(jì)算丹酚酸B吸收度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.34%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取丹酚酸B對(duì)照品，按上述含量測(cè)定法在0、2、4、6、8 h后檢測(cè)吸收度。計(jì)算丹酚酸B吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.25%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批樣品5份，按上述含量測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)丹酚酸B含量，計(jì)算丹酚酸B含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.35%，

2.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的丹參粉末各0.3 g，按1∶1比例精密加入丹酚酸B對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法制備樣品液，依次顯色后測(cè)定吸收度，計(jì)算加樣回收率為101.5%，RSD=1.34%。

2.8 丹參正交實(shí)驗(yàn)及工藝優(yōu)化 稱取丹參藥材3 g，按照L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提取物中丹酚酸B含量為指標(biāo)，考察影響水煎提取丹參的4個(gè)主要因素：加水量（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C）、醇沉濃度（D）（見(jiàn)表1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.9 R語(yǔ)言環(huán)境下BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模 本實(shí)驗(yàn)在R語(yǔ)言下建立3層結(jié)構(gòu)（只有1個(gè)隱層）的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，輸入層節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)置為4，分別是加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)及醇沉濃度，輸出節(jié)點(diǎn)數(shù)為1，即丹酚酸B的提取率。將正交試驗(yàn)9組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用留一法進(jìn)行交叉驗(yàn)證，相關(guān)參數(shù)分別設(shè)置為初始隨機(jī)權(quán)（rang）0.1，參數(shù)重量衰變（decay）5×10-5，最大迭代次數(shù)（maxit）500，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。在此參數(shù)條件下對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行留一法交叉訓(xùn)練，以平均擬合誤差和平均預(yù)測(cè)誤差作為選取隱層神經(jīng)元（size）的依據(jù)，結(jié)果如表3。由表3可知，隱層神經(jīng)元（size）為1時(shí)，平均擬合誤差、平均預(yù)測(cè)誤差均小于5%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而隱層神經(jīng)元為0、2、3時(shí)，不符合篩選條件。同時(shí)，隱層神經(jīng)元數(shù)增加到一定數(shù)目時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生過(guò)度擬合現(xiàn)象[4]。繼而在上述參數(shù)條件下，以正交試驗(yàn)的9組數(shù)據(jù)為樣本，對(duì)不同個(gè)數(shù)的隱層神經(jīng)元（size）進(jìn)行擬合誤差的訓(xùn)練，結(jié)果見(jiàn)表4。隨著隱層神經(jīng)元（size）個(gè)數(shù)的增加，擬合誤差呈先增大再降低的趨勢(shì)，由此可判斷為隱層神經(jīng)元 （size）1之后增加神經(jīng)元數(shù)將導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)模型擬合過(guò)度。因此，此次模型的隱層神經(jīng)元（size）設(shè)定為1，此時(shí)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定可靠。

2.10 R語(yǔ)言環(huán)境中應(yīng)用遺傳算法進(jìn)行目標(biāo)優(yōu)化 遺傳算法是一種基于自然界優(yōu)勝劣汰的進(jìn)化規(guī)律和基因遺傳學(xué)原理的優(yōu)化搜索方法。在“優(yōu)勝劣汰、適者生存”的生物進(jìn)化論基礎(chǔ)上，遺傳算法將初始群體的全部個(gè)體進(jìn)行編碼，按照一定的適配值函數(shù)及復(fù)制、交叉、突變等一系列遺傳操作對(duì)各個(gè)個(gè)體進(jìn)行篩選，淘汰適應(yīng)度低的解，適應(yīng)度高的個(gè)體組成新的種群，重復(fù)此過(guò)程，直至滿足一定的極限條件。因此，遺傳算法可實(shí)現(xiàn)全局優(yōu)化搜索，且搜索能力較強(qiáng)，可避免繁瑣的數(shù)學(xué)公式推導(dǎo)和參數(shù)選擇。

表3 隱層神經(jīng)元（size）訓(xùn)練結(jié)果（%）

表4 隱層神經(jīng)元（size）測(cè)試訓(xùn)練結(jié)果

根據(jù)遺傳算法的基本思想，采用實(shí)數(shù)編碼方式，種群大小為1000，接近的最大代數(shù)為100，最大不可變代數(shù)為10，收斂公差為1×10-4，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。運(yùn)用R語(yǔ)言代碼進(jìn)行編程，由遺傳算法得到的結(jié)果運(yùn)行時(shí)間為1 s，運(yùn)行到第12代時(shí)找到丹酚酸B的最佳提取條件為12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達(dá)70%，此條件下得到的最優(yōu)提取率為110.52mg/g。

3 最佳工藝驗(yàn)證

稱取15 g丹參5份，按照上述優(yōu)化后的條件，即12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達(dá)70%，進(jìn)行提取，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”方法測(cè)定丹酚酸B的含量。結(jié)果見(jiàn)表5，丹酚酸B的平均提取含量116.174mg/g。實(shí)驗(yàn)測(cè)量值和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為4.87%，小于5%，說(shuō)明優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)測(cè)量和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)較吻合，該數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定性良好，具有較好的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)性。

4 討 論

R語(yǔ)言是一種免費(fèi)的為統(tǒng)計(jì)計(jì)算和圖形展現(xiàn)而設(shè)計(jì)的編程語(yǔ)言和統(tǒng)計(jì)環(huán)境，具有強(qiáng)大的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析和科學(xué)數(shù)據(jù)可視化功能，既可以提供各種數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析及圖形顯示工具，可通過(guò)編制相應(yīng)函數(shù)擴(kuò)展現(xiàn)有的R語(yǔ)言的功能[12-13]，操作簡(jiǎn)便，功能較為強(qiáng)大。但國(guó)內(nèi)醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)語(yǔ)言較陌生，且相應(yīng)出版物較少。在R環(huán)境中應(yīng)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行目標(biāo)尋優(yōu)及分析預(yù)測(cè)更是屈指可數(shù)[14-15]。

表5 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果（mg/g）

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)反向傳播不斷地調(diào)整網(wǎng)絡(luò)權(quán)值和閾值的應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型之一[16-17]，為較好地處理復(fù)雜的非線性問(wèn)題提供了選擇。它的學(xué)習(xí)規(guī)則是使用最速下降法，訓(xùn)練算法簡(jiǎn)單明確、計(jì)算量小、并行性強(qiáng)，對(duì)于多維非線性系統(tǒng)參數(shù)優(yōu)化提供了選擇。正交設(shè)計(jì)僅僅考慮了幾個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)各因素對(duì)提取工藝的影響，未從整個(gè)試驗(yàn)區(qū)間進(jìn)行考慮，因此優(yōu)選出的參數(shù)往往是較優(yōu)而非最優(yōu)[9]。本次試驗(yàn)將傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合將離散數(shù)據(jù)變?yōu)檫B續(xù)數(shù)據(jù)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)的仿真功能對(duì)試驗(yàn)影響因素的變化進(jìn)行仿真分析，模擬延伸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以外的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，反映各因素的變化規(guī)律，從而獲得多因素連續(xù)區(qū)域中的最優(yōu)提取組合。

本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)對(duì)丹參中水溶性成分丹酚酸B提取工藝進(jìn)行考察，進(jìn)而運(yùn)用R語(yǔ)言并結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法對(duì)正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，最后優(yōu)化得到丹酚酸B的最佳提取工藝（12倍體積的水，煎煮3次，每次1 h，提取液加乙醇使醇沉濃度達(dá)70%），可為益氣活血方藥中藥新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為含有丹參類藥材及丹酚酸B的中藥制劑工藝研究提供參考。

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Optimization Extraction Technique of Salvianolic Acid B in Yiqi Huoxue Decoction Based on R Language

SHI Gongde，ZHOU Jin，LIMin，et al.Zhejiang University of Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective：To optimize the extraction technology of salvianolic acid B in Yiqi Huoxue Decoction with orthogonal experiment，R language，BP neural network and genetic algorithm.Methods：Taking the extraction rate of salvianolic acid B as the index，the orthogonal experimental design method was used to extract and investigate.R language，BP neural network and genetic algorithm were used to optimize the orthogonal experimental data，so as to obtain the optimum extraction process conditions.ResultsThe optimization of extraction technology was as follows：12 times of the volume of water were boiled for 3 times，each time for 1h，and the alcohol concentration reached 70%.The network predictive value was 110.52 mg/g；the experimental average value was 116.174 mg/g，and the relative error was 4.87%.So it had a good network prediction.ConclusionThis mathematical model can be used to analyze and predict the extraction technology of salvianolic acid B in Yiqi Huoxue Decoction，providing a new reference for screening optimization of Chinese medicine components.

R language；Salvianolic acid B；Orthogonal design；Neural network；Extraction

R289.5

A

1004-745X（2017）10-1700-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.003

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LR16H270001）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017ZB024）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金項(xiàng)目（重點(diǎn)項(xiàng)目）（2017ZZ09）

△通信作者（電子郵箱：yannoo7376@sina.com）

2017-06-09）