吳迪 王斌 石琳 李朋洋 周航 蔡晨

100039北京大學航天臨床醫(yī)學院，航天中心醫(yī)院心內科(吳迪、王斌、周航、蔡晨)； 515041汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科(王斌)；100044 北京大學人民醫(yī)院心內科(石琳)；77030 Houston，Texas Heart Institute(李朋洋)

·基礎研究·

Intermedin1-53通過抑制心肌細胞凋亡保護敗血癥大鼠心臟及心功能

吳迪 王斌 石琳 李朋洋 周航 蔡晨

100039北京大學航天臨床醫(yī)學院，航天中心醫(yī)院心內科(吳迪、王斌、周航、蔡晨)； 515041汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科(王斌)；100044 北京大學人民醫(yī)院心內科(石琳)；77030 Houston，Texas Heart Institute(李朋洋)

目的探討Intermedin1-53(IMD1-53)對敗血癥大鼠心臟的保護作用及可能的機制。方法雄性SD大鼠分成3組，對照組(8只)，敗血癥組(8只)，IMD組(6只)，監(jiān)測血流動力學指標，檢測血糖和乳酸濃度；取心臟組織做TUNEL染色，免疫印跡法檢測蛋白活化的cleaved caspase 3、Bax和Bcl-2的表達，測定IMD1-53對經典的盲腸結扎穿刺法誘導敗血癥大鼠的心肌細胞凋亡的影響。結果敗血癥組血流動力學指標平均動脈血壓(MABP)、左心室內壓最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左心室內壓最大下降速率(-LVdp/dtmax)絕對值、左心室收縮壓(LVSP)顯著低于對照組(均為P<0.05)。TUNEL染色結果顯示敗血癥組細胞凋亡、Cleaved caspase 3蛋白表達量顯著高于對照組(均為P<0.05)，與敗血癥組相比，IMD組的上述指標均有顯著改善(均為P<0.05)。結論IMD1-53可以保護敗血癥后期大鼠的心肌，顯著改善心功能，其機制可能是抑制心肌細胞凋亡。

Intermedin1-53； 凋亡； 敗血癥； 心功能不全

【Keywords】 Intermedin1-53; Apoptosis; Sepsis; Cardiac Insufficiency

Fundprogram：National Natural Science Foundation(81670434)

敗血癥是由致病菌侵入血液循環(huán)，生長繁殖產生毒素引起全身性的感染，每年約有200萬罹患者，死亡人數高達30萬。敗血癥休克的患者后期心肌抑制發(fā)生率高達40%～50%[1]，表現為心室擴大、心臟射血分數和收縮力降低等，而且是導致患者死亡的重要因素[2]。

中介素/腎上腺髓質素2(intermedin/adrenomedullin 2， IMD/ADM2)于2004年發(fā)現，由148個氨基酸殘基組成，其中具有主要生理活性的片段是prepro-IMD95-147，即IMD1-53。IMD1-53廣泛存在于心血管系統(tǒng)，有舒張血管及降低血壓、保護缺血再灌注心肌細胞、增加心力衰竭心肌收縮力等作用[3-5]，體內發(fā)揮心血管保護及調節(jié)內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。在臨床研究中，Li等[6]發(fā)現血漿IMD1-53水平可以預測冠心病病情。由于IMD1-53是否對敗血癥誘導的心功能不全具有保護作用尚不清楚，因此本實驗在敗血癥誘導的心功能不全大鼠模型上研究IMD1-53對心臟的可能作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

雄性SD大鼠(260±10)g由北京大學醫(yī)學部動物部提供，動物飼養(yǎng)管理實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》等法規(guī)的要求。人工合成IMD1-53購自美國鳳凰藥業(yè)公司。β-actin以及二抗(抗兔、抗鼠、抗羊)均購自SantaCruz公司。Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3抗體均購自英國Abcam公司。硝酸纖維素膜購自英國Hybond-C公司。TUNEL 試劑盒購自羅氏公司。DAPI購自北京索萊寶科技有限公司。血糖測試試劑盒、乳酸測試試劑盒購自中國南京建成生物公司。Powerlab 多導生理記錄儀等。余為市售分析純產品。

1.2 大鼠分組與敗血癥模型構建

用經典的盲腸結扎穿刺法(cecal ligation and puncture，CLP)制作敗血癥模型[7]。24只雄性SD大鼠在標準條件下分成3組：對照組、敗血癥組、IMD組各8只。3組均術前禁食8～12 h，大鼠稱重，敗血癥組大鼠做CLP手術處理。IMD組大鼠手術流程同敗血癥組，在放入籠中前只是在右下腹腹腔注射IMD1-53(1 ml，10-7mol/L)，但是由于操作方面的原因，IMD組只有6只大鼠完成血流動力學監(jiān)測。3組大鼠均恒溫培養(yǎng)20 h以進入敗血癥晚期階段。

1.3 心臟功能和血壓測定

在敗血癥模型手術完成20 h后，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，先用肝素鹽水(500 U/ml)沖洗導管后經左頸總動脈插入左心室內[8]，Powerlab多導生理記錄儀監(jiān)測血流動力學相關指標，取插管10 min后的穩(wěn)定參數值，抽取血液離心取上清測血糖、乳酸，然后開胸取心臟。

1.4 TUNEL染色

將預先準備好的大鼠心臟心室部分石蠟切片脫蠟，用二甲苯浸洗2次，每次5 min，用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min。脫蠟后，用Proteinase K工作液處理組織15～30 min，PBS漂洗2次。玻片干后，加50 μl TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片或封口膜在濕盒中反應37℃×1 h，PBS漂洗3次，滴加50 μl DAPI，PBS漂洗3次，5 min后在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞，拍照。

1.5 血糖、血乳酸測定

用定量移液器精確取血樣的上清液2 μl于EP管底部，用葡萄糖氧化酶法測定血糖值，按照南京建成血糖測定試劑盒說明書操作。血乳酸測定時，按步驟加入樣本、酶工作液、顯色劑，然后漩渦混勻，37℃孵育10 min接著加入終止劑終止反應，最后530 nm波長，1 cm光徑，比色。

1.6 Western blot檢測

將準備好的心肌組織加入裂解液(含1 mol/L PMSF)，冰上研磨，在4℃ 1 200轉/min離心10 min，取上清，Bradford 法檢測蛋白濃度，按比例加入5X 上樣緩沖液煮樣，10% SDS-PAGE電泳，200 mA恒流電轉轉膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜3次，每次5 min；結合相應一抗。放4℃冰箱過夜，TBST洗膜，結合相應的二抗，室溫1 h，用ECL化學發(fā)光試劑盒與硝酸纖維素膜孵育后，放入暗盒內曝光，顯影后再定影。用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin標化，所有實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 IMD1-53改善敗血癥大鼠的一般特征

與對照組相比，敗血癥組大鼠的血乳酸含量升高至對照組的171%。與敗血癥組相比，IMD組血乳酸含量降低了24.2%(P=0.011)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(表1)，提示IMD1-53顯著改善了敗血癥大鼠的高乳酸血癥。敗血癥組大鼠的血糖含量降低到對照組的26.5%(P<0.05)，雖然IMD組的血糖升至敗血癥組的150%，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.062，表1)，而且仍然只有對照組的40%(P=0.001)。

表1 3組大鼠血乳酸和血糖的比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與敗血癥組比較，bP<0.05

2.2 IMD1-53改善敗血癥大鼠的心功能

與對照組相比，敗血癥組大鼠的心功能參數MABP、+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax絕對值、LVSP分別下降了29.7%、31.3%、40.8%、21.6%(均為P

<0.05)。與敗血癥組相比，IMD組各項心功能指標均有顯著改善，MABP上升26.6%(P=0.036)，+LVdp/dtmax上升34.3%(P=0.042)，-LVdp/dtmax絕對值上升49.1%(P=0.031)，LVSP上升26.5%(P=0.049)，且各項與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，提示IMD1-53對敗血癥大鼠心功能不全有顯著改善作用。心率在3組的變化差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05，表2)。

2.3 IMD1-53抑制心肌細胞的凋亡

Western blot結果顯示(圖1)，相較于對照組，敗血癥組Bax蛋白水平上調223%(P=0.009)， cleaved caspase 3蛋白表達量升高375%(P=0.007)，抗凋亡蛋白Bcl-2水平下調62.1%(P=0.023)。與敗血癥組相比，IMD組Bax蛋白的表達下調45.2%(P=0.028)，Bcl-2蛋白的表達上升128%(P=0.006)，cleaved caspase 3蛋白下調30.4%(P=0.024)，且3個指標與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，提示IMD1-53抑制了敗血癥大鼠心肌細胞的凋亡。

TUNEL染色結果顯示(圖2)，與對照組相比，敗血癥組細胞凋亡率上升12倍，給予IMD1-53后心肌細胞凋亡率顯著降低且與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，與Western blot結果相一致。有趣的是，凋亡的心肌細胞數量與Bcl-2/Bax的比值成反比關系，IMD組Bcl-2/Bax比值是敗血癥組的3倍(P=0.001)，而與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

DAPI染色中藍色熒光點是心肌細胞細胞核，細胞核定量分析對照組433±23，敗血癥組444±30，IMD組430±13，3組之間差異無統(tǒng)計學意義。TUNEL染色中綠色熒光點為凋亡細胞核染色，Merged圖中箭頭所指的點為凋亡的心肌細胞核染色。對照組無凋亡細胞核染色，但敗血癥組的凋亡細胞核染色非常明顯，IMD組的凋亡細胞核染色非常少。

表2 3組大鼠血流動力學指標的比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與敗血癥組比較，bP<0.05

A：電泳圖；B：Bcl-2/Bax比率；C～E：Bax、Bcl-2和cleaved caspase3表達水平灰度值量化統(tǒng)計圖。1：對照組；2：敗血癥組；3：IMD組。與對照組比較，aP<0.05；與敗血癥組比較，bP<0.05圖1 3組大鼠Bax、Bcl-2和cleaved caspase 3表達水平比較(3只)

3 討論

大鼠的敗血癥模型顯示，敗血癥早期(10 h)的表現是血壓無變化，但血乳酸和血糖明顯升高，血漿和心肌組織中IMD1-53均明顯升高；敗血癥晚期(合并休克)的表現是血壓降低，血乳酸水平明顯升高，血漿IMD1-53升高，但血糖明顯降低，心肌組織中IMD1-53明顯減少[9]。后期心肌組織中IMD1-53的減少可能與心功能不全的發(fā)生有關。在本實驗中，敗血癥大鼠血乳酸顯著增高、血糖顯著降低，血壓較對照組明顯下降，提示敗血癥組大鼠合并休克，進入敗血癥晚期，表明本實驗中大鼠的敗血癥模型制作成功。進一步進行的血流動力學檢測發(fā)現，敗血癥組大鼠的各項心功能指標出現明顯惡化，提示出現嚴重心功能不全。IMD1-53組通過腹腔注射外源性IMD1-53(1 ml，10-7mol/L)后，大鼠的心功能各項參數較敗血癥組明顯改善，提示心功能顯著改善，且心功能指標與無敗血癥的對照組接近。給予IMD1-53(腹腔注射)，提示對于敗血癥引起的器官損害，IMD1-53具有改善心功能的作用。由于腹腔注射IMD1-53在敗血癥模型制作開始時(此時還沒有發(fā)生敗血癥)，因此IMD1-53的這種作用很可能具備預防和治療的雙重作用。

在敗血癥大鼠心功能改善的同時，反映休克指標的乳酸水平明顯下降，MABP由休克狀態(tài)基本恢復到正常水平(對照組水平)，表明IMD1-53能夠逆轉休克造成的血流動力學障礙和代謝紊亂，改善內環(huán)境，與心臟功能的改變一致。值得注意的是，對于敗血癥后期血糖降低的改善不明顯。在敗血癥后期，一方面，敗血癥本身可以引起血糖降低；另一方面，血糖降低又可加重敗血癥所造成的器官損害，尤其是心功能的惡化。IMD1-53明顯改善心功能，而血糖變化不明顯，提示IMD1-53可能無明顯糖調節(jié)代謝的作用。從另一方面證明，IMD1-53具有更直接的心功能保護作用、抗感染性休克的作用，而非通過改善血糖的途徑起作用。

最近的研究發(fā)現，在糖尿病的大鼠模型和同型半胱氨酸誘導的心肌纖維化模型中，IMD1-53有很好的抑制炎癥和抗細胞凋亡的作用[10-11]。敗血癥發(fā)生時，大量的炎性介質對機體造成嚴重的損傷，細胞凋亡是敗血癥心功能障礙的一個主要原因[12]。Bcl-2與Bax是一對正負調控的凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，研究顯示Bcl-2/Bax比值明顯下降則表示了細胞的大量凋亡[12]。本研究中，敗血癥組的Cleaved caspase 3 和Bax蛋白的表達顯著升高，Bcl-2/Bax比值降低，而Cleaved caspase 3 和Bax蛋白的表達又可被IMD1-53抑制。進一步用TUNEL染色分析驗證， IMD1-53顯著抑制了心肌細胞的凋亡，其結果也與之前的Western blot結果一致。LI等[11]發(fā)現IMD1-53可以通過抑制心肌細胞凋亡來減少心肌缺血再灌注損傷，與本研究的結果一致。因此，推測IMD1-53改善敗血癥大鼠心功能不全的作用可能與抑制心肌細胞凋亡有關。

A：DAPI染色中藍色熒光點是心肌細胞細胞核，細胞核定量分析對照組433±23，敗血癥組444±30，IMD組430±13，3組之間差異無統(tǒng)計學意義；TUNEL染色中綠色熒光點為凋亡細胞核染色；Merged圖中箭頭所示為凋亡的心肌細胞核染色，對照組無凋亡細胞核染色，但敗血癥組的凋亡細胞核染色非常明顯，IMD組的凋亡細胞核染色非常少；B：細胞凋亡率統(tǒng)計圖；C：細胞核定量統(tǒng)計圖。1：對照組；2：敗血癥組，3：IMD組。與對照組比較，aP<0.05；與敗血癥組比較，bP<0.05圖2 3組大鼠TUNEL染色的比較(×200，6只)

綜上所述，本研究初步證實，補充外源性IMD1-53可明顯改善重癥敗血癥大鼠心功能，糾正心功能不全和血流動力學障礙，其作用機制可能與抑制心肌細胞凋亡、減輕心肌損傷有關，為治療敗血癥合并的心功能不全、逆轉休克過程提供新的思路和實驗依據，值得進一步探討。

利益沖突：無

[1] Rudiger A， Singer M.Mechanisms of sepsis-induced cardiacdysfunction[J].Crit Care Med， 2007， 35(6)， 1599-1608.DOI：10.1097/01.CCM.0000266683.64081.02.

[2] Vieillard-Baron A， Caille V， Charron C， et al.Actual incidence of global left ventricular hypokinesia in adult septic shock[J].Crit Care Med， 2008， 36(6)：1701-1706.DOI：10.1097/CCM.0b013e318174db05.

[3] Zhang W， Wang LJ， Xiao F， et al.Intermedin：a novel regulator for vascular remodeling and tumor vessel normalization by regulating vascular endothelial-cadherin and extracellular signal-regulated kinase[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2012， 32(11)：2721-2732.DOI：10.1161/ATVBAHA.112.300185.

[4] Du QX， Yue W， Wang YY.Effect and mechanism of intermedin in acute rat cardiac ischemic injury [J].Fa Yi Xue Za Zhi， 2011， 27(3)：164-168.

[5] Du X， Cao Y， Xue P， et al.Protective effect of intermedin on myocardial cell in a rat model of severe acute pancreatitis[J].Cell Mol Biol Lett， 2011， 16(3)：462-476.DOI：10.2478/s11658-011-0020-1.

[6] Li P， Shi L， Han Y， et al.Prognostic value of plasma intermedin level in patients with non-ST-segment elevation acute coronary syndrome[J].Medicine(Baltimore)，2016，95(16)：e3422.DOI：10.1097/MD.0000000000003422.

[7] Gao M，Ha T，Zhang X，et al.The Toll-like receptor 9 ligand， CpG oligodeoxynucleotide， attenuates cardiac dysfunction in polymicrobial sepsis， involving activation of both phosphoinositide 3 kinase/Akt and extracellular-signal-related kinase signaling[J].J Infect Dis， 2013， 207(9)：1471-1479.DOI：10.1093/infdis/jit036.

[8] Zhang B，Liu Y，Zhang JS，et al.Cortistatin protects myocardium from endoplasmic reticulum stress induced apoptosis during sepsis[J].Mol Cell Endocrinol， 2015， 406：40-48.DOI：10.1016/j.mce.2015.02.016.

[9] 廖勇敢，蔣明森，劉青云，等.敗血癥休克大鼠血漿和心血管組織中Adrenomedullin與Intermedin的變化[J].中國老年保健醫(yī)學， 2007， 5(3)：13-16.DOI：10.3969/j.issn.1672-4860-B.2007.03.005.

Liao YG， Jiang MS， Liu QY， et al.The changes of plasma and cardiovascular adrenomedullin and intermedin in rats with peritonitis septicaemia shock[J].Chin J Geriatric Care， 2007， 5(3)：13-16.DOI：10.3969/j.issn.1672-4860-B.2007.03.005.

[10] Zhang JS， Hou YL， Lu WW， et al.Intermedin1-53protects against myocardial fibrosis by inhibiting endoplasmic reticulum stress and inflammation induced by homocysteine in apolipoprotein E-deficient mice[J].J Atheroscler Thromb， 2016， 23：1294-1306.DOI：10.5551/jat.34082.

[11] Li H， Bian Y， Zhang N， et al.Intermedin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic rats[J].Cardiovasc Diabetol， 2013， 12：91.DOI：10.5551/jat.34082.

[12] 任宏強， 趙利，王忠，等.復方丹參滴丸對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡和凋亡相關蛋白的影響[J].中國動脈硬化雜志，2013，21(12)：1007- 3949.

Ren HQ， Zhao L， Wang Z， et al.Effect of Compound Danshen Dripping pill on apoptosis of cardiac muscle cells and apoptosis-related gene expression in rats with acute myocardial infarction[J]， Chi J Arteriosclerosis， 2013，21(12)：1007- 3949.

Cardioprotectiveeffectsofintermedin1-53viainhibitingcardiomyocyteapoptosisinsepsisratmodels

WuDi，WangBin，ShiLin，LiPengyang，ZhouHang，CaiChen

DepartmentofCardiology，PekingUniversityAerospaceSchoolofClinicalMedicine，PekingUniversityHealthScienceCenter，Beijing100039，China(WuD，WangB，ZhouH，CaiC)；DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou515041，China(WangB)；DepartmentofCardiology，PekingUniversityPeople′sHospital，Beijing100044，China(ShiL)；TexasHeartInstitute，Houston77030，USA(LiPY)

WangBin，Email：wangbin_pku@126.com

ObjectiveTo investigate the cardioprotective effects of interleukin1-53(IMD1-53)and its underlying mechanism in sepsis rats.MethodsThe SD rats were randomly assigned into 3 groups：control group(n=8)，sepsis group(n=8)，and IMD group(n=6)；the effect of IMD1-53on the apoptosis of cardiomyocytes induced by classical cecal ligation was studied. The hemodynamic parameters were recorded through left common carotid catheterization，and plasma glucose and lactic acid levels were measured 20 hours after the surgery. Heart tissue was collected and subjected to TUNEL staining，and Western blotting was processed to assess the expression levels of cleaved caspase 3，Bax and Bcl2.ResultsThe hemodynamic indexes in sepsis group such as mean arterial blood pressure(MABP)，left ventricular peak rate of contraction(+LVdp/dtmax)，absolute value of left ventricular peak rate of relaxation(-LVdp/dtmax)，left ventricular systolic pressure(LVSP)were significantly lower than those in the control group(allP<0.05). TUNEL staining results showed that the apoptosis level of the cells and the expression of cleaved caspase 3 protein in sepsis group were significantly higher than those of control group(allP<0.05). Compared with sepsis group，the above indexes of IMD group were significantly improved(allP<0.05). In addition，TUNEL staining revealed lower degree of apoptosis after IMD1-53injection.ConclusionsIMD1-53may protect myocardium and cardiac function of rats with late sepsis through inhibiting cardiomyocytes apoptosis.

王斌，電子信箱：wangbin_pku@126.com

10.3969/j.issn.1007-5410.2017.05.009

國家自然科學基金項目(81670434)

2017-04-28)

(本文編輯：周白瑜)