王麗坤 ，張瑩 ，崔宇超 ，高俊峰 ，2，侯美如 ，楊淑萍

丹頂鶴體內(nèi)曲領(lǐng)棘緣吸蟲的鑒定

王麗坤1，張瑩1，崔宇超1，高俊峰1，2，侯美如1，楊淑萍1

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161000；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

為了鑒定經(jīng)吡喹酮治療有拉稀癥狀的丹頂鶴排出的吸蟲種類，應(yīng)用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對該吸蟲進行蟲種鑒定。結(jié)果顯示：該蟲體形態(tài)與文獻中報道的曲領(lǐng)棘緣吸蟲的形態(tài)一致；所分離的吸蟲ITS rDNA序列全長為1 083 bp，通過與NCBI上其他棘口科吸蟲的ITS序列進行比對，表明該蟲體與Echinostoma trivolvis的同源性可高達93%，屬于棘口屬吸蟲，得出蟲體鑒定結(jié)果為曲領(lǐng)棘緣吸蟲，為魚媒介寄生蟲的防治提供參考依據(jù)。

丹頂鶴；形態(tài)學(xué)；ITS序列；曲領(lǐng)棘緣吸蟲

以淡水魚為媒介的禽類寄生蟲疾病多見于吸蟲類寄生蟲病。禽類因食入感染吸蟲囊蚴的淡水魚蝦而感染，特別是以采食淡水魚為食的水禽，感染更為普遍。扎龍自然保護區(qū)內(nèi)存在大量的野生水禽，其中丹頂鶴是國家一級保護動物，丹頂鶴的生命健康關(guān)系到珍惜物種的延續(xù)和生態(tài)平衡，因此需要重點保護。在我國陳浩等曾經(jīng)報道在江蘇省鹽城市國家級珍禽自然保護區(qū)的丹頂鶴感染東方次睪吸蟲[1]，梁金華等曾經(jīng)報道在廣東省肇慶市星湖濕地公園的丹頂鶴感染卷棘口吸蟲[2]，雖然有關(guān)于黑龍江淡水魚感染多種吸蟲的報道[3]，但黑龍江省扎龍自然保護區(qū)丹頂鶴還沒有吸蟲感染的相關(guān)報道。因此，研究將對黑龍江省扎龍自然保護區(qū)的丹頂鶴感染吸蟲疾病進行檢測分析，為該自然保護區(qū)寄生蟲疾病防控提供參考依據(jù)，也為保護珍禽丹頂鶴的健康生長和有序繁殖提供保障。

目前，魚媒介寄生蟲對水禽危害嚴(yán)重，然而禽類的魚源性吸蟲疾病還未引起足夠的重視。鑒于此，試驗以丹頂鶴體內(nèi)排出的寄生蟲為研究對象，觀察其主要形態(tài)學(xué)特征，并采取PCR進行蟲體分子生物學(xué)鑒定，為魚媒介寄生蟲的防治提供參考依據(jù)，也為魚媒介感染禽類寄生蟲蟲種鑒別奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體

蟲體是在黑龍江省齊齊哈爾市扎龍自然保護區(qū)丹頂鶴糞樣中所采集（圖1）。用生理鹽水將蟲體沖洗干凈，再將蟲體放入盛有70%酒精溶液的容器中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 曲領(lǐng)棘緣吸蟲成蟲Fig.1 The adults of Echinoparyphium recurvatum

1.2 主要試劑

德氏蘇木素染液，酒精，酸酒精，二甲苯，加拿大樹膠。PMD18-T載體。Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、dNTPs、限制性內(nèi)切酶；組織 DNA 提取試劑盒（OMEGA公司）；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒（康寧生命科學(xué)吳江有限公司）。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

研究利用蘇木素染色法[3]對該蟲體進行染色制作吸蟲壓片，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征進行蟲種鑒定。具體操作方法如下：

（1）將保存于乙醇溶液中的蟲體取出后用流水沖洗。

（2）將蒸餾水加入德氏蘇木素染液稀釋10～15倍，使蘇木素稀釋液呈濃葡萄酒色。將保存于乙醇溶液中的蟲體取出放在蘇木素稀釋液內(nèi)，染色過夜。

（3）將染液后的蟲體取出，放入蒸餾水中洗掉多余的染液，然后依次通過30%、50%和70%酒精各0.5～1 h。

（4）將蟲體移入酸酒精中褪色，待蟲體變成淡紅色。

（5）將蟲體置于80%酒精中，再依次通過90%和95%、100%酒精中各0.5～1 h。

（6）再將蟲體由100%酒精中移入二甲苯中，透明 0.5～1 h。

（7）再將透明的蟲體置于載玻片上，滴加加拿大樹膠一滴，加載蓋玻片封固，待干燥，即成，顯微鏡下觀察。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 DNA的提取

從采集的成蟲中選取5條蟲體樣品，用蒸餾水沖洗干凈后用研缽碾碎分別置于無菌離心管中。參照OMEGA公司提供的E.Z.N.A.TM Stool DNA Kit試劑盒說明書操作提取蟲體DNA。

1.4.2 ITS序列的擴增及序列分析

棘口吸蟲基因組DNA ITS序列的PCR擴增[4]，擴增引物NC5/NC2： 上游引物 NC5：5’-GTA GGT GAA CCT GCG GAA GGA TCA TT-3’， 下游引物NC2：5’-TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT-3’。反應(yīng)采取25 μL體系，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min；進入循環(huán)：94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。用DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）回收和純化DNA。將樣品送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，分別從正反鏈雙向進行測序。測序拼接結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫報道的其他吸蟲ITS序列進行同源性進行比對分析。

2 結(jié)果

經(jīng)過蘇木素染色法染色的成蟲蟲體小而軟薄，呈長葉形。頭領(lǐng)發(fā)達，其上有45枚頭棘，頭棘前后兩排相互排列，前排較小，后排較大。背棘前后排成兩排，左右腹角棘各5枚，上列3枚，下列2枚（圖2）?？谖P位于體前端的亞腹面（圖3），腹吸盤發(fā)達，位于蟲體前部1/4處。睪丸2個，位于蟲體后1/2處，呈長葉形或邊緣有缺刻，前后排列，卵巢發(fā)達，近似圓形，卵黃腺自腹吸盤與卵巢之間開始分布，至蟲體中央?yún)R合伸至體末端。子宮不發(fā)達，內(nèi)含少數(shù)蟲卵。根據(jù)此蟲體的形態(tài)特征，其與文獻中報道的曲領(lǐng)棘緣吸蟲的形態(tài)極為相似，因此在形態(tài)學(xué)上鑒定此蟲體為曲領(lǐng)棘緣吸蟲。

研究利用通用引物擴增5條成蟲的rDNA ITS序列，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增的條帶均出現(xiàn)在約1 000 bp的位置，與預(yù)期目的片段一致（圖4），且無非特異性條帶。經(jīng)測序5條蟲體的ITS序列完全一致，序列全長為1 083 bp。將擴增的ITS序列與NCBI上其他吸蟲的ITS序列進行比對，結(jié)果表明該蟲體與曲領(lǐng)棘緣吸蟲（Echinoparyphium recurvatum）的同源性可高達99.3%，因此在分子水平上也確定研究的吸蟲為曲領(lǐng)棘緣吸蟲。

圖2 曲領(lǐng)棘緣吸蟲45枚頭棘如箭頭所示Fig.2 The spines of Echinoparyphium recurvatum

圖3 曲領(lǐng)棘緣吸蟲腹吸盤Fig.3 The ventral sucker of Echinoparyphium recurvatum

圖4 ITS序列PCR擴增結(jié)果Fig.4 ITS sequence PCR amplification

3 討論

形態(tài)學(xué)鑒定是傳統(tǒng)的鑒定吸蟲分類的方法，吸蟲成蟲的鑒定主要通過觀察吸蟲的大小形態(tài)、口腹吸盤的大小以及相對位置，口吸盤是否有棘，卵巢、子宮以及睪丸等形狀和相對位置大小等。吸蟲蟲體形態(tài)特征不易直接觀察，通過制作裝片可以很清晰的觀察蟲體內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，可以有效的區(qū)別鑒定吸蟲的種類。形態(tài)學(xué)鑒定是吸蟲鑒定最直接常用的方法，但是由于蟲體的形態(tài)特征易受環(huán)境、宿主等因素影響，使得形態(tài)學(xué)分類的準(zhǔn)確性和可靠性受到一定的限制[5-7]，例如一些同名異物的吸蟲[9]。相比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)具有效率高、樣品用量少、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高等優(yōu)點。因此，分子生物學(xué)鑒定避免了應(yīng)用形態(tài)學(xué)進行分類而引起的紛爭，完善了傳統(tǒng)分類學(xué)上的一些不足。目前，遺傳標(biāo)記基因rDNA ITS因其在種內(nèi)變異很小，并且在種間差異很明顯，已被廣泛應(yīng)用于物種的分類學(xué)研究。ITS序列在吸蟲鑒定工作中占有重要作用，ITS序列在研究屬內(nèi)和關(guān)系較近的屬間關(guān)系時是十分有價值的，尤其在近似種的區(qū)別中。近年來，ITS序列分析已廣泛應(yīng)用于吸蟲科、亞科、族、屬和種間系統(tǒng)學(xué)研究[8-9]。因此，研究采用了分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合的方法確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

研究通過對驅(qū)蟲所得的棘口科吸蟲成蟲進行形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，確定了本區(qū)域魚媒介感染丹頂鶴的寄生蟲種類為曲領(lǐng)棘緣吸蟲。曲領(lǐng)棘緣吸蟲的第二中間宿主為淡水魚類，禽類因啄食第二中間宿主而感染其囊蚴，囊蚴在小腸內(nèi)脫囊，逸出的幼蟲在小腸內(nèi)約7～9 d即可發(fā)育成熟、產(chǎn)卵。其成蟲多在小腸上段寄生，蟲體頭部插入腸粘膜，引發(fā)腸道局部炎癥病變，導(dǎo)致丹頂鶴食欲降低，生長遲緩等癥狀，給丹頂鶴的健康生長帶來嚴(yán)重的影響，感染率高時還可造成鶴只全身衰竭甚至死亡。所以，研究的確切診斷，是有效治愈丹頂鶴吸蟲疾病的關(guān)鍵所在，是保證丹頂鶴健康生長和有序繁殖的重要因素，并為有針對性的防控魚媒介感染禽類寄生蟲提供了有效的參考依據(jù)。研究的蟲種鑒定更為棘口科吸蟲基因庫增添了新的數(shù)據(jù)，為今后寄生蟲領(lǐng)域更深入的研究奠定了有利基礎(chǔ)。

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Identification of Echinoparyphium recurvatum in Grus japonensis

Wang Likun1，Zhang Ying1，Cui Yuchao1，Gao Junfeng1,2，Hou Meiru1，Yang Shuping1
（1.Dapartment of Parasitology，Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161000；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to identification the trematode species，which were collected from Grus japonensis with diarrhea，morphology and molecular biology method were carried out.Morphological identification results showed that the morphological characteristscs were consistent with Echinoparyphium recurvatum.Molecular identification showed，the length of ITS rDNA sequence was 1 083 bp long，Comparison ITS sequence of NCBI morphological，it displayed that the highest similarity rate was 93%with Echinoparyphium recurvatum，which belongs to Echinostoma members.Therefore，the trematode isolated from Grus japonensis was identified as Echinoparyphium recurvatum.The results provided a reference for the prevention of fish-born trematode.

Grus japonensis；Morphological；ITS sequences；Echinoparyphium recurvatumi

S852.7

A

1002-2090（2017）05-0037-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.010

2017-04-05

王麗坤（1981-），女，高級獸醫(yī)師，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事動物寄生蟲病學(xué)方面的研究。