王鳳華，孔海軍，黃 玲

（1.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 烏魯木齊 830054；2.濟(jì)南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 濟(jì)南 250013）

維藥阿里紅多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制改善的作用機(jī)制研究＊

王鳳華1＊＊，孔海軍1，黃 玲2

（1.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 烏魯木齊 830054；2.濟(jì)南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 濟(jì)南 250013）

目的：探討維藥阿里紅多糖（FoP）的抗運(yùn)動(dòng)疲勞及運(yùn)動(dòng)免疫抑制作用，為維藥阿里紅作為天然抗氧化劑及免疫調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：通過(guò)遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建立長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)疲勞及運(yùn)動(dòng)免疫抑制模型，不同劑量FoP作用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、低劑量FoP（20 mg·kg-1）+運(yùn)動(dòng)組、中劑量FoP（40 mg·kg-1）+運(yùn)動(dòng)組、高劑量FoP（80 mg·kg-1）+運(yùn)動(dòng)組，每周灌胃6天，共8周，灌胃期間進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。8周后處死取材，試劑盒檢測(cè)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血紅蛋白（HB）、肌酸激酶（CK）水平，RT-PCR檢測(cè)IL-4mRNA、INF-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：與陽(yáng)性對(duì)照組比較，F(xiàn)oP可以顯著提高小鼠HB水平，F(xiàn)oP各劑量組血清CK水平出現(xiàn)顯著下降；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，F(xiàn)oP組可顯著消除MDA，F(xiàn)oP各劑量組間無(wú)顯著差異；FoP各劑量組及陰性對(duì)照組血清SOD含量顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組；FoP各劑量組IL-4 mRNA/INF-γmRNA比值基本處于平衡狀態(tài)。結(jié)論：維藥阿里紅多糖可以有效促進(jìn)機(jī)體疲勞恢復(fù)，加快自由基的清除，并顯著改善機(jī)體的抗氧化能力及免疫狀態(tài)。

維藥阿里紅多糖 運(yùn)動(dòng)疲勞 自由基 抗氧化 運(yùn)動(dòng)免疫抑制

長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以誘發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能失衡，導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降，如何有效改善運(yùn)動(dòng)免疫抑制現(xiàn)象已經(jīng)成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)范疇的研究熱點(diǎn)[1]。在運(yùn)動(dòng)應(yīng)激狀態(tài)下，免疫抑制因子大量增殖，可嚴(yán)重抑制淋巴細(xì)胞生成白介素(IL)-2，從而抑制T、B淋巴細(xì)胞的生成，同時(shí)，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的大量自由基可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的大量凋亡。因此，通過(guò)改善機(jī)體抗氧化能力，是糾正運(yùn)動(dòng)免疫抑制狀態(tài)的有效途徑。近年來(lái)，中草藥及其提取物的抗免疫抑制作用受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

阿里紅（Fomes officinalisAmes，F(xiàn)oA），為擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceace）層孔菌屬（Fomes Fr.）之多年生真菌[2]。研究表明，阿里紅具有溫胃祛痰、降氣平喘、祛風(fēng)除濕和消腫利尿之功用，常用于治療慢性支氣管炎與各種癌癥[3-4]。維藥阿里紅多糖（FoP）是維藥阿里紅中的主要有效成分，可顯著提高機(jī)體的抗氧化能力，但目前國(guó)內(nèi)外鮮有將FoP應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)性免疫調(diào)理的研究。

研究在運(yùn)動(dòng)應(yīng)激過(guò)程中，機(jī)體免疫細(xì)胞功能及增殖的特性，對(duì)于我們了解運(yùn)動(dòng)影響機(jī)體免疫功能這樣一個(gè)生物過(guò)程是非常重要的。機(jī)體抗氧化能力及免疫細(xì)胞增殖被視為評(píng)價(jià)免疫機(jī)能重要的指標(biāo)。鑒于此，本研究基于造成運(yùn)動(dòng)性免疫抑制和發(fā)展的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型，研究了FoP作用于運(yùn)動(dòng)疲勞及運(yùn)動(dòng)免疫失衡小鼠，分析補(bǔ)充FoP對(duì)小鼠抗氧化功能的改善，進(jìn)而了解其對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制改善的效果及機(jī)制，為維藥阿里紅作為天然抗氧化劑及免疫調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表1 引物列表

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試藥

高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；ZH-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（淮北正華）；PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Biometra）；水平電泳儀（北京六一）；EP凝膠成像儀（美國(guó)Alpha）；GDS8000型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)UVP）；ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI）；恒溫水浴鍋（北京六一）；分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf）。

丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血紅蛋白（HB）、肌酸激酶（CK）測(cè)試試劑盒（南京建成生物公司）；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；基因擴(kuò)增引物（上海生工）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技有限公司）；FoP提取物（烏魯木齊市中醫(yī)院）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)昆明小鼠50只，雄性，體重21.6±1.9 g，（購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXX（新）2011-0003），動(dòng)物統(tǒng)一使用營(yíng)養(yǎng)飼料飼喂，鼠籠置于24±2℃室溫條件下，濕度50%-55%，光照12/12 h光照/黑暗。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物訓(xùn)練方法

小鼠在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后進(jìn)行3天的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，每天1次，每次15-30 min，待小鼠能以20 m·min-1的速度持續(xù)運(yùn)動(dòng)30 min，正式開(kāi)始建模。本實(shí)驗(yàn)采用劉曉莉、喬德才[5]等的小鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型進(jìn)行訓(xùn)練，動(dòng)物運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，采用聲、光、電刺激鼠尾部，使其持續(xù)運(yùn)動(dòng)。在持續(xù)運(yùn)動(dòng)中，個(gè)別動(dòng)物不能維持規(guī)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度時(shí)，中間可休息1-2 min，但總休息時(shí)間不能超過(guò)5 min。連續(xù)刺激或休息時(shí)間超過(guò)5 min仍不能維持原強(qiáng)度工作的動(dòng)物，視為力竭。實(shí)驗(yàn)周期為8周，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)每周訓(xùn)練6天（周一至周六訓(xùn)練，周日休息），前4周每天進(jìn)行1次訓(xùn)練，其余各周為每天早晚各1次；飼養(yǎng)條件相同。

1.2.2 給藥方法及分組情況

每次運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)后E1、E2、E3組分別人工灌胃灌注0.2 mL低劑量FoP稀釋液（20 mg·kg-1）、中劑量FoP稀釋液（40 mg·kg-1）、高劑量FoP稀釋液（80 mg·kg-1）；陽(yáng)性對(duì)照組即運(yùn)動(dòng)后不給藥的小鼠；陰性對(duì)照組即正常飼養(yǎng)的小鼠。

1.2.3 樣本采集與測(cè)試

第8周最后一次跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，即刻摘眼球取血，血液立即離心，取血清，低溫保存?zhèn)溆?，另保存抗凝全血備用。取小鼠血清，使用丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肌酸激酶（CK）測(cè)試試劑盒檢測(cè)上述指標(biāo)；使用血紅蛋白（HB）試劑盒檢測(cè)全血血紅蛋白。將小鼠全血0.1 mL加1 mL TRNzol，將樣品在15-30℃放置5 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，取上清，加0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。4℃12 000 rpm離心10 min，取上清，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min。4℃12 000 rpm離心10 min，取上清，使用75%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干，備用。使用30 ul ddH2O溶解沉淀，選擇GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，GAPDH、IL-4、INF-γ引物5′-3′序列見(jiàn)表1。使用ABI系統(tǒng)完成qRT-PCR過(guò)程，95℃30 s(1 cycle)；隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，收集熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因=ΔCt），計(jì)算IFN-γmRNA、IL-4 mRNA 的表達(dá)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用xˉ±s表示，數(shù)據(jù)分析使用SPSS22.0數(shù)據(jù)包進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著差異，通過(guò)Graph Pad 5軟件包進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果

2.1 FoP對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠的抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用

圖1 FoP對(duì)小鼠全血HB、血清CK水平的影響

圖2 FoP對(duì)小鼠血清MDA、SOD水平的影響

由圖1可知，經(jīng)過(guò)8周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照組HB水平明顯低于陰性對(duì)照組（P＜0.05），F(xiàn)oP中高劑量組小鼠全血血紅蛋白水平顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），低劑量組HB水平高于陽(yáng)性對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，各劑量組血清CK水平出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），同時(shí)，各劑量組血清CK水平顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 FoP對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠的抗氧化作用

研究證明，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)是一個(gè)可與免疫系統(tǒng)相比擬的、具有完善和復(fù)雜功能的系統(tǒng)，運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)自由基大量生成，同時(shí)自由基清除機(jī)制卻呈抑制狀態(tài)，結(jié)果造成體內(nèi)自由基大量積聚，造成組織細(xì)胞的損傷[6,7]。由圖2可知，就小鼠血清MDA水平而言，F(xiàn)oP各劑量組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），且顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.01），陰性對(duì)照組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）；FoP各組間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

FoP各劑量組及陰性對(duì)照組血清SOD含量顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），與陰性對(duì)照組比較，F(xiàn)oP各組提升酶活性能力無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3 FoP對(duì)小鼠IL-4、TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響

圖3 FoP對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠IL-4mRNA、INF-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

通過(guò)對(duì)8周運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)后小鼠IL-4 mRNA、INF-γ mRNA表達(dá)水平的變化情況，可以觀察到陽(yáng)性對(duì)照組IL-4 mRNA、INF-γ mRNA表達(dá)水平相對(duì)陰性對(duì)照組顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明小鼠經(jīng)遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練處于運(yùn)動(dòng)免疫抑制狀態(tài)。FoP各劑量組IL-4 mRNA表達(dá)水平顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組；INF-γ mRNA表達(dá)水平相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組顯著上升，其中中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01）。FoP各劑量組IL-4 mRNA/INF-γ mRNA比值基本處于平衡狀態(tài)，說(shuō)明FoP各劑量組Th1/Th2免疫水平處于相對(duì)平衡狀態(tài)。

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究表明，運(yùn)動(dòng)疲勞尤其是長(zhǎng)期疲勞積累狀態(tài)下，機(jī)體的抗氧化能力及機(jī)能水平會(huì)發(fā)生適應(yīng)性變化，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中氧自由基的增加是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生的一個(gè)重要因素[8-9]。HB（血紅蛋白）是運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量常用測(cè)試指標(biāo)，血紅蛋白主要生理功能是運(yùn)輸氧和二氧化碳，能綜合反映在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中血液攜帶氧的能力[10]；肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線(xiàn)粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、TP再生有直接關(guān)系的重要激酶，能夠可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)[11-12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)oP可以顯著提高運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠的HB水平，并顯著降低運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠血清CK濃度，說(shuō)明FoP具有較好的抗疲勞作用。

機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者可以攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸（Poiyunstaturated Fatty Acid，PUFA），引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物。MDA水平常常可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映機(jī)體細(xì)胞損傷的程度[13]。機(jī)體在運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下，產(chǎn)生大量氧自由基，雖然機(jī)體的自由基清除途徑被激活，但仍然很難徹底清除氧自由基，殘存的氧自由基誘導(dǎo)大量脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，從而干擾生物膜的正常功能，繼而引發(fā)機(jī)體的代謝紊亂[14,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)oP可有效降低運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠血清MDA水平。

SOD能催化清除超氧陰離子自由基的反應(yīng)，在防御生物體免受超氧陰離子自由基損傷、抗輻射、抗腫瘤及延緩機(jī)體衰老等方面具有重要的作用[16,17]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)oP可明顯提高運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠血清SOD濃度。

在運(yùn)動(dòng)應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)激素系統(tǒng)(HPA)失衡，皮質(zhì)醇等激素含量異常升高，通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞胞漿及核內(nèi)受體抑制IL-12產(chǎn)生，從而導(dǎo)致IFN-γ和IL-2含量降低，且NK細(xì)胞數(shù)量的減少致使其分泌的IFN-γ含量減少，導(dǎo)致Th1型免疫抑制，Th2型免疫優(yōu)勢(shì)[18]。研究結(jié)果表明，F(xiàn)oP作用于運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠可誘導(dǎo)機(jī)體IL-4mRNA、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的上升，逆轉(zhuǎn)了運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)免疫抑制。

維藥阿里紅多糖是一類(lèi)真菌多糖，其研究?jī)r(jià)值在近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注。研究表明，F(xiàn)oP具有改善機(jī)體免疫水平、抗運(yùn)動(dòng)疲勞和增強(qiáng)免疫活性等作用[19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)得到小鼠長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)疲勞模型，并通過(guò)不同劑量FoP干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)oP可以顯著改善長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠抗氧化能力及免疫水平，并誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠IL-4mRNA、INF-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量的上升，從而逆轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)免疫抑制。

1 宋博雅,郝選明.外源性補(bǔ)充Tα1對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制發(fā)展過(guò)程中胸腺組織細(xì)胞的抗凋亡效應(yīng).陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版),2017,45(1)：118-124.

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Effect of Inhibition of Uygur Fomes Officinalis Polysaccharides onAntioxidant Capacity and Exercise Immunity

Wang Fenghua1,Kong Haijun1,Huang Ling2
(1.Laboratory of Sports Biochemistry,School of Physical Education,Xinjiang Normal University,Urumqi 830054,China;2.Ji'nan ADICON Clinical Center,Jinan 250013,China)

This study was aimed to investigate the effects ofFomes officinalispolysaccharides(FoP)on exercise-induced fatigue and exercise immune suppression in mice with FoP induced by exercise fatigue and unbalanced exercise immunity.Through treadmill exercise,the long-term exercise immune suppression model fatigue was established.Different doses of FoP were used in the animal experiment.The experimental animal were randomly divided into the positive control group,negative control group,low dose FoP(20 mg·kg-1)+exercise group,middle dose FoP(40 mg·kg-1)+exercise group,and the high dose FoP(80 mg·kg-1)+exercise group.The intragastric administration was given 6 days per week for 8 weeks.Treadmill exercise was administered during these 8 weeks.After 8 weeks,the samples were sacrificed.The levels of malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD),hemoglobin(HB)and creatine kinase(CK)were detected by kit.And the relative expression of IL-4mRNA,INF-γ mRNA was detected by RT-PCR.The results showed that compared with the positive control group,FoP can significantly improve the level of HB in mice,the level of serum CK in each FoP dose group was significantly decreased;compared with the positive control group,FoP group can significantly eliminate MDA with no significant difference among different FoP dose groups.The contents of SOD in serum of different dose FoP group and the negative control group were significantly higher than that of the positive control group.The IL-4 mRNA/INF-γ mRNA ratio of different dose FoP group were in basic equilibrium.It was concluded that Uygur FoP can effectively promote the body fatigue recovery,accelerate the clearance of free radicals,and improve the antioxidant ability and immune status.

UygurFomes officinalispolysaccharides,sports fatigue,free radical,antioxidant,exercise immune suppression

10.11842/wst.2017.08.022

R285

A

2017-03-15

修回日期：2017-06-23

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31660736）：三倍體虹鱒不育相關(guān)miRNA的鑒定與表達(dá)調(diào)控研究，負(fù)責(zé)人：王鳳華；2016年新疆維吾爾自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（XJGRI2016106）：茶多酚+維藥阿里紅對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)及血清TH1/TH2平衡干預(yù)研究，負(fù)責(zé)人：孔海軍。

＊＊ 通訊作者：王鳳華，博士，副教授，主要研究方向：主要從事運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)研究。

（責(zé)任編輯：張 靜，責(zé)任譯審：王 晶）