目的：與美國農(nóng)業(yè)部微生物實(shí)驗(yàn)室指南8.08章參考方法進(jìn)行對比，驗(yàn)證Veriflow LS李斯特菌屬定性檢測方法的性能。方法及結(jié)果：本次性能驗(yàn)證研究采用了6種不同環(huán)境樣品和食品基質(zhì)來驗(yàn)證Veriflow LS方法對于檢測低菌量李斯特菌的能力。在每個非配對的對比試驗(yàn)中，陽性檢出率的結(jié)果顯示，Veriflow LS的檢測結(jié)果與參考方法無顯著性差異。參考方法對Veriflow LS檢測過的樣品的確認(rèn)的結(jié)果顯示，Veriflow LS檢測結(jié)果無假陽性和假陰性。同時對51個李斯特菌屬和35個非李斯特菌屬進(jìn)行了包容性驗(yàn)證和排他性驗(yàn)證，結(jié)果顯示包容性和排他性均為100%?？偨Y(jié)：Veriflow LS是一個靈敏、選擇性強(qiáng)、耐用的環(huán)境表面（不銹鋼、混凝土、塑料和陶瓷的表面）和即食食品基質(zhì)（熱狗和熟火雞肉）中李斯特菌屬的檢測方法。

前言

李斯特菌屬（Listeria）既包括默氏李斯特菌等無致病性的李斯特菌，還包括伊氏李斯特菌、威爾斯李斯特菌、格氏李斯特菌和單增李斯特菌等具有致病性的種屬，其中單增李斯特菌對人類的危害最大，能夠引起人體食物中毒，引發(fā)骨髓炎、腦膜炎、心肌炎、孕婦流產(chǎn)以及產(chǎn)褥感染等。李斯特菌屬廣泛存在于自然界中，在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，故而已引起公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域的廣泛重視。正因如此，李斯特菌屬的快速檢測對于預(yù)防由該菌屬引發(fā)的食物中毒和食源性疾病具有重要的指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)的李斯特菌屬檢測手段是培養(yǎng)法，包括預(yù)增菌（24h）、選擇性增菌（24h）、選擇性平板（48h）、生化反應(yīng)等過程，是檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其費(fèi)時費(fèi)力、成本高、專業(yè)性強(qiáng)，顯然無法滿足快速檢測的需求。目前李斯特菌屬快速檢測方法主要有免疫方法和熒光PCR法，雖都可有效縮短檢測時間，但前者在致病菌檢測時存在較高的假陽性和假陰性，而后者的前處理通常操作復(fù)雜（需要核酸提?。?，對操作人員的要求高，成本高且存在氣溶膠引起的假陽性。因此，市場亟需一種更為簡便、高效且特異性強(qiáng)的李斯特菌屬快速檢測方法。

Veriflow LS是基于DNA分子技術(shù)開發(fā)的李斯特菌屬的快速檢測系統(tǒng)，適用于環(huán)境表面和食品基質(zhì)的檢測，只需22小時的前增菌、60～90分鐘的擴(kuò)增和3分鐘的層析檢測，即可得出檢驗(yàn)結(jié)果。該方法將PCR技術(shù)與垂直流層析系統(tǒng)結(jié)合，無需提取核酸，具有高特異性和高靈敏度，同時采用專利的酶系統(tǒng)有效降低了假陽性和假陰性。本次實(shí)驗(yàn)將Veriflow LS系統(tǒng)方法與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對比，驗(yàn)證了Veriflow LS系統(tǒng)方法的性能。

1 方法原理

將采集的樣品增菌，然后取增菌液用于PCR擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物直接加入到層析卡盒的加樣窗內(nèi)，僅需等待3分鐘即可產(chǎn)生反應(yīng)信號。拉動檢測卡盒上的開關(guān)，觀察檢測結(jié)果。檢測結(jié)果為陽性時，靶標(biāo)分析物被捕獲并固定在測試膜上，在陽性線處生成視覺信號，在測試卡盒標(biāo)記的“T”端，分析物聚集產(chǎn)生清晰的紅色檢測線；控制線同時在“C”區(qū)顯現(xiàn)，表明實(shí)驗(yàn)的操作是正確的。兩條紅線表明樣品為李斯特屬陽性，而一條質(zhì)控線則表明樣品為李斯特屬陰性。

2 實(shí)驗(yàn)器材及樣品

對比方法（參考方法）：美國農(nóng)業(yè)部微生物實(shí)驗(yàn)室指南8.08章參考方法。

樣品基質(zhì)：不銹鋼表面、混凝土表面、塑料表面、陶瓷表面、熱狗和熟火雞肉。Veriflow LS所需器材：Veriflow LS李斯特菌屬檢測試劑盒（含PCR試劑、層析檢測卡等）、IS PCR儀、移液器、金屬浴加熱器（95±2℃）。

菌種：各菌株分別來自ATCC、BEI、佛蒙特大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)、NCTC和NCIMB。所有菌株都經(jīng)參考方法確認(rèn)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)用菌懸液準(zhǔn)備

單核增生李斯特菌：將菌種培養(yǎng)物增菌并添到樣品中，使樣品的陽性率在20%～80%即可用于Veriflow LS耐用性測試和批次間穩(wěn)定性測試。具體步驟如下：菌株接種于BHI肉湯中至穩(wěn)定期（含量約為1.5×109CFU/mL），稀釋，取稀釋因子為108的稀釋液100μL加入到50mL的李斯特肉湯中，混勻，從中取5mL加入到100mL李斯特肉湯中并于35±1℃培養(yǎng)22h。陰性對照菌：腸球菌ATCC 29212用BHI肉湯增菌直至穩(wěn)定期，用于Veriflow LS耐用性和批次間穩(wěn)定性測試。包容性測試菌株：51株李斯特菌屬菌株分別增菌，釋至50×LOD值（約為5.0×105CFU/mL），不經(jīng)增菌直接上機(jī)檢測。排他性菌株：35株排他性菌株增菌至穩(wěn)定期，該濃度用于Veriflow LS排他性測試。

3.2 Veriflow LS檢測流程

增菌方法：取樣品與適量李斯特肉湯混合，均質(zhì)，35±2℃培養(yǎng)22h。樣品準(zhǔn)備和PCR擴(kuò)增：取增菌好的樣品500μL增菌液加入到配套的采樣管中，滅活10min后，移取5μL加到PCR試劑管中，放入擴(kuò)增儀中并運(yùn)行對應(yīng)程序。層析檢測：在已完成擴(kuò)增的PCR管子中加入4滴緩沖液B，層析檢測卡加樣窗內(nèi)，等待約3min，即可打開層析檢測卡視窗獲取結(jié)果（2h內(nèi)打開有效）。結(jié)果判讀：檢測卡視窗內(nèi)只有1條紅線（控制線），表明樣品為李斯特菌屬陰性；檢測卡視窗內(nèi)有2條紅線（控制線和陽性線），則表明樣品為李斯特菌屬陽性。

3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.3.1 耐用性驗(yàn)證

Veriflow LS系統(tǒng)參數(shù)改變時，低菌量陽性樣和陰性樣（非李斯特菌屬）的檢測和分析一定程度上會偏離標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，因此要進(jìn)行耐用性驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用了析因設(shè)計(jì)（見表1），變更的參數(shù)分別為：滅活時間（8或12min±30s）、IS緩沖液B添加量（3滴或5滴）和LS層析檢測卡層析時間（1.5或2.5min±15s）。

3.3.2 批次間穩(wěn)定性測試endprint

本次實(shí)驗(yàn)采用了3個獨(dú)立生產(chǎn)的批次，批次號分別為ML0032、ML0035和ML0037，每個批次分別在0個月、6個月和12個月的時間點(diǎn)（通過加速老化完成）進(jìn)行了如表2所示的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。每個時間點(diǎn)分別采用10個含0～9個目標(biāo)菌（10個樣品中部分不含目標(biāo)菌）的樣品和5個含非目標(biāo)菌樣品進(jìn)行驗(yàn)證，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

3.3.3 特異性測試（包容性和排他性測試）

用準(zhǔn)備好的包容性和排他性菌株菌懸液，不經(jīng)增菌，按照Veriflow操作說明書進(jìn)行分析檢測。（注：所有包容性驗(yàn)證菌株的培養(yǎng)物都已經(jīng)過參考方法確認(rèn)。）

3.3.4 獨(dú)立方法對比實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑楸容^Veriflow LS檢測方法和參考方法在檢測環(huán)境表面樣品與即食食品樣品中李斯特菌屬的性能差異。由于Veriflow LS和參考方法的前增菌培養(yǎng)基不同，本次實(shí)驗(yàn)對所有樣品基質(zhì)都采用獨(dú)立的非配對方法進(jìn)行分析檢測。（注：每個Veriflow LS檢測過的樣品都經(jīng)參考方法確認(rèn)并確保Veriflow LS檢測結(jié)果無假陽性或假陰性）。本次實(shí)驗(yàn)的每種樣品都采用了30個樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中5個樣品未添加目標(biāo)菌（濃度為0CFU/采樣量），20個添加了低含量目標(biāo)菌（濃度為0.2～2CFU/采樣量），另外5個添加了高含量目標(biāo)菌（濃度為2～5CFU/采樣量），并且每種樣品都添加不同李斯特菌。設(shè)計(jì)低含量添加樣品的目的是使20個樣品中部分樣品的結(jié)果為陽性，部分結(jié)果樣品的結(jié)果為陰性，比例在5/20～15/20之間，以比較兩種方法的結(jié)果是否存在陽性檢出率上的差異。

環(huán)境表面樣品：將兩種檢測方法（Verilow LS和參考方法）所采用的各類環(huán)境表面分別添加不同的李斯特菌以獲得不同程度污染的表面。不銹鋼表面和混凝土表面采樣方法：10×10cm的表面添加0.25mL菌懸液并用Hygeina海綿棒采樣。陶瓷和塑料表面采樣方法：2.5×2.5cm表面添加0.10mL菌懸液并用Hygeina Q-Swab拭子采樣。除添加李斯特菌之外，不銹鋼表面還添加了高于目標(biāo)菌（李斯特菌）含量10倍的競爭性菌—糞腸球菌ATCC 29212。取樣前所有表面都在室溫（24±2℃）下自然風(fēng)干16～24h，菌懸液都采用TSA培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。采樣完成后，可按照兩種方法各自的操作說明進(jìn)行后續(xù)檢測。

即食食品樣品：兩種食品基質(zhì)添加了不同的李斯特菌。對每種食品基質(zhì)添加陽性培養(yǎng)物稀釋液后在4±1℃下放置48～72h，將樣品分成適當(dāng)份數(shù)并分裝于均質(zhì)袋中，增菌并進(jìn)行后續(xù)檢測。（添加的李斯特菌在50±2℃下熱應(yīng)激10min便已失去50%的活力）。用MPN法對樣品中李斯特菌含量進(jìn)行計(jì)數(shù)。采樣完成后，按照兩種方法各自的操作說明進(jìn)行后續(xù)檢測。

3.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

POD：在一定基質(zhì)和一定待測物濃度下，定性分析方法獲得陽性分析結(jié)果數(shù)的比例。POD值與濃度有關(guān)，POD的計(jì)算公式為POD=陽性結(jié)果數(shù)量/試驗(yàn)總數(shù)。以下幾個POD值分別為：PODR（參考方法POD），PODC（被評估方法POD），在95%的置信區(qū)間內(nèi)評估POD值，包括PODR、PODC。

dPOD：兩個POD值之差，dPODC=PODC-PODR，計(jì)算dPODC的95%的置信區(qū)間。若置信區(qū)間不包括0，則兩種方法存在顯著性差異，反之則不存顯著性差異。

4 結(jié)果

4.1 耐用性和批次間穩(wěn)定性結(jié)果

耐用性測試結(jié)果（見表1）顯示，在不同參數(shù)（包括滅活時間、緩沖液B添加滴數(shù)和層析卡層析時間）結(jié)合改變下，Veriflow系統(tǒng)性能不受影響，并且所有結(jié)果用參考方法進(jìn)行陽性確認(rèn)后都為真陽性。這些結(jié)果表明，一些系統(tǒng)參數(shù)的改變不會對系統(tǒng)的性能產(chǎn)生影響。

批次間穩(wěn)定性結(jié)果（見表2）顯示批次間穩(wěn)定性良好，每個批次和時間點(diǎn)的層析檢測卡具有一致的性能表現(xiàn)。這一結(jié)果同時也表明，Veriflow LS具有至少12個月的穩(wěn)定保質(zhì)期。

4.2 包容性和排他性測試

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Veriflow LS準(zhǔn)確無誤地檢測出了51株不同的李斯特菌屬。另外，排他性結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確無誤辨別李斯特菌屬之外的雜菌。（注：屎腸球菌ATCC 19434在非選擇性增菌培養(yǎng)基增菌后上機(jī)檢測出現(xiàn)了假陽性，但采用選擇性增菌培養(yǎng)基（ISLB）增菌后上機(jī)檢測則為陰性。）

4.3 環(huán)境樣品結(jié)果比較

4種表面上分別添加3個不同濃度（不添加菌、低菌量和高菌量）的不同菌，采樣，最后用各自的方法進(jìn)行檢測。添加低菌量表面的檢測對比結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)方法和參考方法在不銹鋼表面樣品分別檢出12和8個陽性樣本，混凝土表面樣品分別檢出15和14個陽性樣本，陶瓷表面樣品分別檢出8和11個陽性樣本，塑料表面樣品兩種方法則分別檢出了8和11個陽性樣本。4種表面中，未添加李斯特菌屬的表面兩種方法的結(jié)果均為陰性，添加高菌量的表面兩種方法的結(jié)果均為陽性。所有Veriflow LS的結(jié)果都經(jīng)參考方法確認(rèn)，無假陽性和假陰性。同時，POD的分析結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)和參考方法的結(jié)果均不存在顯著性差異。

4.4 即食食品樣品結(jié)果對比

添加3個不同濃度李斯特菌屬的即食食品分析結(jié)果顯示：Veriflow LS系統(tǒng)方法和參考方法在20個低污染的熟火雞肉樣品（0.22CFU/125g）中分別檢出了8例和7例陽性，20個低污染的熱狗樣品中各自都檢出了13例陽性。兩種即食食品中，未添加李斯特菌屬的樣品兩種方法的結(jié)果均為陰性，添加高菌量的樣品兩種方法的結(jié)果均為陽性。所有Veriflow LS的結(jié)果都經(jīng)參考方法確認(rèn)，無假陽性和假陰性結(jié)果。同時，POD的分析結(jié)果（見表3）顯示，Veriflow LS系統(tǒng)的結(jié)果和參考方法的結(jié)果不存在顯著性差異。

5 討論與結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與傳統(tǒng)參考方法相比較，Veriflow LS檢測系統(tǒng)在檢測環(huán)境（不銹鋼、混凝土、塑料和陶瓷的表面）和即食食品（熱狗和熟火雞肉）中李斯特菌屬時具有很好的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性。6種基質(zhì)的POD值數(shù)據(jù)分析均顯示，Veriflow LS系統(tǒng)方法的和參考方法的性能不存在顯著性差異。高特異性（包容性和排他性）也是本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一，特異性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，Veriflow LS系統(tǒng)能準(zhǔn)確無誤的識別出樣品李斯特菌屬而不受其他非李斯特屬的雜菌的干擾，有效提高檢出率。

Veriflow LS李斯特菌屬檢測系統(tǒng)無需復(fù)雜的前增菌過程，也無需復(fù)雜的前處理（無需DNA提純），且經(jīng)多種表面樣品（海綿棒或拭子采樣）和食品基質(zhì)的驗(yàn)證，具有良好的準(zhǔn)確度，可為終端用戶提供靈活便捷的使用體驗(yàn)。同時，相較于參考方法中冗長的實(shí)驗(yàn)流程（參考方法需3～4天的檢測時間），Veriflow LS檢測系統(tǒng)能節(jié)省大量的時間—只需24小時的前增菌和2小時的擴(kuò)增時間即可獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。批次間的穩(wěn)定性測試也表明，Veriflow LS的試劑盒是具有重復(fù)性好、耐用和生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)的李斯特菌屬檢測試劑盒。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，操作簡單的Veriflow LS檢測系統(tǒng)可以提供一種靈敏、可靠和易用的環(huán)境樣品和食品基質(zhì)中的李斯特菌屬的檢測方法。endprint