陳 亮，崔芬芬，宋 蕓，朱琴梅，喬永剛

曼地亞紅豆杉染色體核型分析

陳 亮1，崔芬芬1，宋 蕓1，朱琴梅2，喬永剛1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.介休市經(jīng)貿(mào)局蔬菜基地建設(shè)辦，山西 介休 032000)

利用曼地亞紅豆杉硬枝扦插產(chǎn)生的不定根，進行根尖染色體制片，并做核型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曼地亞紅豆杉染色體數(shù)目為2n=2x=24，核型公式為2n=24=20m+2sm+2st，曼地亞紅豆杉中部著絲粒染色體(m)為10對，近中部著絲粒染色體(sm)為1對，近端著絲粒染色體(st)為1對，曼地亞紅豆杉核型為2A型。

曼地亞紅豆杉；染色體；核型

曼地亞紅豆杉(TaxusmediaRehd.)是以東北紅豆杉(T.cuspidateSieb.et Zucc.)為母本，歐洲紅豆杉(T.baccataL.)為父本，兩者雜交形成的天然雜交種，原產(chǎn)于加拿大和美國。于1918年被美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)，并在20世紀末引入中國，在世界范圍內(nèi)均有引種栽培。曼地亞紅豆杉為常綠灌木，耐寒，能抵抗-25 ℃低溫，生長速度快。部分紅豆杉屬植物含有抗腫瘤藥物紫杉醇，但大部分該屬植物僅樹皮中有微量的紫杉醇。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，天然種紅豆杉樹皮中紫杉醇的含量一般在0.004%～0.010%之間，而曼地亞紅豆杉紫杉醇含量則高達0.03%～0.06%，是天然種紅豆杉的8倍～10倍。經(jīng)美國FDA批準，曼地亞紅豆杉可以用作提取紫杉醇。近年來，染色體核型分析成為諸多領(lǐng)域(如，染色體工程等)的重要研究手段，它與植物形態(tài)觀察和基因組測序聯(lián)合應(yīng)用于植物的分類與遺傳進化。筆者觀察了曼地亞紅豆杉染色體的數(shù)目和形態(tài)，并對其進行核型分析，旨在為曼地亞紅豆杉的良種選育和栽培提供細胞學(xué)基礎(chǔ)。此外，也為其在紅豆杉屬中的分類提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

本試驗所用材料為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥種質(zhì)資源圃內(nèi)扦插成活的2年生曼地亞紅豆杉雌株。

1.2方法

1.2.1 根尖的獲取

以曼地亞紅豆杉扦插苗為材料，3月至6月早上8點至10點，切取不定根根尖，置于對二氯苯飽和水溶液中處理3 h～5 h.然后放入新配制的卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定24 h.固定后放入70%的酒精中保存，一般可保存1周至2周，如放入冰箱中(2 ℃～8 ℃)可保存數(shù)月。

1.2.2 細胞學(xué)制片

對王立等的細胞學(xué)制片方法進行改良，將固定好的材料用蒸餾水洗3次～5次，放入1 mol/L的HCl中，在常溫條件下解離10 min左右。然后將材料轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入卡寶品紅染色液(淹沒材料即可)，染色20 min～30 min.用刀片切取已染色的根尖前部1 mm～2 mm，再進行縱切(一分為二)。然后將切下的根尖置于載玻片中央，滴加1滴染液后蓋上蓋玻片。將載玻片放在平整的桌面上，在蓋玻片上放1層濾紙條，用左手手指壓住，防止蓋玻片滑動。再用鉛筆帶橡皮的一端垂直輕輕敲打蓋玻片，使材料均勻散開，細胞分散壓平。

1.2.3 鏡檢及核型分析

用Olmpus BX 51顯微鏡觀察制好的曼地亞紅豆杉根尖染色體片子，選擇分散較理想、染色較清晰的中期染色體圖像進行顯微攝影。用Adobe Photoshop軟件對拍攝的圖片進行處理，并利用VIDEOTEST-KARYO 3.0自動核型分析軟件進行分析，核型參數(shù)測量與核型分類方法按照李懋學(xué)等的方法。之后，按照喬永剛等的方法，在Office軟件中利用染色體相對長度的參數(shù)制作出相應(yīng)的染色體核型模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1染色體數(shù)目

通過對50個染色清晰且分散良好的中期分裂相進行準確計數(shù)，最終確定曼地亞紅豆杉染色體數(shù)為：2n=2x=24，具體形態(tài)，見圖1.

圖1 曼地亞紅豆杉染色體和染色體核型圖

2.2核型參數(shù)

筆者選取了5張比較清晰的曼地亞紅豆杉染色體中期分裂相圖片進行核型分析，確定其染色體數(shù)目為：2n=2x=24，核型公式為：2n=24=20m+2sm+2st.曼地亞紅豆杉具體的核型參數(shù)，見表1.核型模式圖，見圖2.

表1 曼地亞紅豆杉染色體參數(shù)

圖2 曼地亞紅豆杉核型模式圖

由表1可以看出，曼地亞紅豆杉中最長染色體與最短染色體的長度之比為3.43.整個染色體組中有8.33%的染色體臂比值大于2.0，在核型分類上屬于2A型。曼地亞紅豆杉的長臂總長/全組染色體總長(即核型不對稱系數(shù))為55.81%.在曼地亞紅豆杉的12對染色體中，中部著絲粒染色體(m)有10對，占全部染色體總數(shù)的83.33%；近中部著絲粒染色體(sm)只有1對，占全部染色體總數(shù)的8.33%；而剩下的1對染色體為近端部著絲粒染色體(st)，也占全部染色體總數(shù)的8.33%.

3 討論

染色體常規(guī)壓片試驗中有多個關(guān)鍵步驟會影響染色體制片質(zhì)量。如，解離時間不夠，則壓片不易分散；解離時間過長，則會在下一步處理材料時，因材料過軟而將根尖丟失。當解離時間過短，染色質(zhì)也會有不同程度著色，從而影響顯色攝影時的分色情況。當解離過度時，制作出的片子背景無色，染色體著色淺淡甚至不著色。只有掌握好解離的時間和程度，才可獲得比較理想的染色效果，保證結(jié)果的可靠性。在使用鹽酸解離材料后，需立即用蒸餾水將試驗材料中殘留的鹽酸清洗干凈，以免卡寶品紅著色不均，或者不能著色。筆者將紅豆杉根尖解離時間定為10 min，取得了很好的解離效果。

筆者研究得出曼地亞紅豆杉的染色體數(shù)為2n=2x=24，曼地亞紅豆杉的核型屬于2A型。染色體數(shù)目與周其興、王貴榮等的研究結(jié)果一致，紅豆杉屬的染色體數(shù)(2n=24)、染色體基數(shù)(x=12)一致。顧志建等研究了紅豆杉屬3種1變種以及白豆杉的核型，認為紅豆杉屬3種1變種的核型相似，建議合并為1種。其中，曼地亞紅豆杉的母本東北紅豆杉核型為2n=24=18m+4sm+2T.陳可詠最早報道了東北紅豆杉的核型為2n=4M+10m+6msm+2sm+2T.以上研究中均發(fā)現(xiàn)了端部著絲粒染色體。筆者發(fā)現(xiàn)曼地亞紅豆杉有2條近端著絲粒染色體，并未發(fā)現(xiàn)端著絲粒染色體。

參照Stebbins對植物界核型進化提出的分類學(xué)標準，即：由對稱型向不對稱型發(fā)展，核型越不對稱則越進化?？梢钥隙貋喖t豆杉是一種較為原始的物種。筆者首次報道了曼地亞紅豆杉的核型分析數(shù)據(jù)，為今后曼地亞紅豆杉的深入研究提供了細胞學(xué)依據(jù)。

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KaryotypeAnalysisofTaxusMedia

ChenLiang1，CuiFenfen1，SongYun1，ZhuQinmei2，QiaoYonggang1

(1.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；2.TheVegetableBaseConstructionOfficeofJiexiuCityEconomicandTradeBureau,Jiexiu032000,China)

The karyotype formulas ofTaxusmediawere studied based on the data of measurements of mitotic metaphase chromosomes.The results showed that the chromosome number was 2n=2x=24 and its karyotype formula was 2n=24=20m+2sm+2st.The metacentric chromosome (m) was 10 pairs,the submetacentric chromosome (sm) was 1 pairs and the subtelocentric chromosome (st) was 1 pairs.The karyotype ofTaxusmediabelonged to 2A Stebbins.

Taxusmedia；Chromosome；Karyotype

S791.49

A

1007-726X(2017)03-0037-03

2017-02-10

山西省科技攻關(guān)項目(20140312001-2)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)育種基金(2014yz07)；山西省科技攻關(guān)項目(20130311023-4)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)第十二批大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(12-67)

陳 亮(1991— )，男，山西左權(quán)人，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生，生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)。

喬永剛(1979— )，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，在讀博士，研究方向為藥用植物遺傳育種與栽培。