李幫同

基于同工酶分析技術(shù)的山西關(guān)帝山三道川油松林種群分化研究

李幫同

(山西省林業(yè)種苗管理總站，山西 太原 030801)

油松種子樣品取于關(guān)帝山三道川油松天然林，主要收集地點為侯家溝、麻峪口、陳家莊、神堂溝、木口溝5個林分。采用同功酶分析技術(shù)，包括酶液制備、凝膠制備、電泳、染色等環(huán)節(jié)，分析了5個油松優(yōu)良林分同功酶位點上的變異總量在林分間和群體內(nèi)的分布情況。同時對林分變異做了基因多樣度分析，GST值在位點間變動幅度較大，變化范圍從0.006 0～0.070 9.7個位點上的GST平均值為0.049 8，即林分間的平均變異量僅占總?cè)后w的4.98%，而林分內(nèi)的個體變異量占95.02%，揭示了三道川油松種群分化不明顯，而個體分化顯著的規(guī)律,為油松良種基地建設(shè)、修復(fù)和管理提供了科學(xué)依據(jù)。

山西?。挥退闪址?；同功酶；GST值

從分子群體遺傳學(xué)角度研究林木群體遺傳變異，可直接度量群體內(nèi)的遺傳變異程度，且完全不受環(huán)境影響的干擾。從接近DNA水平上了解遺傳變異，在目前可行的方法中，采用同功酶技術(shù)是最好的途徑。采用同功酶技術(shù)研究種源變異的文獻(xiàn)有很多，例如，F(xiàn)ins和Libby關(guān)于紅杉(LarixpotaniniiBatalin)的研究，以及Nikolic和Tucic關(guān)于歐洲黑松(PinusnigraArn)的研究。在我國，已通過同功酶來研究林木遺傳變異的樹種有馬尾松(Pinusmassoniana)、杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.)Hook]、紅松(Pinus koraiensis)、油松(Pinus tabulaeformisCarr.)等。

油松是我國特有的鄉(xiāng)土樹種之一，其在漫長的生長發(fā)育中存在著群體、個體上的性狀差異，并且這種差異具有一定程度的遺傳穩(wěn)定性。筆者對山西關(guān)帝山三道川油松種群同功酶的性狀差異及其遺傳穩(wěn)定性展開了初步探索，以期為今后油松林種群分化的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1材料收集

油松種子樣品取于關(guān)帝山三道川油松天然林，主要收集地點為侯家溝、麻峪口、陳家莊、神堂溝、木口溝5個林分。每個林分選擇10株優(yōu)勢木，優(yōu)勢木間距不小于50m，球果采自樹冠中上部，東、南、西、北4個方向各采5個，每株共采20個。

1.2同功酶分析方法

1.2.1 酶液制備

取三道川5個油松林分每個群體、每個單株自由授粉的種子30粒，用水沖洗干凈后，在25 ℃的溫水中浸泡2d.然后置于濕潤濾紙上，繼續(xù)培養(yǎng)3d～5d.至種子露白時，剝?nèi)∶苛７N子的單倍體胚乳，放入指形管中，加入1mL樣品提取液(pH值為7.6的磷酸緩沖液0.2mol)，在冰浴中研磨成勻漿。之后倒入離心管，再將1mL40%蔗糖溶液沖入離心管，冷凍離心10min(0 ℃，10 000r/min)后，取上清液，置于(0 ℃～ 4 ℃)冰箱內(nèi)，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 凝膠制備

分離膠的濃度是10%，用量為20mL;濃縮膠的濃度是4%，用量為5mL,按表1的比例制備。

表1 凝膠制備

1.2.3 電泳

采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法。5種酶的緩沖系統(tǒng)見表2.先用100 V電壓預(yù)電泳1 h，后用250 V電壓繼續(xù)電泳3.0 h～3.5 h.待溴酚蘭指示劑移至液面1 cm時，停止電泳，剝膠染色。

表2 緩沖系統(tǒng)

1.2.4 染色

草轉(zhuǎn)氨酶(AAT)：稱取0.073 g α-酮戊二酸，0.267 5 g天冬酸，1.0 g PVP，0.1 g EDTA和2.84 g Na2HPO4溶于H2O中，定容至200 mL，配制成AAT底物溶液。稱取0.05 g固藍(lán)BB溶于50 mL AAT底物溶液，即為染色液。將凝膠取出放入染色缸，倒入染色液，黑暗中37 ℃溫育膠，直到呈現(xiàn)棕色的酶活性區(qū)帶。

乙醇脫氫酶(ADH)：取NAD 15 mg，NBT 15 mg，PMS(吩嗪二甲酯硫酸鹽)2.5 mg，0.2 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)緩沖液50 mL,混勻作為染色液。染色前加5 mL 95%乙醇作底物。電泳后剝下的凝膠板放在染色液中，37 ℃保溫至顯現(xiàn)深藍(lán)色的條帶時，倒掉染色液，用蒸餾水沖洗，拍照記錄。

山梨醇脫氫酶(SDH)：稱取150 mg山梨醇，溶于30 mL 0.2M的Tris-HCl(pH值8.0)，10 mg NAD，10 mg MTT和5 mg PMS溶于20 mL 0.2 M的Tris-HCl(pH值8.0)中，量取1.0 mL 1%的 MgCl2，將3種溶液混勻后即為染色液。取出凝膠放入染色缸，倒入染色液，黑暗中溫育膠30 min～60 min，直到藍(lán)帶顯示。

蘋果酸酶(ME)：稱取10 mg NADP，10 mg MTT和5 mg PMS溶解于10 mL 0.2 M的Tris-HCl(pH值8.0)，量取5 mL 1%的 MgCl2和25 ml 0.5 M的蘋果酸(pH值7.0)，混入上述溶液，即為染色液。取出凝膠放入染色缸，倒入染色液，黑暗中溫育膠，直到譜帶顯示。

蘋果酸脫氫酶(MDH)：稱取10 mg NAD，10 mg NBT和5 mg PMS溶解于25 mL 0.2 M的Tris-HCl(pH值8.0).量取25 mL 0.5 M的蘋果酸(pH值7.0)，混入上述溶液，即為染色液。取出凝膠放入染色缸，倒入染色液，凝膠在黑暗中37 ℃溫育膠2 h以上，直到酶帶活性區(qū)帶呈現(xiàn)深藍(lán)色。

1.2.5 同功酶位點的確定和等位基因的命名

根據(jù)5種同功酶的酶譜繪制酶譜示意圖。在表示同功酶位點和等位基因時，由酶的縮寫字母代表酶系統(tǒng)，連字符后的數(shù)字代表不同的位點，距正極最近的位點為1，其它各位點依次用2，3，…表示。對同一位點，等位基因的確定根據(jù)譜帶的遷移率，依次用A，B，C…表示。無活性或活性極弱的譜帶用SA表示。

1.3分析方法

同功酶位點變異的度量指標(biāo)：

1) 多態(tài)位點百分率(P)：同工酶測定為多態(tài)的位點占測定總位點數(shù)的百分比即位多態(tài)位點百分率。當(dāng)群體中某位點有0.01以上頻率的復(fù)等位基因共存時，該位點稱為多態(tài)，否則為單態(tài)。

2) 等位基因平均數(shù)(A)：

式中：ai——第i個位點的等位基因數(shù)；

n——同功酶測定的位點總數(shù)。

3) 等位基因頻率(fij)：

式中：Nij——基因的個數(shù)；

N——基因的總數(shù)。

4) 平均期望雜合度(He)：

式中：hei——第i個位點期望雜合度；

h——同功酶測定的位點總數(shù)。

5) 基因分化系數(shù)(GST)：

式中：Ht——總?cè)后w的基因多樣度；

Hs——群體內(nèi)基因多樣度。

GST反映了群體間變異占總變異比值的大小，是度量群體分化的理想指標(biāo)。

6) 遺傳距離(D)：

其中，

式中：JX——在X群體隨機(jī)選出的基因相同概率的平均數(shù)；

JY——在Y群體隨機(jī)選出的基因相同概率的平均數(shù)；

JXY——在X，Y兩個群體隨機(jī)選出的兩個基因相同概率的平均數(shù)；

fXij——X群體第i個位點第j個等位基因的頻率；

fYij——Y群體第i個位點第j個等位基因的頻率。

2 研究結(jié)果

2.1油松5個優(yōu)良林分的形態(tài)變異分析

測定的5個油松優(yōu)良林分分別為侯家溝林分、麻峪口林分、陳家莊林分、神堂溝林分、木口溝林分，其針葉長、球果長、球果寬、百粒重等性狀特征值見表3.

表3 5個油松優(yōu)良林分的性狀特征值

從表3可以看出，5個油松優(yōu)良林分針葉長的平均值為10.5 cm，變幅為7.3 cm～12.9 cm，變異系數(shù)為0.105 1.球果長平均值為5.3 cm，變幅為4.2 cm～6.6 cm，變異系數(shù)為0.101 8.球果寬平均值為3.6 cm，變幅為2.9 cm～4.4 cm，變異系數(shù)為0.089 2.百粒重平均值為4.8 g，變幅為3.3 g～6.4 g，變異系數(shù)為0.152 7.針葉和球果的變異系數(shù)明顯小于百粒重的變異系數(shù)，說明百粒重受環(huán)境影響較大。

對5個油松優(yōu)良林分針葉長、球果長、球果寬、百粒重的差異分別做了單因素方差分析，結(jié)果見表4.

表4 5個油松優(yōu)良林分的性狀方差分析

從表 4 可以看出，油松優(yōu)良林分間各性狀的差異均未達(dá)顯著水平，說明 5 個油松優(yōu)良林分性狀表現(xiàn)是相對穩(wěn)定的。

2.2油松優(yōu)良林分同功酶分析

2.2.1 酶譜分析

5種同功酶的酶譜示意圖見第17頁圖1至圖5.

由圖1至圖5可以看出：

1) GOT在所有分析的單株中均有2個染色區(qū)，分別定名為Got-1和Got-2.Got-1有2種譜帶表現(xiàn)形式，一種是最常見的慢帶(等位基因A)，一種是快帶(等位基因B)。Got-2有3種譜帶表現(xiàn)形式。由于GOT重復(fù)性好，在林木研究中已有很多報道，不同樹種在GOT的位點上存在差異。

2) ADH在分析的單株中有1個染色區(qū)，受1個位點控制，有3種譜帶表現(xiàn)。

3) SDH在分析的單株中有1個染色區(qū)，受1個位點控制，有3種譜帶表現(xiàn)。

4) MDH在分析的單株中有2個染色區(qū)，受2個位點(Mdh-1，Mdh-2)控制。其中,Mdh-1有3種譜帶表現(xiàn)形式，Mdh-2有4種譜帶表現(xiàn)形式。目前，大部分研究中報道，MDH受4個位點控制，但也有一部分報道顯示其受2個或3個位點控制。

5) ME在所有的單株中均有一條清晰的譜帶，屬于1個染色區(qū)，受1個位點控制。該位點只有1個等位基因，屬單態(tài)位點。

圖1 GOT酶譜示意圖 圖2 ADH酶譜示意圖

圖3 SDH酶譜示意圖 圖4 MDH酶譜示意圖

圖5 ME酶譜示意圖

2.2.2 油松優(yōu)良林分基因異質(zhì)水平

5個油松優(yōu)良林分的等位基因頻率及期望雜合度見表5.

表5給出了5個油松優(yōu)良林分在7個位點的等位基因頻率(fij)和期望雜合度(He)。有6個位點(Got-1，Got-2，Adh-1，Sdh-1，Mdh-1，Mdh-2)是多態(tài)的。被稱為多態(tài)性的位點必須具有2個以上的等位基因。1個位點是單態(tài)的(Me-1)。5個林分各個位點的He平均值，按大小次序為Sdh-1(0.398)，Adh-1(0.251)，Mdh-1(0.238)，Mdh-2(0.223)，Got-1(0.197)，Got-2(0.126)和Me-1單態(tài)位點。He平均值在位點間變化范圍較小，說明不同位點間不存在較大的異質(zhì)性。

表5 5個油松優(yōu)良林分的等位基因頻率及期望雜合度

5個油松優(yōu)良林分的遺傳參數(shù)見表6.

表6 5個油松優(yōu)良林分的遺傳參數(shù)

由表6可見，多態(tài)位點百分率在5個油松優(yōu)良林分間相同。林分平均期望雜合度(He)代表了林分內(nèi)雜合體的比例,其在5個林分中的變化范圍為0.153～0.251，平均為0.208.等位基因平均數(shù)直觀反映了林分內(nèi)等位基因的豐富度，其變化范圍為2.00～2.43，群體間變異很小?？梢姡?個林分的3個遺傳多態(tài)參數(shù)的均值較小，說明這5個林分在研究的酶位點上，變異水平較低。

2.2.3 油松優(yōu)良林分間的遺傳分化

為確定研究的5個油松優(yōu)良林分同功酶位點上的變異總量在林分間和群體內(nèi)的分布情況，對林分變異做基因多樣度分析。遺傳分化參數(shù)見表7.

表7 遺傳分化參數(shù)

從表7中可以看出，GST值在位點間變動幅度較大，范圍為0.006 0～0.070 9.7個位點上的GST平均值為0.049 8，即林分間的變異量平均占總?cè)后w的4.98%，而大多數(shù)的變異(95.02%)存在于林分內(nèi)的個體。

2.2.4 油松優(yōu)良林分遺傳距離

為了進(jìn)一步分析油松優(yōu)良林分的相似程度，依據(jù)表5中的等位基因頻率計算林分間的遺傳距離，結(jié)果見表8.

表8 5個油松優(yōu)良林分間的遺傳距離

從表8中知，林分4與林分5遺傳距離為0.991 3，林分1與林分4和林分5的遺傳距離分別為0.986 4，0.990 5.5個林分的遺傳距離變動范圍較小，非常接近，說明這5個林分間的分化程度不高。

5個油松優(yōu)良林分遺傳距離系統(tǒng)圖見圖6.

從侯家溝、麻峪口、陳家莊、神堂溝、木口溝5個油松優(yōu)良林分的表現(xiàn)性狀和同功酶分析看出，5個油松林分間差異很小，是相對穩(wěn)定的，具遺傳穩(wěn)定性。由此也可推斷出，三道川優(yōu)良種源的性狀表現(xiàn)也具有遺傳穩(wěn)定性。然而，從遺傳距離分化看，林分間的變異量平均占總?cè)后w的4.98%，大多數(shù)的變異(95.02%)存在于林分內(nèi)的個體，說明個體差異還是很明顯的。

圖6 5個油松優(yōu)良林分遺傳距離系統(tǒng)圖

3 結(jié)論和討論

1) 通過同功酶分析油松天然優(yōu)良林分的變異與穩(wěn)定性，表明山西關(guān)帝山三道川5個油松優(yōu)良林分間同功酶差異很小，具有遺傳穩(wěn)定性。這為研究油松優(yōu)良生長性狀的穩(wěn)定性奠定了生化基礎(chǔ)。從遺傳距離分化看，林分間的變異量平均占總?cè)后w的4.98%，而大多數(shù)的變異(95.02%)存在于林分內(nèi)的個體，體現(xiàn)出個體差異還是很明顯的。

2) 建議繼續(xù)開展油松育種領(lǐng)域的研究工作，特別是對其群體、個體同功酶的研究，對油松育種體系建設(shè)和良性循環(huán)的意義重大。

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[3] 張春曉，李 悅，沈熙環(huán)，等.油松10個天然與人工群體兩個同工酶系統(tǒng)的遺傳多樣性研究//面向21世紀(jì)的中國生物多樣性保護(hù)——第三屆全國生物多樣性保護(hù)與持續(xù)利用研討會論文集.北京：中國林業(yè)出版社，1998.

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PopulationDifferentiationStudyonPinesTabulaeformisinSandaochuanofGuandiMountainBasedIsozymeAnalysisTechnique

LiBangtong

(ShanxiForestrySeedandSeedlingAdministrationCentralStation，Taiyuan030012，China)

The seed samples were taken from the naturalPinestabulaeformisforest in Sidaochuan of Guandi mountain.The main collection sites were located in Houjiagou,Mayukou,Chenjiazhuang,Shentanggou and Mukougou.The total Isozymes variation of 5 good standsPinestabulaeformisand their distribution in stands and between groups were analyzed by isozyme analysis technique which including enzyme liquid,gel preparation,electrophoresis,dyeing and other sections.Meanwhile,the genetic diversity of the stand variation was determined.The value of Glutathione S-transferase (GST) varied widely from 0.006 0 to 0.070 9,and the average value ofGSTat those 7 sites was 0.049 8.The average variation among stands was only 4.98% of the total population,while the proportion of individual variation was 95.02%.It revealed that the population differentiation was not obvious,but the individual differentiation was remarkable,which could provide scientific basis for the construction,repair and management ofPinestabulaeformisimproved variety base.

Shanxi province;Pinestabulaeformisforest; Isozyme; Value of Glutathione S-transferase

S791.254

A

1007-726X(2017)03-0014-05

2017-03-29

李幫同(1962— )，男，山西晉城人，1991年畢業(yè)于北京林業(yè)大學(xué)，高級工程師。