劉艷飛　朱元祺　鄭紅英

【摘要】 目的 探討青島市腎綜合征出血熱（HFRS）患者發(fā)熱期淋巴細(xì)胞亞群和病毒載量的變化特點(diǎn)。方法 25例HFRS發(fā)熱期患者設(shè)為HFRS發(fā)熱期組， 30例無(wú)償獻(xiàn)血者設(shè)為正常對(duì)照組。通過(guò)膠體金法檢測(cè)HFRS發(fā)熱期組的漢坦病毒免疫球蛋白M（IgM）抗體；通過(guò)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和流式細(xì)胞儀測(cè)定兩組的淋巴細(xì)胞亞群和病毒載量。結(jié)果 HFRS發(fā)熱期組血清中IgM抗體陽(yáng)性， 其病毒載量為（69.8±27.4）copies/μl。HFRS發(fā)熱期組總T細(xì)胞（CD3+）和T抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群（CD3+CD8+）百分比顯著高于正常對(duì)照組， T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群（CD3+CD4+）百分比和CD4/CD8 T細(xì)胞比值（CD4+/CD8+）及自然殺傷細(xì)胞（CD16+56+）百分比明顯低于正常對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 但B細(xì)胞（CD3-CD19+）百分比與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 總T細(xì)胞和T抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群百分比增高有利于HFRS患者早期的免疫應(yīng)答。

【關(guān)鍵詞】 腎綜合征出血熱；漢坦病毒；淋巴細(xì)胞亞群；病毒載量

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.28.008

【Abstract】 Objective To investigate the change characteristics of lymphocyte subsets and viral load in hemorrhagic fever with renal syndrome （HFRS） patients during fever period. Methods There were 25 pyretogenic stage of HFRS patients as HFRS fever group， and 30 unpaid blood donors as normal control group. The Hantaan virus immunoglobulin M （IgM） antibody was detected by colloidal gold method in the HFRS fever group. The lymphocyte subsets and viral load of the two groups were determined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） and flow cytometry. Results HFRS fever group had all positive serum IgM antibody， with viral load as （69.8±27.4） copies/μl. HFRS fever group had obviously higher percentages of total T cell （CD3+） and T suppressor / cytotoxic subpopulation （CD3+CD8+） than normal control group， and obviously lower percentages of T helper / inducer cell subsets （CD3+CD4+） and CD4/CD8T cell ratio （CD4+/CD8+） and natural killer cells （CD16+56+） than normal control group. Their difference was statistically significant （P<0.01）. But there was no statistically significant difference in percentage of B cells （CD3-CD19+） comparing with normal control group （P>0.05）. Conclusion The increase in percentage of total T cell and T inhibition / cytotoxic cell subsets is favorable for early immune response in HFRS patients.

【Key words】 Hemorrhagic fever with renal syndrome； Hantaan virus； Lymphocyte subsets； Viral load

流行性HFRS是青島市周邊區(qū)、市的地方性自然疫源性傳染病。該病由漢坦病毒引起， 病情重， 死亡率高。典型病例表現(xiàn)為發(fā)熱期、低血壓休克期、少尿期、多尿期和恢復(fù)期五期經(jīng)過(guò)[1]。據(jù)Sadeghi等[2]報(bào)道， 發(fā)熱、腰痛和頭痛是最主要癥狀， 各占85.9%、62.5%和54.7%。早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療對(duì)于患者的預(yù)后非常重要， 而發(fā)熱期又對(duì)該病的早期診斷有重要的價(jià)值。因此， 作者通過(guò)熒光定量PCR 和流式細(xì)胞儀對(duì)青島市HFRS患者發(fā)熱期淋巴細(xì)胞亞群和病毒載量進(jìn)行檢測(cè)， 以探討其變化特點(diǎn)和對(duì)臨床早期診斷的價(jià)值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2013年1月～2016年12月就診的25例HFRS發(fā)熱期患者， 將其設(shè)為HFRS發(fā)熱期組， 依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS278-2008診斷為流行性HFRS。HFRS發(fā)熱期組患者年齡10～71歲， 平均年齡（45±18）歲；其中男15 例， 女10例。選取30例無(wú)償獻(xiàn)血者設(shè)為正常對(duì)照組， 年齡12～68歲， 平均年齡（39±11）歲；其中男18例， 女12例。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。endprint

1. 2 儀器和主要試劑 羅氏公司Cobas480型PCR擴(kuò)增儀；上海之江生物有限公司提供病毒核糖核酸提取和熒光PCR擴(kuò)增試劑盒。漢坦病毒IgM和IgG抗體試劑盒由廈門波生生物技術(shù)有限公司提供。美國(guó)BECKMAN COUITER FC 500型流式細(xì)胞儀及其配套試劑。其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)廠家提供。

1. 3 漢坦病毒抗體檢測(cè)、核酸提取和病毒載量測(cè)定 采用膠體金法測(cè)定血清漢坦病毒IgM抗體， 具體操作步驟按廠家提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。病毒核糖核酸提取按照上海之江公司提供試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作， 然后保存于-80℃?zhèn)溆?。病毒載量測(cè)定根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中漢坦病毒M14627序列設(shè)計(jì)引物， 參照上海之江公司提供試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行改良。

1. 4 淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定步驟：①取4支流式檢測(cè)專用小試管， 標(biāo)號(hào)， 加抗體和樣本染色： 45-4-8-3抗體4 ?l， 3-16-56抗體8 ?l， 19-3DR抗體4 ?l和8 ?l，

4-25抗體8 ?l。②加顛倒混勻全血40 ?l， 振蕩混勻， 避光20 min。③加溶血素200 ?l， 振蕩混勻， 避光10 min。④觀察溶血情況， 溶血良好， 250 g/rpm， 離心5 min， 棄上清；加2 ml鞘液， 250 g/rpm離心5 min， 棄上清；加鞘液0.5 ml， 上機(jī)獲取。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 漢坦病毒抗體和病毒載量測(cè)定結(jié)果 HFRS發(fā)熱期組患者血清IgM抗體全部陽(yáng)性。而且經(jīng)熒光PCR擴(kuò)增， 全部為陽(yáng)性結(jié)果， 其病毒載量為（69.8±27.4）copies/μl。

2. 2 兩組淋巴細(xì)胞亞群比較 HFRS發(fā)熱期組CD3+和CD3+CD8+百分比顯著高于正常對(duì)照組， CD3+CD4+百分比和CD4+/CD8+及CD16+56+百分比明顯低于正常對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 但CD3-CD19+百分比與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

目前， 人感染HFRS病毒亞型主要是漢灘型（Hantaan virus， HTN）和漢城型（Seoul virus ， SEO）[3， 4]。我國(guó)曾把HTN 和SEO病毒稱為“野鼠型”和“家鼠型”病毒， 現(xiàn)已將“野鼠型”改為“姬鼠型”[5]。青島市流行性HFRS具有地方性特點(diǎn)， 主要分布在周圍區(qū)、市。盡管由于加強(qiáng)滅鼠和疫苗接種等預(yù)防措施以及農(nóng)村人口城市化， 使發(fā)病率下降， 但每年都有患者就診。在疾病的早期， 針對(duì)病毒的免疫應(yīng)答， 機(jī)體可產(chǎn)生IgM抗體， 并可檢測(cè)到病毒RNA。作者的研究結(jié)果顯示， 25例HFRS發(fā)熱期患者血清IgM抗體全部陽(yáng)性， 且經(jīng)熒光PCR擴(kuò)增， 也全部為陽(yáng)性結(jié)果， 其病毒載量為（69.8±27.4）copies/μl。

因此， 早期檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)， 對(duì)臨床的早期診斷具有十分重要的意義。

病毒感染后， 可引起機(jī)體的免疫應(yīng)答和釋放細(xì)胞因子， 導(dǎo)致小血管和毛細(xì)血管損害為主的病理改變[6]。本次研究結(jié)果顯示， 在HFRS患者發(fā)熱期， CD3+CD4+百分比和CD4+/CD8+低于正常對(duì)照組（P<0.01）， CD3+CD8+百分比高于正常對(duì)照組（P<0.01）， 這與溫麗麗等[7]的報(bào)道相一致。但是， CD3+百分比高于正常對(duì)照組（P<0.01）， 與溫麗麗等[7]的報(bào)道不同， 這是否與病毒感染的類型、患者的年齡、測(cè)定方法等因素有關(guān)， 需要進(jìn)一步研究。CD16+56+百分比低于正常對(duì)照組（P<0.01）， 這與邵鳳娟等[8]的報(bào)道一致， 但CD3-CD19+百分比與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。盡管不同的研究結(jié)果會(huì)有差異， 但CD3+CD4+百分比降低和CD3+CD8+百分比增高是所有報(bào)道的共同點(diǎn)， 這表明在感染的早期淋巴細(xì)胞亞群參與了機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[9， 10]。

綜上所述， 對(duì)HFRS患者發(fā)熱期病毒抗體和病毒載量進(jìn)行檢測(cè)， 對(duì)早期診斷具有價(jià)值。淋巴細(xì)胞亞群不同的變化， 提示在診治過(guò)程中對(duì)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行干預(yù)和調(diào)節(jié)， 這將有助于提高對(duì)患者的治療效果。

參考文獻(xiàn)

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[收稿日期：2017-08-08]endprint