呂鑒泉, 丁 然， 葉韻斯, 陳曉榆

(1.嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，浙江梅州 514015;2.湖北師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，湖北黃石 435002)

胰蛋白酶(Trypsin)是一種肽鏈含有233個(gè)氨基酸殘基和六對(duì)二硫鍵的絲氨酸家族蛋白酶[1]，廣泛存在于脊椎動(dòng)物、蠶等生物體的消化系統(tǒng)內(nèi)。在生命體內(nèi)，胰蛋白酶通過催化分解羧肽酶原等其他酶的前體，從而在生物體的消化、新陳代謝和生命運(yùn)轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮著十分重要的作用[2 - 3]。由于胰蛋白酶的重要生理功能，其分析檢測(cè)技術(shù)成為化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等學(xué)科中倍受關(guān)注的熱點(diǎn)[4]。對(duì)于胰蛋白酶的分析,分光光度法是常用的方法[5]。近年來，表面等離子體共振(SPR)[6]、共振光散射[7]、流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光[8]等技術(shù)也應(yīng)用于胰蛋白酶的測(cè)定。特別是基于量子點(diǎn)(QDs)[9 - 13]、共軛聚電解質(zhì)[14]等納米熒光材料與胰蛋白酶的相互作用而建立的熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法更是引人注目，其主要措施是先將納米熒光材料經(jīng)過1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的功能化處理，以方便于生物蛋白的結(jié)合[15]。

為了改善量子點(diǎn)的生物親和性和增加其多元信號(hào)，本文在水相合成核殼結(jié)構(gòu)AgInS2@ZnS QDs的基礎(chǔ)上[16]，通過Mn2+摻雜技術(shù)制備新型AgInS2∶Mn@ZnS QDs，利用胰蛋白酶能夠選擇性地猝滅AgInS2∶Mn@ZnS QDs的熒光和磷光，從而定量檢測(cè)胰蛋白酶。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光光譜儀(日本，日立公司)；U-3010型紫外分光光度計(jì)(日本，日立公司)。

胰蛋白酶購自Sigma公司,用pH=8.0的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制成濃度為1.0×10-4mol/L的貯備液,冰箱保存，用前稀釋。牛血清白蛋白(BSA)購自武漢天源生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水。

1.2 AgInS2∶Mn@ZnS QDs的合成

AgInS2∶Mn@ZnS QDs由本實(shí)驗(yàn)室在前文[16]合成AgInS2@ZnS QDs的基礎(chǔ)上增加Mn2+摻雜措施來制備，其合成路線如圖1所示。具體程序如下:(1)dBSA參照文獻(xiàn)方法[17]合成。(2)AgInS2∶Mn QDs的合成:取10 mL的蒸餾水于50 mL三頸燒瓶中，加入0.1 mL 0.2 mol/L的In(NO3)3、80 μL 0.05 mol/L的AgNO3、0.1 mL 0.2 mol/L Mn2+和1 mL dBSA溶液，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.5，加入5 mL 0.02 mol/L Na2S，于溫度95 ℃在空氣下回流攪拌5 h，得AgInS2∶Mn QDs制備液。(3)AgInS2∶Mn@ZnS QDs的合成:在AgInS2∶Mn溶液中加入0.1 mL 0.2 mol/L Zn(NO3)2，回流攪拌1.5 h，即可得AgInS2∶Mn@ZnS QDs制備液。(4)純化：量子點(diǎn)制備液用乙醇沉降、過濾、水洗滌、離心出固體，50 ℃真空干燥，即可得AgInS2∶Mn@ZnS QDs。稱取一定質(zhì)量的該量子點(diǎn)，加入適當(dāng)體積的0.01 mol/L的PBS，用水稀釋到適當(dāng)體積，作為AgInS2∶Mn@ZnS QDs實(shí)驗(yàn)溶液。

圖1 AgInS2∶Mn@ZnS QDs的合成路線Fig.1 Schematic illustration for synthesis of AgInS2∶Mn@ZnS QDs

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

熒光光譜儀的工作條件如下：工作電壓為700 V，光譜通帶寬度為10 nm，掃描速率為1 200 nm/min，測(cè)定溫度25 ℃。熒光/磷光光譜測(cè)定：取0.5 mL 2.0×10-4mol/L AgInS2∶Mn@ZnS QDs溶液于10 mL比色管中，加入2 mL PBS(0.01 mol/L)，加入適當(dāng)體積的胰蛋白酶工作溶液，混勻，水稀釋到刻度。在450 nm波長激發(fā)，在熒光光譜儀上記錄溶液的熒光/磷光發(fā)射光譜變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 量子點(diǎn)的性能

分別采用紅外(IR)光譜、X射線衍射(XRD)、掃描電鏡(STM)對(duì)合成的量子點(diǎn)進(jìn)行了表征。STM 圖顯示，AgInS2∶Mn@ZnS呈類球形顆粒分散，粒徑為9～11 nm。IR光譜圖中1 646 cm-1和1 521 cm-1峰證實(shí)dBSA基團(tuán)在AgInS2∶Mn@ZnS 的存在。AgInS2∶Mn和AgInS2∶Mn@ZnS的XRD譜峰大致相同，但經(jīng)加Zn殼后，衍射強(qiáng)度增大，說明AgInS2∶Mn@ZnS QDs有更好的晶體結(jié)構(gòu)。

圖2是AgInS2∶Mn和AgInS2∶Mn@ZnS的紫外-可見吸收、熒光和磷光光譜。由圖可見，AgInS2∶Mn在545 nm處有一熒光峰，597 nm發(fā)射磷光；AgInS2∶Mn@ZnS熒光、磷光峰分別處于560 和607 nm。參照文獻(xiàn)方法[18]，分別測(cè)定了AgInS2、AgInS2∶Mn和AgInS2∶Mn@ZnS的熒光量子產(chǎn)率，它們的熒光量子產(chǎn)率分別為11.8% 、13.3%和43.2%。結(jié)果說明，AgInS2QDs經(jīng)過Mn2+摻雜和加ZnS殼，改善AgInS2的結(jié)構(gòu)并優(yōu)化了其光學(xué)性能。

2.2 酸度對(duì)AgInS2∶Mn@ZnS熒光/磷光的影響

實(shí)驗(yàn)考察了pH值對(duì)AgInS2∶Mn@ZnS QDs熒光/磷光的影響，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，在pH=5.5～8.5范圍內(nèi)，熒光(560 nm)與磷光(607 nm)的變化趨勢(shì)基本相同，它們的強(qiáng)度在pH=8.0的溶液中達(dá)到最大。實(shí)驗(yàn)中，選取pH=8.0的PBS為測(cè)試環(huán)境。

2.3 AgInS2∶Mn@ZnS對(duì)胰蛋白酶的選擇性識(shí)別

探討了在pH=8.0的PBS中AgInS2∶Mn@ZnS QDs與等濃度的過氧化物酶(Peroxidase)、葡萄糖氧化酶(GOx)、牛血清白蛋白(BSA)、血紅蛋白(Hemoglobin)、胰蛋白酶(Trypsin)和溶菌酶(Lysozyme)等六種常見蛋白質(zhì)的相互作用(圖4)。結(jié)果表明，六種蛋白質(zhì)中只有胰蛋白酶猝滅AgInS2∶Mn@ZnS的熒(560nm)/磷光(607 nm)最為顯著，說明AgInS2∶Mn@ZnS對(duì)胰蛋白酶有特異性識(shí)別。

圖2 AgInS2∶Mn和AgInS2∶Mn@ZnS的紫外-可見吸收、熒光和磷光光譜圖Fig.2 UV-Vis(a),fluorescence(b) and phosphorescence spectra(c) of 4.0×10-4 mol/L AgInS2∶Mn(―) and 4.0×10-4 mol/L AgInS2∶Mn@ZnS(…) QDs

圖3 pH值對(duì)AgInS2∶Mn@ZnS QDs的熒光和磷光的影響Fig.3 Effect of pH on the fluorescence and phosphorescence of AgInS2∶Mn@ZnS QDs

圖4 胰蛋白酶對(duì)AgInS2∶Mn@ZnS QDs熒光和磷光的選擇性識(shí)別Fig.4 Selective recognition of AgInS2∶Mn@ZnS QDs as a fluorescent and phosphorescent probe for trypsin

2.4 胰蛋白酶的分析性能

工作中通過將不同質(zhì)量的胰蛋白酶加入到AgInS2∶Mn@ZnS溶液中，分別測(cè)定其熒光和磷光發(fā)射，來確定檢測(cè)胰蛋白酶的性能。實(shí)驗(yàn)表明，在0～20 μmol/L胰蛋白酶的存在下，隨著胰蛋白酶濃度增大，AgInS2∶Mn@ZnS的熒光峰、磷光峰波長不變，而熒光強(qiáng)度和磷光強(qiáng)度呈現(xiàn)不同程度的降低，濃度為20 μmol/L時(shí)，熒光/磷光強(qiáng)度達(dá)到最小。

圖5分別給出量子點(diǎn)溶液的熒光和磷光與胰蛋白酶濃度的線性響應(yīng)關(guān)系。在0.5～4 μmol/L胰蛋白酶范圍內(nèi)，量子點(diǎn)的熒光呈現(xiàn)線性降低，其線性回歸方程為:F0/F=1.023+0.0927c(R=0.9975)，對(duì)胰蛋白酶的檢測(cè)限為0.05 μmol/L。在0.5～3.5 μmol/L胰蛋白酶范圍內(nèi)，量子點(diǎn)的磷光呈線性降低，其線性方程為:P0/P=0.989+0.138c(R=0.9940)，對(duì)胰蛋白酶的檢測(cè)限為0.047 μmol/L。與文獻(xiàn)方法[9 - 15]比較，檢測(cè)限和線性響應(yīng)范圍基本相當(dāng)，但本文方法無需對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行功能化處理。

圖5 胰蛋白酶濃度對(duì)AgInS2∶Mn@ZnS QDs的熒光(A)和磷光(B)的影響 Fig.5 Effect of the concentration of trypsin on fluorescence(A) and phosphorescence(B) of AgInS2∶Mn@ZnS QDs

2.5 樣品分析

取5位志愿者(a患有感冒，b～e均健康)的尿液，按2010年版藥典方法[19]預(yù)處理，用本文方法測(cè)定其中胰蛋白酶含量，幾種尿液中均未檢出胰蛋白酶；加入標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，其加標(biāo)回收率為94.1%～107.2%。同時(shí)，用藥典建議的紫外-可見分光光度法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，兩者結(jié)果相符。

3 結(jié)論

利用胰蛋白酶選擇性猝滅AgInS2∶Mn@ZnS QDs的熒光/磷光，建立了測(cè)定胰蛋白酶的新方法，該方法具有儀器設(shè)備簡單、操作方便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，用于實(shí)際樣品分析的測(cè)定結(jié)果令人滿意。