張寧

?

高效液相色譜法測(cè)定雞肉中磺胺類藥物研究

張寧

（天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津300402）

建立了雞肉中磺胺類藥物殘留的高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定方法，試驗(yàn)以乙腈提取均質(zhì)后的雞肉樣品中的磺胺類藥物為測(cè)試對(duì)象，提取液用Sep-Pak氧化鋁柱凈化，采用高效液相色譜-紫外紫外檢測(cè)器，以乙腈-甲醇-水-乙酸（2∶2∶9∶0.2，v/v）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。結(jié)果表明，磺胺類藥物在0.1～5.0 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好地線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999 6，檢測(cè)限為0.05 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg?；前奉愃幬镌?.05、0.20、0.50 μg/kg濃度添加水平上，其回收率在60%～100%（=7）范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)平均偏差小于15%。本方法與傳統(tǒng)方法相比，在檢測(cè)速度和檢測(cè)定量上有很大提升。

雞肉；Sep-Pak氧化鋁柱；高效液相色譜；磺胺；殘留分析

磺胺類藥物是一類廣譜抗菌藥物，具有性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)量大、品種多樣、價(jià)格低廉、使用簡(jiǎn)便、供應(yīng)充足等優(yōu)點(diǎn)，獸醫(yī)臨床上主要用于預(yù)防和治療微生物感染，但磺胺類藥物易引起人過(guò)敏性反應(yīng)，甚至有致癌性。隨著社會(huì)的發(fā)展，廣泛使用磺胺類藥物會(huì)造成動(dòng)物性食品中藥物的殘留、污染生態(tài)環(huán)境并對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅?；前奉愃幬餁埩魡栴}越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]，是人類亟待解決的問題之一。因此，必須監(jiān)控各種動(dòng)物源性食品中該類藥物的殘留，且建立可靠的分析方法來(lái)監(jiān)測(cè)這些藥物殘留。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局關(guān)于修訂獸藥殘留檢測(cè)方法的精神，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所依據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[2]及農(nóng)業(yè)部農(nóng)發(fā)[2003] 1號(hào)關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范（試行）》通知的規(guī)定[3]及相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果編制起草了有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)對(duì)雞肉組織中磺胺的最高殘留限量進(jìn)行了規(guī)定。本研究在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，建立了一種快速檢測(cè)雞肉組織中磺胺類藥物殘留的方法，為臨床快速準(zhǔn)確測(cè)試提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嗪、磺胺喹噁啉、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺地索辛，均購(gòu)自德國(guó)Adlershof GmbH公司，純度均≥99.0%；

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）（美國(guó)Fisher公司）；無(wú)水硫酸鈉、乙酸、正己烷、正丙醇均為優(yōu)級(jí)純（天津大茂試劑公司）；純水由美國(guó)Millipore超純水儀制備。

1.1.2 試劑配制

1.1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

分別精密稱取磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶各10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后稀釋至刻度，濃度為1 mg/mL，置-20 ℃保存，有效期為6個(gè)月。

1.1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

準(zhǔn)確量取1 mL濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濃度調(diào)整為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置-20 ℃保存，有效期為1個(gè)月。

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司 Agilent1200（配紫外檢測(cè)器）；電子天平AT261型（瑞士梅特勒公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽墨-飛世爾公司）；渦動(dòng)混合儀IKA MS3 basic（瑞士萬(wàn)通公司）；振蕩器TARGIN VX-Ⅲ（安簡(jiǎn)（北京）科技有限公司）；固相萃取柱：Sep-Pak氧化鋁柱12cc（2 g），購(gòu)自Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

稱取雞肉樣品5 g（精確到0.01 g），加入乙腈25 mL，無(wú)水硫酸鈉4 g，勻漿后，以3 000 r/min的速度離心5 min。分離后的殘?jiān)偌尤?5 mL乙腈，振蕩10 min后轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，加入正己烷30 mL，振搖5 min，取下層液體，轉(zhuǎn)入250 mL雞心瓶中，加入正丙醇10 mL，在50 ℃下減壓干燥，殘留物用95％乙腈3 mL溶解，備用。

1.2.2 樣品凈化

將以上樣品過(guò)Sep-Pak氧化鋁柱（不需要控制流速）。用95％乙腈5 mL過(guò)柱，不收集，再用70％乙腈10 mL洗脫后，向洗脫液中加入5 mL正丙醇，50 ℃下減壓干燥，殘留物用1.0 mL流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.3 色譜操作參數(shù)設(shè)定

色譜柱：C18250 mm×4.6 mm（i.d），粒徑5 μm；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水-乙酸（2∶2∶9∶0.2，v/v）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30 ℃。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜分析。以各色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)，從低濃度到高濃度依次測(cè)定，每一個(gè)濃度進(jìn)樣3次，按照其所得峰面積的平均值與相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 回收率和精密度的測(cè)定

采取標(biāo)準(zhǔn)添加法，精密稱取勻漿后的雞肉組織，置于50 mL離心管中，分別添加0.05、0.20、0.50 μg/kg藥物濃度，每一種濃度5個(gè)樣品，重復(fù)3次，按照1.2.2和1.2.3項(xiàng)的方法處理后，供HPLC測(cè)定，外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

-試樣中磺胺類藥物的殘留量（μg/kg）；

-試樣溶液中對(duì)應(yīng)的磺胺類藥物的濃度（μg/mL）；

-試樣總體積（mL）；

-組織樣品的重量（kg）。

1.2.6 檢測(cè)限及定量限的測(cè)定

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行HPLC分析，并逐漸降低濃度進(jìn)樣，以溶液檢測(cè)限的信噪比（S/N）分別大于或等于3和10作為藥物的檢測(cè)限及定量限。計(jì)算藥物定量限濃度的回收率、批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，并驗(yàn)證可靠性[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件

根據(jù)優(yōu)化的色譜條件，測(cè)定雞肉組織中的磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶。結(jié)果顯示色譜峰峰形良好，峰間隔時(shí)間長(zhǎng)，能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，空白樣品在上述條件無(wú)干擾峰出現(xiàn)（圖1、圖2、圖3）。

圖1 雞肉中磺胺類藥物的對(duì)照品色譜圖

圖2 雞肉中磺胺類藥物的空白色譜圖

圖3 雞肉中磺胺類藥物添加樣品色譜圖

2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶的色譜峰面積與其相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作圖，得到系列標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），圖4顯示磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶在0.1～5.0 μg/mL的濃度之間，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 樣品的回收率及精密度

由表1看出，雞肉組織中添加濃度分別50、200、500 μg/kg時(shí)，回收率為70.3%～93.5%，批內(nèi)、批間RSD分別低于8.8%、5.1%。表明該方法可靠且重復(fù)性好。

表1 雞肉樣品中7種磺胺類藥物回收率（n=7）

2.4 靈敏度

用本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法，測(cè)定7種磺胺類藥物的檢測(cè)限和定量限，分別為0.05 μg/kg（S/N≥3）0.5 μg/kg（S/N≥10）。由表1可見，添加濃度為50 μg/kg時(shí)，該磺胺類藥物的平均回收率均大于70.3%，批內(nèi)、批間RSD分別低于8.8%、5.1%，表明該方法在定量限上可靠且靈敏度高，完全滿足雞肉組織中磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶的殘留檢測(cè)需要。

3 討論

磺胺類藥物因其具有廣譜抗菌、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于獸藥臨床和畜牧業(yè)中。針對(duì)目前動(dòng)物性食品中磺胺類藥物檢測(cè)存在樣品前處理繁瑣、檢測(cè)儀器昂貴、試劑用量大、費(fèi)用高等問題，急需建立快速簡(jiǎn)便、靈敏度高的多殘留同步確證定性定量分析方法[5-7]。

3.1 流動(dòng)相選擇

用甲醇、乙腈、冰醋酸和其他常用溶劑，采用不同比例的多溶劑體系進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，磺胺喹噁啉組分出峰慢且有拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明這些溶劑體系不適合作為流動(dòng)相?？紤]到磺胺類藥物結(jié)構(gòu)式中帶有氨基，有弱堿性，其中性分子和離子形式的分配性質(zhì)在有機(jī)相和水相中有所不同，因此，在反相液色譜條件下，以含水相作為流動(dòng)相，調(diào)節(jié)含水相的pH值，抑制弱堿的解離，進(jìn)而改變保留行為。弱堿的保留性隨著含水流動(dòng)相pH值的降低而減少。本研究考慮添加1.5%乙酸作為流動(dòng)相，改善磺胺喹噁啉保留值和色譜峰形。選用甲醇增加流動(dòng)相強(qiáng)度，以甲醇-15%乙酸進(jìn)行不同比例洗脫試驗(yàn)，最終選擇乙腈-甲醇-水-乙酸的配比為2∶2∶9∶0.2。

3.2 提取溶劑的選擇

雞肉組織中磺胺類藥物殘留檢測(cè)常用的溶劑有乙腈、乙酸乙酯。用乙酸乙酯提取時(shí)因其沸點(diǎn)較高，磺胺類藥物又耐熱性較差，因此，濃縮溫度不宜過(guò)高。由于浸出的雜質(zhì)也較多，過(guò)Sep-Pak氧化鋁固相萃取柱后仍有基質(zhì)干擾。

結(jié)合試驗(yàn)，選擇用乙腈能除去雞肉組織中的脂類物質(zhì)，再加入正己烷，由于乙腈與正己烷之間能實(shí)現(xiàn)液-液分層，將底層轉(zhuǎn)入至250 mL雞心瓶中，為防止50 ℃下減壓干燥時(shí)爆沸，加入5 mL正丙醇，殘留物用95％乙腈3 mL溶解，最后用1.0 mL流動(dòng)相定容殘?jiān)?。該方法浸出的雜質(zhì)少且容易排除基質(zhì)干擾，效果理想。

3.3 固相萃取柱的選擇

單純的液-液萃取很難排除色譜分析時(shí)的基質(zhì)干擾，經(jīng)過(guò)大量篩選，最后選用Sep-Pak氧化鋁萃取柱（二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物）進(jìn)行試驗(yàn)，凈化效果理想，除雜效果好，回收率高且重現(xiàn)性好。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

磺胺類藥物有較強(qiáng)的紫外吸收，本研究綜合考慮7種磺胺類藥物的紫外吸收光波長(zhǎng)，選擇最佳波長(zhǎng)為270 nm。

4 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜測(cè)定雞肉中磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶藥物殘留的方法，用液-液萃取的經(jīng)典方法結(jié)合固相萃取，建立了合適的樣品提取、凈化、濃縮的前處理方法，并優(yōu)化了高效液相色譜條件，可同時(shí)測(cè)定雞肉中上述7種磺胺類藥物殘留，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于該類獸藥的殘留監(jiān)控。

[1] 特奈普西得.動(dòng)物源性食品中藥物殘留分析方法[M]. 于競(jìng)，王進(jìn)喜，等譯. 天津：科技翻譯出版公司，1991.

[2] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S/OL]. 2002：21[2016-07-01]. http://www.moa.gov. cn/zwllm/tzgg/gg/200302/t20030226_59300.htm.

[3] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留檢測(cè)試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范（試行）》的通知[S/OL]. 2003：2-4[2016-07- 01]. http://www.moa.gov. cn/sjzz/syj/dongtai/201006/t20100 606_1535497.htm.

[4] 李俊鎖，邱月明，王超. 獸藥殘留分析[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[5] 趙旭壯，李明元. 動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2012，24（3）：92-96.

[6] 王小柱. 雞肉組織中磺胺氯達(dá)嗓鈉的高效液相色譜法檢測(cè)[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016（2）：10-14.

[7] 張?bào)闫G，方素棟，魏晉梅. 牛肉中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)分析[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2016，36（3）：34-37.

責(zé)任編輯：張愛婷

Determination of Sulfonamides Residue in Chicken by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Ning

（Tianjin Veterinary Drugs and Feed Control Ministry, Tianjin 300402, China）

High performance liquid chromatography（HPLC）method was developed for the determination of sulfonamides residue in chicken, the chicken samples extracted with acetonitrile after homogenization, extracts were purified by Sep-Pak alumina column, determined by HPLC and ultraviolet UV detector, with acetonitrile methanol-water-acetic acid（2∶2∶9∶0.2, v/v）as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 270 nm.The results showed that the peak area and concentration of the drug in the range of 0.1 to 5.0 mu g/mL, the correlation coefficient was greater than 0.999 6, the detection limit was 0.05 μg/kg, and the limit of quantification was 0.5 μg/kg. Among the 0.05, 0.20 and 0.50 μg/kg concentrations, the recovery was in the range of 60%～100%（=7）, and the relative standard deviation of the relative standard deviation was less than 15%. Compared with the traditional method, this method has a great improvement in detection speed and quantity.

chicken; Sep-Pak alumina column; high performance liquid chromatography; sulfonamides; residue

1008-5394（2017）01-0034-04

P641.131；S152.72

A

2016-07-01

張寧（1959-），男，吉林長(zhǎng)春人，高級(jí)獸醫(yī)師，本科，主要從事獸藥殘留方面的研究。E-mail：zhangning_1959@163.com。