王昌釗，付騁宇 編譯

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介離子殺蟲劑：調(diào)節(jié)煙堿乙酰膽堿受體的新穎類別殺蟲劑

王昌釗，付騁宇 編譯

(陜西出入境檢驗檢疫局，西安 710068)

到2050年世界人口將達到90億，估計糧食生產(chǎn)需要增加60%才能滿足需求。糧食生產(chǎn)增加的很大部分需要使用安全有效的殺蟲劑來減少害蟲造成的損失來保證。而面臨的挑戰(zhàn)就是現(xiàn)有殺蟲劑抗性的不斷發(fā)展，這就需要開發(fā)新類別的殺蟲劑。開發(fā)能夠防治抗性害蟲的新化學(xué)類別的殺蟲劑將會對農(nóng)業(yè)和世界食品安全做出重要貢獻。

之前介離子化合物還沒有被開發(fā)用于農(nóng)業(yè)，因此是農(nóng)藥領(lǐng)域中全新的化學(xué)類別。本文介紹了triflumezopyrim(1) (DuPontTMPyraxaltTM)和dicloromezotiaz(2) (圖1)的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化，這2個物質(zhì)作用于昆蟲的煙堿乙酰膽堿受體而具有殺蟲活性。

圖1 triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz (2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

自煙堿被使用后，乙酰膽堿受體就一直為殺蟲劑防治害蟲的重要神經(jīng)元靶標(biāo)。近年，新煙堿類殺蟲劑是高效的昆蟲控制劑。煙堿和新煙堿與內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿結(jié)合于同一位點，被稱為煙堿乙酰膽堿受體的正構(gòu)位點。新煙堿類殺蟲劑的第一個產(chǎn)品吡蟲啉在1991年引入。目前此類殺蟲劑有許多產(chǎn)品上市，其市場銷售額約占?xì)⑾x劑的25%。Bass等人介紹此類產(chǎn)品在稻飛虱殺蟲劑市場中占有重要位置，以及此害蟲對此類產(chǎn)品的抗性情況，其抗性在亞洲廣泛存在。

Triflumezopyrim(1)有望成為防治亞洲水稻飛虱敏感和抗性品系的有效工具。Diclorome-zotiaz(2)有可能成為防治鱗翅目害蟲的藥劑，特別是考慮到結(jié)合于煙堿乙酰膽堿受體正構(gòu)位點的殺蟲劑未被充分用于防治鱗翅目害蟲。

介離子殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)起源于一個殺菌劑被優(yōu)化為丙氧喹啉(proquinazid)過程中的副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物沒有殺菌活性，故在當(dāng)時未被繼續(xù)研究。然而，后來發(fā)現(xiàn)其中一個副產(chǎn)物，即化合物3有殺蟲活性(表1)，故進行了優(yōu)化，下文對此作了介紹。

介離子化合物較罕見，還沒有開發(fā)用于作物保護。在此對其進行了定義，即介離子為五或六元雜環(huán)偶極化合物，在不進行電荷分離的情況下無法用傳統(tǒng)的價鍵結(jié)合形式繪制其結(jié)構(gòu)，也不能以單個典型結(jié)構(gòu)表示。圖2列出了triflumezopyrim(1)負(fù)離子的互變異構(gòu)體為例。這些化合物被認(rèn)為是非苯系芳族物。本文討論的介離子化合物為pyrimidinium olate類。本文討論了介離子殺蟲劑的合成、優(yōu)化和作用機制。

圖2 triflumezopyrim(1)負(fù)離子互變異構(gòu)體

1 材料和方法

1.1 一般合成方法

用標(biāo)準(zhǔn)光譜方法表征所有新化合物。氫核磁共振儀：Varian INOVA 400 MHz核磁共振系統(tǒng)，Nalorac間接檢測探頭(indirect detection probe)；或BrukerAance III 500 MHz 核磁共振系統(tǒng)，BBFOPLUS間接檢測探頭(indirect detection probe)；以氘代溶劑和四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)。化學(xué)位移在低場(標(biāo)準(zhǔn)TMS, d=0.00)，單位ppm。所有反應(yīng)在無水、惰性氣體(氮氣或氬氣)、干溶劑條件下進行。

表1 介離子結(jié)構(gòu)

1.2 目標(biāo)化合物的合成

在惰性溶劑中，在加熱條件下2-氨基吡啶取代物和丙二酸發(fā)生反應(yīng)，較方便地制得六元介離子物，此合成方法見圖3。一般可通過典型的Claisen縮合反應(yīng)丙二酸酯芳基化或苯乙酸衍生物的酰化制備丙二酸(圖4)。丙二酸二烷基酯堿解，再制備?；?，二者與2,4,6-三氯苯酚反應(yīng)制得2,4,6-三氯苯酯。碘苯基或溴苯基丙二酸的Suzuki芳基化，或碘苯基或溴苯基乙酸的Suzuki芳基化制取聯(lián)芳化合物，其再發(fā)生?；纬陕?lián)苯丙二酸。2-氨基吡啶發(fā)生還原胺化反應(yīng)，或2-鹵代吡啶發(fā)生取代鹵反應(yīng)，或鹵甲基芐基雜環(huán)發(fā)生取代鹵反應(yīng)生成2-氨基吡啶衍生物(圖5)。2-嘧啶甲醛發(fā)生還原胺化反應(yīng)生成嘧啶甲基胺。

1.2.1 氨基吡啶中間體的制備

1.2.1.1-[(2-氯噻唑-5-基)甲基]-3-甲基吡啶-2-胺

在試管中加入-甲基吡咯烷酮(10 mL)、2-氨基-3-甲基吡啶(2.16 g，20 mmol)和2-氯-5-氯甲基噻唑(1.68 g，10 mmol)，封口。用Biotage微波系統(tǒng)加熱，在220 ℃反應(yīng)10 min。然后把反應(yīng)液倒入100 mL的飽和NaHCO3水溶液中，分別用50 mL乙酸乙酯萃取3次。干燥(Na2SO4)、濃縮有機相，用硅膠柱對殘留物進行色譜分離(乙酸乙酯︰正己烷=1︰9)得到目標(biāo)化合物。1H NMR (CDCl3)δ8.07 (d,1H),7.43 (s,1H),7.26 (d,1H), 6.63 (dd,1H), 4.77 (d,2H), 4,54 (br,s,1H)。

圖3 環(huán)化反應(yīng)

圖4 丙二酸制備路線

圖5 氨基吡啶的制備路線

1.2.1.2-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]吡啶-2-胺

在試管中加入-甲基吡咯烷酮(10 mL)、2-氟吡啶(1.47 g，15 mmol)和5-氨基甲基吡啶(1.4 g，10 mmol)，封口。用Biotage微波系統(tǒng)加熱，在200 ℃反應(yīng)30 min。然后把反應(yīng)液倒入100 mL的飽和NaHCO3水溶液中，分別用50 mL乙酸乙酯萃取3次。干燥(Na2SO4)、濃縮有機相，用硅膠柱對殘留物進行色譜分離(乙酸乙酯︰正己烷=1︰9)得到目標(biāo)化合物。1H NMR (CDCl3)δ8.37 (s,1H), 8.07 (d,1H),7.66 (d,1H), 7.42 (t,1H), 7.26 (d,1H), 6.92(t,1H),6.40 (d,1H), 5.20 (br,s,1H), 4.55 (d,2H)。

1.2.2-(嘧啶-5-基甲基)吡啶-2-胺

1.2.2.1 反應(yīng)步驟A：制備-(5-嘧啶亞甲基)-2-吡啶胺

把2-氨基吡啶(11.31 g，120.3 mmol)和吡啶-5-甲醛(14.0 g，129.6 mmol)的氯仿(300 mL)溶液在室溫攪拌反應(yīng)15 min。減壓去除易揮發(fā)物質(zhì)(75 ℃，1 h)，得到黃色固體。溶解此物體，攪拌，去除揮發(fā)物質(zhì)，如此重復(fù)處理2次以上。最后得到的黃色固體在80 ℃真空條件下過夜干燥，得到22.09 g(99.8%)的目標(biāo)化合物。1H NMR (CDCl3)δ 9.26-9.32 (m,4H), 8.52 (d,1H),7.82 (t,1H),7.42 (d,1H), 7.26 (t,1H)。

1.2.2.2 反應(yīng)步驟B：-(嘧啶-5-基甲基)吡啶-2-胺的合成

把98%的硼氫化鈉粉末(2.87 g，75.5 mmol)加入甲醇(80 mL)和四氫呋喃(400 mL)溶液中，用力攪拌5 min。把反應(yīng)步驟A的產(chǎn)物(13.9 g，75.5 mmol)溶解于400 mL的四氫呋喃中，把所得溶液點滴加入硼氫化鈉懸浮液中。攪拌直到起始反應(yīng)物質(zhì)消失。再加入乙酸(2 mL)，攪拌反應(yīng)5 min。加入乙酸(2 mL)、水(30 mL)和乙酸乙酯(500 mL)，用1 N氫氧化鈉水溶液(300 mL)沖洗反應(yīng)混合物，干燥(MgSO4)，過濾，減壓去除溶劑。把得到的油狀物溶解于二氯甲烷(50 mL)中，通過硅膠(100 g)塞用乙酸乙酯(3L)洗提。減壓濃縮洗提液得到油狀物，緩慢結(jié)晶得到8.91 g (63.4%)淺黃色固體目標(biāo)化合物。1H NMR (CDCl3)δ 9.12(s,1H), 8.76 (s,2H), 8.10 (d,1H), 7.42 (t,1H), 6.64 (t,1H), 6.42 (d,1H), 4.99(br s,1H), 4.61 (d,2H)。

1.2.3 苯丙二酸中間體的制備

1.2.3.1 雙(2,4,6-三氯苯基)2-[3-(三氟甲基)苯基]丙二酸的制備

步驟A：2-[3-(三氟甲基)苯基]丙二酸二乙酯的合成

用氮氣凈化二氧六環(huán)(100 mL)10 min，然后加入1,10-鄰二氮雜菲(1.0 g)和碘化亞銅(1.0 g)。在氮氣保護下攪拌懸浮液5 min，加入碳酸銫(18.72 g，57.45 mmol)、丙二酸二甲酯(5.46 g，50.6 mmol)和1-碘-3-(三氟甲基)苯(12.5 g，46.0 mmol)。加熱回流18 h，冷卻到室溫，用1 N HCl水溶液淬滅反應(yīng)。分離有機層和水層。用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取水層，合并有機相，干燥(MgSO4)，過濾，用Celite?濃縮，以100%正己烷-25%乙酸乙酯的正己烷梯度溶液洗脫，用硅膠色譜純化得到7.36 g(58.0%)的目標(biāo)產(chǎn)物。1H NMR (CDCl3)δ 7.59-7.65(m,3H),7.49 (t,1H),4.70 (s,1H), 3.76(s, 6H)。

反應(yīng)步驟B：雙(2,4,6-三氯苯基)2-[3-(三氟甲基)苯基丙二酸的制備

把反應(yīng)步驟A所得產(chǎn)物加入NaOH(25 g)水(75 mL)溶液中，60 ℃氮氣保護下用力攪拌反應(yīng)液8 min。然后把反應(yīng)液加入冰(100 g)中，用6 N HCl水溶液把pH調(diào)至1，用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取。合并有機萃取物，干燥(MgSO4)，過濾，減壓濃縮。把二氯甲烷(200 mL)加入所得白色固體中，再加入草酰氯(5 mL)和,-二甲基甲酰胺(0.5 mL)。在室溫攪拌反應(yīng)液2 h，加入2,4,6-三氯苯酚(10.528 g，53.32 mmol)。室溫攪拌過夜，減壓濃縮。在殘留物中加入甲醇，慢慢析出固體。過濾得到8.161 g(50.43%)固體目標(biāo)化合物。1H NMR (CDCl3)δ 7.91(s,1H),7.83(d,1H),7.70 (d,1H),7.59 (t,1H), 7.37 (s,4H),5.38 (s,1H)。

1.2.4 雙(2,4,6-三氯苯基)2-(3,5-二氯苯基)丙二酸的制備

1.2.4.1 步驟A：2-(3,5-二氯苯基)丙二酸二乙酯的制備

把碳酸銫(3.6 g，11 mmol)、1,10-鄰二氮雜菲(198g，1.1 mmol)和Cul(209 mg，1.1 mmol)加入二氧六環(huán)(29 mL)中，在氮的保護下攪拌15 min，再加入3,5-二氯碘苯(3.0 g，11 mmol)和丙二酸二乙酯(1.66 mL，1.75 g，11 mmol)。把反應(yīng)系統(tǒng)抽成真空，在攪拌回流條件下用氮凈化過夜。冷卻反應(yīng)混合液，加入1 N HCl。用乙酸乙酯萃取3次，合并有機層并干燥(MgSO4)，濃縮，用硅膠色譜純化，得到2.56 g純的目標(biāo)化合物。1H NMR (CDCl3)δ 7.31-7.34(m,3H),4.54(s,1H),4.23 (q,4H),1.28 (t,6H)。

1.2.4.2 步驟B：雙(2,4,6-三氯苯基)2-(3,5-二氯苯基)丙二酸的制備

把2-(3,5-二氯苯基)丙二酸二乙酯(305 g，1 mmol)加入5 mL 20%氫氧化鈉水溶液中，在70 ℃攪拌30 min，冷卻，用6 N HCl中和。用乙酸乙酯萃取，干燥萃取液(Na2SO4)，濃縮，得到210 mg的二酸。在二氯甲烷(2 mL)中加入草酰氯(0.17 mL，0.26g，2.0 mmol)和一滴DMF，攪拌下再加入所得二酸。繼續(xù)攪拌1 h，加入2,4,6-三氯苯酚(394 mg，2 mmol)，攪拌過夜。濃縮，得到所需的二酯和2,4,6-三氯苯酚混合液，用于下一步反應(yīng)。

1.2.5 2-[3-(5-氯-2-氟-苯基)苯基]丙二酸二乙酯的制備

1.2.5.1 步驟A：2-[3-(5-氯-2-氟-苯基)苯基]乙酸乙酯的制備

把3-碘苯乙酸乙酯(1.45 g，5 mmol)、5-氯-2-氟苯硼酸(1.04 g，6 mmol)、PdCl2(PPH3)2(175 mg，0.25 mmol)和3 mL 2N Na2CO3水溶液加入6 mL二氧六環(huán)中，溶解，用Biotage微波系統(tǒng)加熱到160 ℃并維持5 min。反應(yīng)混合液分散為水和乙酸乙酯相，并分離，用乙酸乙酯萃取水相，合并有機相，干燥(Na2SO4)，硅膠色譜(乙酸乙酯︰正己烷=1︰9)純化，得到1.0 g無色油狀物。1H NMR (CDCl3)δ 7.39-7.45(m, 4H), 7.32(m, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.08 (dd, 1H), 4.17(q, 2H), 3.67(s，2H), 1.26(t,3H)。

1.2.5.2 步驟B：制備2-[3-(5-氯-2-氟-苯基)苯基]丙二酸二乙酯

把步驟A產(chǎn)物(1.0 g，3.4 mmol)溶解于10 mL的碳酸二乙酯中，再加入氰化鈉(544 mg的60%(質(zhì)量比)礦物油，13.6 mmol)。在常溫攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取。干燥有機層(Na2SO4)，蒸發(fā)產(chǎn)生1.2 g灰色油狀目標(biāo)化合物。1H NMR (CDCl3)δ 7.56(s,1H), 7.48(m,1H), 7.40-7.46 (m, 3H), 7.25-7.28(m, 1H), 7.09(dd, 1H), 4.67(s，1H), 4.19(q,4H), 1.31(t,6H)。

1.2.6 介離子殺蟲劑的制備

1.2.6.1 化合物1的制備：(4-oxo-(pyrimidin-5-ylmethyl)-3- [3-(trifluoromethyl)phenyl]pyrido[1,2-a]pyrimidin-1-ium-2-olate

在雙(2,4,6-三氯苯酚)2-[3-(三氟甲基)苯基]丙二酸(8.16 g，13.4 mmol)的甲苯(100 mL)溶液中加入-(嘧啶-5-基甲基)吡啶-2-胺(3.31 g，17.8 mmol)。加熱到110 ℃，維持6 h，用Celite?濃縮，以100%乙酸乙酯-20%甲醇的乙酸乙酯的梯度溶液洗脫，用硅膠色譜純化得到7.36 g(58.0%)的目標(biāo)產(chǎn)物。

1.2.6.2 化合物2的制備：1-[(2-chlorothiazol-5-yl) methyl]- 3-(3,5-dichlorophenyl)-9-methyl-4-oxo-pyrido[1,2-a]pyrimidin-1-ium-2-olate

在1 mL甲苯中加入-[(2-氯噻唑-5-基)甲基]-3-甲基–吡啶-2-胺(100 mg，0.4 mmol)和雙(2,4,6-三氯苯基)2-(3,5-二氯苯基)丙二酸(300 mg，含有一些2,4,6-三氯苯酚)，加熱到70 ℃，維持2 h。用Celite?濃縮，用硅膠色譜(50%~100%乙酸乙酯正己烷溶液)分離得到25 mg黃色固體目標(biāo)產(chǎn)物。

1.2.6.3 化合物23的制備：3-[3-(5-chloro-2-fluoro-phenyl) phenyl]-1-[(2-dichlorothiazol-5-yl)methyl]-4-oxo-pyrido[1,2-za]pyrimidin-1-ium-2-olate

把2-[3-(5-氯-2-氟苯基)苯基]丙二酸二乙酯(1.2 g，3.3 mmol)加入10 mL的NaOH(20%)水溶液中，攪拌加熱10 min。冷卻，用6 N HCl淬滅反應(yīng)，且把pH調(diào)至2，然后用乙酸乙酯萃取。用鹽水洗滌有機層，干燥(Na2SO4)，濃縮得到0.8 g白色固體，立即用于以下反應(yīng)。

把2-[3-(5-氯-2-氟苯基)苯基丙二酸(200 mg，0.65 mmol)溶解于3 mL二氯甲烷中，然后加入草酰氯(0.3 mL，0.45 g，3.5 mmol)和一滴DMF。在常溫攪拌反應(yīng)30 min，濃縮。把濃縮物溶解于3 mL的二氯甲烷中，冰浴冷卻。然后加入-[(2-氯噻唑-5-基)甲基]吡啶-2-胺(100 mg，0.44 mmol)和三乙胺(0.3 mL，0.4 g，0.4 mmol)。在冰浴中攪拌反應(yīng)15 min，用Celite?濃縮，色譜(50%~100%乙酸乙酯正己烷溶液)純化得到110 mg目標(biāo)產(chǎn)物。

1.3 殺蟲劑的測試

1.3.1 制劑和噴霧方法

在測試化合物中加入10%丙酮、90%水和300 mg/L X-77?Spreader L0-Foam Formula非離子表面活性劑，此表面活性劑含有烷基芳基聚氧乙烯、游離脂肪酸、乙二醇和異丙醇。噴霧器在受試對象上方1.27 cm處噴施1 mL的測試化合物溶液。稻飛虱用藥量為50、10、0.4 mg/L，噴霧后干燥2 h；其他受藥對象的用藥量為250、50、10、2、0.4 mg/L，藥后干燥1 h。每個處理重復(fù)3次。

1.3.2 鱗翅目害蟲

評估化合物對小菜蛾()和草地貪夜蛾()的活性試驗中，每個小的開放容器中種植一株植物，在一株12~14d的芥子植物或4~5 d的玉米上接種約50頭剛孵化小菜蛾幼蟲或10~15頭孵化1 d的草地貪夜蛾幼蟲后，噴測試化合物藥液。在25 ℃，相對濕度70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。用肉眼評估植物被取食情況，確定防效≥90%的濃度(LC90)。

1.3.3 飛虱

評估化合物對玉米花翅飛虱()和馬鈴薯小綠葉蟬()的活性試驗中，每個小的開放容器中種植有一株3~4 d的玉米或5 d的Soleil豆(長出主要的葉)，在土壤上面添加白沙，在噴霧之前切除一片主要的葉子。噴霧后，每株植物上接種15~20頭玉米花翅飛風(fēng)若蟲(18~21 d)或5頭馬鈴薯小綠葉蟬成蟲(18~21 d)。在植株上面罩一黑色屏蔽蓋，在培養(yǎng)箱(22~24 ℃，相對濕度50%~70%)培養(yǎng)6 d。肉眼評估昆蟲死亡情況。

評估化合物對二點黑尾葉蟬()和褐飛虱()的活性試驗中，在一個塑料盆中種有一株13 cm的水稻植株，用鋼絲網(wǎng)罩住(50目)。噴霧后，干燥2 h，接種10頭二點黑尾葉蟬(3齡若蟲，孵化后7~9 d)。5 d后肉眼評估防治情況，確定防效≥90%的濃度(LC50)。

1.3.4 蚜蟲

評估化合物對桃蚜()和棉蚜()的活性試驗中，每個小的開放容器中種植一株植物，在一株12~15d的蘿卜或6~7d的棉花上放置一片有30~40頭蚜蟲的葉片接種。接種后，在培養(yǎng)土壤上覆蓋一層沙子。在植株上面罩一黑色屏蔽蓋。在19~21 ℃，相對濕度50%~70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。用肉眼評估防治情況，確定防效≥90%的濃度(LC90)。

1.4 蜚蠊注射研究

在美國蜚蠊()的成雄蟲節(jié)間膜注射不同濃度的試驗化合物的DMSO溶液(2μL)，48 h內(nèi)觀察中毒癥狀和死亡情況。

1.5 對昆蟲神經(jīng)元的電壓鉗位的研究

在含有150 mM NaCl、3 mM KCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.2的解剖液中對蜚蠊成蟲或煙蚜夜蛾()幼蟲的胸神經(jīng)節(jié)機械脫髓鞘。在膠原酶(Sigma-Aldrich C2674, 0.5 mg/mL)+玻黏胺糖酸酶(Sigma-Aldrich H3506, 1.0 mg/mL)或膠原酶(Sigma-Aldrich C2674, 0.125 mg/mL)+分散酶(Sigma-Aldrich D4818，0.5 mg/mL)中27 ℃培養(yǎng)神經(jīng)節(jié)30 min。然后在解剖液中加入10%胎牛血清、5 mM CaCl2、100單位/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素，把神經(jīng)節(jié)移入其中，研磨至細(xì)胞分離。把細(xì)胞置于用伴刀豆球蛋白A(400 μg/mL)/層粘連蛋白(4 μg/mL)處理的蓋玻片上，培養(yǎng)2~3 d后試驗。

用內(nèi)充3 M的KCl的微電極刺穿神經(jīng)元，鉗制電位為－60mV(美國蜚蠊)或－70mV(煙蚜夜蛾)，采樣頻率15 kHz，用不連續(xù)單電極電壓鉗測定。用PClamp8或PClamp10軟件(Molecular Devices)處理數(shù)據(jù)。在解剖生理鹽水中加入CaCl2(5 mM)和用于阻斷毒蕈堿乙酰膽堿受體電流的阿托品(1 μM)，得到記錄溶液(recording solution)。用固定于神經(jīng)節(jié)0.8 mm內(nèi)的灌流管連續(xù)不斷灌流記錄溶液或測試化合物(溶于記錄溶液)(1.1~1.5 mL/min)于神經(jīng)節(jié)。每個處理重復(fù)3次。

所有介離子化合物都是本研究合成，吡蟲啉和啶蟲脒購自Chem Service，其他所有藥物購自Digma-Aldrich。

2 結(jié)果和討論

2.1 殺蟲活性

所討論的介離子化合物都列于表1，表2為其殺蟲活性。

已有文獻報道了介離子殺蟲劑的早期優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了R3為氯吡啶甲基、氯噻唑甲基或嘧啶甲基的高活性化合物。最初評估這些化合物對鱗翅目害蟲小菜蛾和半翅目害蟲玉米花翅飛風(fēng)的殺蟲活性，發(fā)現(xiàn)化合物3使用濃度為50 mg/L時防效≥90%。在優(yōu)化過程中，R3從正丙基變?yōu)镃H3CF3、相關(guān)鹵代烷基和隨后的氯吡啶甲基化合物4和6。這些修飾使化合物對小菜蛾和另一鱗翅目害蟲草地貪夜蛾的活性增加；對玉米花翅飛風(fēng)和另一半翅目害蟲馬鈴薯小綠葉蟬的活性也顯著增加。進一步評估發(fā)現(xiàn)化合物4對重要水稻害蟲褐飛虱和二點黑尾葉蟬有中等活性。氯噻唑甲基化合物7和9對小菜蛾和草地貪夜蛾，以及玉米花翅飛風(fēng)和馬鈴薯小綠葉蟬的活性進一步提高，然而對水稻害蟲褐飛虱和二點黑尾葉蟬活性沒變。

至此，把優(yōu)化目標(biāo)分為2個方向，一為提高對水稻飛虱的活性，一為提高對鱗翅目害蟲的活性。

對飛虱活性提高的優(yōu)化集中于對雜環(huán)甲基即R3取代，發(fā)現(xiàn)了5-嘧啶甲基取代物triflumezopyrim(1)。研究了多種五元和六元芳香和非芳香雜環(huán)物，發(fā)現(xiàn)未取代的嘧啶比2-氯嘧啶甲基或2-甲基嘧啶甲基物活性更高，特別是對褐飛虱和二點黑尾葉蟬，如triflumezopyrim(1)和12比化合物13(甲基)或11和14(氯代)更高?？紤]到已有報道介離子殺蟲劑與新煙堿結(jié)合于煙堿乙酰膽堿受體的同一位點，此結(jié)果就有點奇怪，因為除呋蟲胺以外所有的商業(yè)新煙堿都有一個芳香雜環(huán)甲基團不是被氯吡啶甲基取代就是被氯噻唑甲基取代。

注：a：DBM：小菜蛾；FAW：草地貪夜蛾；CMA：棉蚜GPA：桃蚜；CPH：玉米花翅飛虱；PLH：馬鈴薯小綠葉蟬；BPH：褐飛虱；GLH：二點黑尾葉蟬。b：1995－1997年敏感種群數(shù)據(jù)。

在對許多類似物進行廣泛的實驗室和田間試驗后，選擇triflumezopyrim(1)作為優(yōu)異的水稻殺蟲劑進行開發(fā)。

R3為氯噻唑甲基被證實比其他取代化合物的活性更廣譜。所以優(yōu)化對鱗翅目害蟲的活性集中在對R1和R2的取代。通過多種取代研究，發(fā)現(xiàn)間位取代殺蟲活性最好，所以進一步研究了3-取代和3，5-二取代類似物。

化合物8，9和15－17就是R3為氯噻唑甲基基團的3-單取代類似物。一般，鹵代(halo)和擬鹵代(pseudo-halo)類似物對小菜蛾和草地貪夜蛾的活性非常好到優(yōu)異，溴類似物9濃度為0.4 mg/L時在篩選試驗中防效>80%。供電子甲氧基類似物17對鱗翅目害蟲的活性沒有化合物8、9和16高，但對受試的半翅目害蟲的活性顯著高。

Dicloromezotiaz(2)和18－20是R3為氯噻唑甲基基團的3,5-二取代類似物?；衔?8具有供電子集團(甲基和甲氧基)，和單取代類似物17的情況一樣，與鹵代和擬鹵代取代物相比，對半翅目害蟲的活性稍有提高，而對鱗翅目害蟲的活性稍有下降。此類中鹵代和擬鹵代取代物對鱗翅目具有好到優(yōu)異的活性，對半翅目害蟲的活性變化大。應(yīng)該指出的是dicloromezotiaz(2)在核環(huán)9位有一甲基取代。其取代和作用將在以下討論。

在對R1和R2進行多種取代研究時，在環(huán)的不同位置進行了各種芳基和雜芳基取代。和小基團取代情況一樣，3-位取代最有利于提高對鱗翅目害蟲的活性，化合物21－23就是例證，它們對小菜蛾和草地貪夜蛾的室內(nèi)活性最高。

對于大多數(shù)討論的化合物，核左環(huán)的取代基R4為氫。在優(yōu)化的早期，在氮(R3)上沒有鏈接最佳取代基時，對R4進行了各種取代研究。在所有位置進行的各種取代都沒有提高化合物的活性。在R3確定為氯噻唑甲基后，再對R4取代進行了研究，發(fā)現(xiàn)R4為9-甲基(與碳環(huán)鏈接相毗鄰)時對鱗翅目害蟲的活性顯著提高。如dicloromezotiaz(2)具有9-甲基，化合物20為9-H，對任一受試?yán)ハxdicloromezotiaz(2)的活性要高于化合物20。

2.2 殺蟲劑作用機制

對介離子核9-碳位為氫(9-H)的介離子殺蟲劑化合物[包括triflumezopyrim(1)]的作用機制研究表明這些殺蟲劑對煙堿乙酰膽堿受體具有獨特的生理作用，即作用于煙堿乙酰膽堿的正構(gòu)位點。中毒癥狀為昆蟲不活躍，蜚蠊被注射藥液后15~30 min逐漸對刺激沒有反應(yīng)，用探針觸碰時，足和軀體的反應(yīng)極慢。沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)興奮癥狀，如足過度伸展、腹部蜷曲、震顫或抽搐。與triflumezopyrim(1)形成對比的是給蜚蠊注射9-碳位為甲基(9-CH3)的介離子化合物后，蜚蠊呈現(xiàn)中等程度的神經(jīng)興奮癥狀。注射dicloromezotiaz(2) (≧6 ng/g體重，每劑量5頭蟲)1 h內(nèi)，用探針觸碰時蜚蠊足過度伸長，興奮度增加。隨著時間增加，軀體先輕度震顫，然后動作不協(xié)調(diào)，不能動。此癥狀表明dicloromezotiaz使煙堿乙酰膽堿受體興奮而不是抑制。

分離的煙蚜夜蛾胸神經(jīng)元的全細(xì)胞電壓鉗研究表明triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz (2)在分別以100、10 μM [dicloromezotiaz(2)水溶解極限]標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用期間(10 s)都沒有顯著激發(fā)煙堿乙酰膽堿受體介導(dǎo)的電流(圖6a和6b)。這與啶蟲脒對鱗翅目的煙堿乙酰膽堿受體激活作用形成對比(圖6c)。有趣的是，雖然暴露于triflumezopyrim(1)后乙酰膽堿誘發(fā)的電流能夠恢復(fù)，但短時間暴露于dicloromezotiaz(2)后，盡管延遲生理鹽水沖洗時間(＞40 min)，誘發(fā)電流恢復(fù)程度極小(圖6b)。

注：所有處理中，100 μM乙酰膽堿(10 s)處理在用生理鹽水沖洗前和沖洗4 min的電流反應(yīng)分別以粗黑線(A)和灰線(B)表示，100 μM triflumezopyrim(1)(a)、10 μM dicloromezotiaz (2)(b)和10 μM啶蟲脒處理的電流反應(yīng)用細(xì)黑線(C)表示。直線對應(yīng)于乙酰膽堿或殺蟲劑的應(yīng)用時間。

考慮到對蜚蠊注射dicloromezotiaz(2)后，出現(xiàn)興奮性中毒癥狀，故對分離的蜚蠊胸神經(jīng)元進行了電壓鉗研究。如煙蚜夜蛾神經(jīng)元一樣，短時間(10 s)應(yīng)用dicloromezotiaz(2)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)向電流，隨后乙酰膽堿反應(yīng)被強烈抑制。然而，延長dicloromezotiaz(2) (10 μM)應(yīng)用時間(6~120 s)，雖然內(nèi)向電流顯著，但只在50%的受試神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)(圖7)。其平均電流是乙酰膽堿(100 μM)誘導(dǎo)的峰值電流的3.4%±4.5% (n=8)。灌流煙堿乙酰膽堿受體抑制劑甲基牛扁堿能完全阻斷dicloromezotiaz(2)的反應(yīng)，這表明對煙堿乙酰膽堿受體的激活是產(chǎn)生內(nèi)向電流的原因。延長triflumezopyrim(1)(10 μM)的應(yīng)用時間，相似地對煙堿乙酰膽堿受體有弱的激活作用(是乙酰膽堿反應(yīng)的3.4%±0.7%，n=4)，而IMI誘導(dǎo)產(chǎn)生較強反應(yīng)(35.0%±6.8%，n=4)，這是典型兩階段，而介離子殺蟲劑為一階段(圖8)。

以研究triflumezopyrim(1)和相關(guān)9-H類似物相似的方法進一步調(diào)查了dicloromezotiaz(2)對煙堿乙酰膽堿受體的抑制作用。用乙酰膽堿(100 μM)處理神經(jīng)元(10s)得到對照反應(yīng)，然后灌流dicloromezotiaz(2) (0.1~10 nM)8~10 min，再在此殺蟲劑存在的的情況下用乙酰膽堿處理。試驗發(fā)現(xiàn)dicloromezotiaz(2)是乙酰膽堿誘導(dǎo)電流的高活性抑制劑，IC50為1.2 nM(圖9)。應(yīng)用相似的記錄條件，得到triflumezopyrim、IMI和呋蟲胺的IC50分別為0.6、35、>50 nM。當(dāng)IMI和呋蟲胺的IC50接近具有顯著興奮活性的濃度(100 nM)時，dicloromezotiaz和triflumezopyrim的IC50比使煙堿乙酰膽堿受體興奮的濃度低數(shù)個量級。

注：乙酰膽堿短時間(10 s)處理誘導(dǎo)產(chǎn)生強的內(nèi)向電流，然后產(chǎn)生與ouabain敏感Na+/K+運輸有關(guān)的外向電流。Dicloromezotiaz (2，DMT)誘導(dǎo)產(chǎn)生煙堿乙酰膽堿受體拮抗劑甲基牛扁堿(MLA)可阻斷的弱的內(nèi)向電流。箭頭表示應(yīng)用乙酰膽堿，水平線表示dicloromezotiaz (2)和甲基牛扁堿的應(yīng)用時期。

2.3 Triflumezopyrim(1)對抗IMI褐飛虱的活性

測定了介離子殺蟲劑對田間收集的半翅目水稻害蟲的防治效果。曾經(jīng)IMI對褐飛虱和二點黑尾葉蟬有好的防治效果，LC90分別為0.5、0.1 mg/L(表2)。然而，在過去10年害蟲已對IMI產(chǎn)生高抗。在2012－2013年在馬來西亞田間研究站對田間收集的褐飛虱進行了27個單獨試驗，發(fā)現(xiàn)IMI即使在250 mg/L也難以達到>90%的防效。在相同時期，triflumezopyrim(1) 以2、0.4 mg/L分別防治抗IMI的褐飛虱和二點黑尾葉蟬，防效一直維持在>90%。這清楚地表明田間出現(xiàn)了抗IMI的種群，以及triflumezopyrim(1)能成功地防治田間收集的高抗品系。

注：左邊線為乙酰膽堿對照(100 μM，10 s)，右邊線為殺蟲劑(10 μM，120 s)。

注：在灌流殺蟲劑(8~10 min)前和后用乙酰膽堿(100 μM，10 s)刺激神經(jīng)元。線性回歸分析得到IC50為1.2 nM。

在2012－2015年，進一步進行室內(nèi)研究比較了IMI和triflumezopyrim(1)對從中國田間收集的褐飛虱種群的防效。IMI的LD50(31~348 mg/L)比以前不同的研究者報道的對實驗室褐飛虱敏感品系的0.08和0.61高很多。此外，IMI對不同地區(qū)田間褐飛虱的LD50變化很大，這可能說明抗性水平不同。相比，triflumezopyrim(1)的LD50小(0.94~1.32 mg/L)，且不同區(qū)域間變化很小。這些結(jié)果表明在中國缺乏triflumezopyrim (1)抗性。此外，也表明triflumezopyrim(1)和IMI間不存在交互抗性。

2.4 triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的物理特性

表3列出了triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的物理特性，兩者的Log分別為1.2和3.7。由于dicloromezotiaz(2)的log大，可預(yù)測其在植物維管系統(tǒng)中的移動性很差，刺吸式害蟲較難獲得。這與dicloromezotiaz(2)在生測試驗中(membrane feeding assay)對桃蚜高活性，但在取食植物的殺蟲劑生測試驗中對半翅目昆蟲活性弱相一致(表2)。

表3 triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的物理特性

3 總 結(jié)

最初以弱活性的介離子化合物3為先導(dǎo)物，經(jīng)優(yōu)化合成了一系列高活性的殺蟲劑。優(yōu)化最終得到了2個優(yōu)秀的殺蟲劑：防治飛虱的triflumezopyrim(1)和防治鱗翅目害蟲的dicloromezotiaz(2)。這標(biāo)志介離子化合物首次開發(fā)用于作物保護。

殺蟲劑抗性行動委員會根據(jù)殺蟲劑在靶標(biāo)蛋白的結(jié)合位點將殺蟲劑作用機制進行分類。Group 4為結(jié)合于煙堿乙酰膽堿受體正構(gòu)位點的殺蟲劑。根據(jù)與化合物化學(xué)型有關(guān)的代謝交互抗性風(fēng)險的降低情況，把此類分成了不同的亞類?？紤]到其與新煙堿類、亞砜亞胺類和丁烯酸內(nèi)酯類化學(xué)型的不同，以及飛虱對triflumezopyrim(1)與以上類殺蟲劑缺乏交互抗性(代謝型)地情況，triflumezopyrim(1)被分為新的亞類，4E。

發(fā)現(xiàn)triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)對昆蟲煙堿乙酰膽堿受體具有獨特的生理作用。與其他IRAC Group 4具有強的激動活性的殺蟲劑不同，介離子殺蟲劑對煙堿乙酰膽堿受體功能有強的抑制作用，而對受體的激活作用非常弱。Cordova等人研究表明triflumezopyrim(1)處理的昆蟲呈現(xiàn)不活躍中毒癥狀，而不是其他Group 4殺蟲劑的興奮癥狀。

Cordova等人介紹的9-H氯噻唑甲基類似物CPD1和CPD2產(chǎn)生抑制神經(jīng)功能的中毒癥狀，與triflumezopyrim(1)的相似。中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性的降低與對煙堿乙酰膽堿受體強的抑制作用和對此受體弱的激活作用相一致。因此，令人驚奇的是發(fā)現(xiàn)蜚蠊被注射dicloromezotiaz(2)或CPD1和CPD2的9-甲基同系物出現(xiàn)神經(jīng)興奮癥狀。Dicloromezotiaz(2)和triflumezopyrim(1)具有較弱的激發(fā)煙堿乙酰膽堿受體介導(dǎo)的電流活性，而dicloromezotiaz(2)的抑制活性稍低于triflumezopyrim(1)(1.2︰0.6 nM)。

到目前仍不清楚為何1個小基團的取代大大地改變了化合物的活性?？赡艿脑蚴瞧浠钚砸蕾囉趯ν鈬椭袠猩窠?jīng)系統(tǒng)煙堿乙酰膽堿受體的激活和抑制的積累效應(yīng)。9-H介離子類似物總的抑制作用可能高于其激活效應(yīng)，而9-甲基類似物可能恰好相反。本文主要研究了昆蟲的胸神經(jīng)元，這可能不能充分反應(yīng)外圍神經(jīng)系統(tǒng)的煙堿乙酰膽堿受體的活性。Salgado和Saar的發(fā)現(xiàn)表明作用于敏感性煙堿乙酰膽堿受體(nAChN)是正構(gòu)位點激動劑產(chǎn)生神經(jīng)興奮作用的原因，因為在其在血淋巴中的水平達到興奮濃度之前，去敏感性煙堿乙酰膽堿受體(nAChD)可能被徹底抑制。本文只研究了介離子殺蟲劑分別對煙堿乙酰膽堿受體的作用，分別對nAChN和nAChD的影響還需要進一步研究。

Tan等人假設(shè)煙堿乙酰膽堿受體介導(dǎo)的電流激活程度是決定新煙堿類殺蟲劑是具有興奮性還是鎮(zhèn)靜性癥狀的因素。在Tan的研究中，部分激動劑如IMI、噻蟲啉和啶蟲脒引發(fā)興奮癥狀，而呋蟲胺、噻蟲胺和烯啶蟲胺等呈現(xiàn)相似于乙酰膽堿的完全或幾近完全的激動性，誘導(dǎo)產(chǎn)生鎮(zhèn)靜中毒癥狀。然而，本研究發(fā)現(xiàn)呋蟲胺和噻蟲胺都誘導(dǎo)神經(jīng)興奮而不是Tan等人報道的鎮(zhèn)靜癥狀?？紤]到triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)都具有非常弱的激動活性(小于乙酰膽堿反應(yīng)峰值的10%)，然而它們的癥狀顯著不同，所以不能簡單根據(jù)興奮活性程度來預(yù)測中毒癥狀。

Triflumezopyrim(1)對敏感和抗性飛虱種群都有優(yōu)異的防效，研究已表明在亞洲不同地區(qū)進行的田間試驗中有效。介離子殺蟲劑新穎的結(jié)構(gòu)是對飛虱抗性品系具有優(yōu)異防效的根本。Group 4殺蟲劑已被廣泛地商業(yè)化防控刺吸式害蟲。啶蟲脒和噻蟲啉等新煙堿殺蟲劑用于防治蘋果小蜷蛾、柑桔潛葉蛾和梨小食心蟲，一般它們較少用于防治鱗翅目害蟲。Dicloromezotiaz (2)對鱗翅目害蟲有優(yōu)異的防效，因此，介離子可能是現(xiàn)有鱗翅目防治劑如雙酰胺類和多殺菌素類的潛在輪用藥劑。

根據(jù)triflumezopyrim(1)和dicloromezotiaz(2)的活性、獨特的結(jié)構(gòu)和不尋常的生理作用，二者可能是滿足全球食品安全需求的新的害蟲防治方法。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.03.04

TQ453

A

1009-6485(2017)03-0022-09

王昌釗(1979—)，男，山東棗莊人，高級工程師，碩士，從事進出口商品檢驗和檢測工作。E-mail: wangcz@snciq.gov.cn。

2017-06-10。