陳彥民 趙寶生 馮 杰 谷城威 劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

DHPG對食管鱗癌細胞KYSE-450增殖的作用

陳彥民 趙寶生 馮 杰 谷城威 劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

目的探討Ⅰ組代謝型谷氨酸受體激動劑3，5二羥基苯甘氨酸(DHPG)對食管鱗癌細胞KYSE-450增殖的影響及其可能的機制。方法體外常規(guī)培養(yǎng)KYSE-450，采用Western印跡檢測Ⅰ組代謝型谷氨酸受體在食管鱗癌細胞的表達情況，應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度DHPG對KYSE-450細胞增殖的影響，通過Western印跡檢測藥物作用后KYSE-450細胞中AKT、mTOR、4EBP1蛋白及其磷酸化水平的變化。結(jié)果mGluR1和mGluR5在KYSE-450中均有表達。50、100、150 μmol/L DHPG對KYSE-450細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量和時間依賴性?？瞻讓φ战M細胞胞質(zhì)透亮，折光性強，細胞呈梭形、不規(guī)則星形。100 μmol/L DHPG加藥組細胞形態(tài)隨藥物濃度增加及作用時間的延長出現(xiàn)皺縮，細胞核固縮成點狀，有時出現(xiàn)空泡狀。與對照組相比，100 μmol/L DHPG加藥72 h后，p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1水平均明顯降低。結(jié)論Ⅰ組代謝型谷氨酸受體激動劑DHPG能夠抑制KYSE-450的增殖，其機制可能與抑制AKT/mTOR信號通路相關(guān)。

食管鱗癌；Ⅰ組代謝型谷氨酸受體；DHPG、細胞增殖

根據(jù)病理類型，食管癌主要分為鱗狀細胞癌和腺癌，前者發(fā)病率在我國占95%以上。早期食管癌癥狀輕微，臨床就診時多數(shù)患者已處于中晚期〔1〕，因此喪失外科手術(shù)治療的機會，從而需要抗腫瘤藥物治療。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過激活谷氨酸受體發(fā)揮作用。谷氨酸受體分離子型和代謝型兩類。離子型受體通過對細胞膜Na+、Ca2+等離子通透性的改變而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，分為NMDA、AMPA 及KA受體三類。代謝型谷氨酸受體(mGluR)屬于G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)。目前mGluR有8種亞型，分別命名mGluR1 ～ mGluR8。根據(jù)其氨基酸序列的同源性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及藥理學(xué)特性，mGluRs被分成Ⅲ組：第Ⅰ組包括mGluR1和mGluR5；第Ⅱ組包括mGluR2和mGluR3；第Ⅲ組包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8〔2〕。雖然谷氨酸受體主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用，但是越來越多的證據(jù)表明，谷氨酸受體亦存在于外周組織中，并且與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，mGluRs調(diào)控黑色素瘤〔4〕、神經(jīng)膠質(zhì)瘤〔5〕、肺癌〔6〕、口腔鱗癌〔7〕、肝癌〔8〕、乳腺癌〔9〕的生長與轉(zhuǎn)移，由此說明谷氨酸及其受體在腫瘤生長過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。目前mGluRs在食管癌生長中的作用尚未見報道，本研究主要探討Ⅰ組代謝型谷氨酸受體mGluR1、mGluR5的激動劑DHPG對食管鱗癌細胞KYSE-450增殖的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 食管癌細胞KYSE-450、正常食管細胞Het-1A購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，胎牛血清購自Clark，RPMI1640購自Corning，DHPG購自Abcam。單克隆兔抗mGluR1、mGluR5購自Abcam，單克隆兔抗AKT、p-AKT(Ser473)、mTOR、p-mTOR (Ser2448)、p-4EBP1(Thr37/46)購自CST公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng) 將KYSE-450接種在裝有適量RPIM1640/F12培養(yǎng)液(含體積分數(shù)5%FBS 和體積分數(shù)1%青鏈霉素)的培養(yǎng)皿中，置于37℃、含體積分數(shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天傳代一次，細胞呈單層貼壁生長。

1.3不同濃度DHPG對KYSE-450細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化成單個懸浮細胞后以每孔4 000個接種于96孔板中每孔加入100 μl的培養(yǎng)基。待細胞24 h貼壁生長后，按每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，分為空白對照組和DHPG加藥組使其終濃度分別為(50、100、150 μmol/L)。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后每孔分別加入5 g/L的MTT 10 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h后棄上清，加入100 μl DMSO，混勻震蕩，于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度(A)值，計算藥物對細胞增殖的抑制率。增殖抑制率=(A空白對照組-A實驗組)/A實驗組×100%。

1.4Western印跡檢測 mGluR1、mGluR5、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1蛋白水平 收集空白對照組與DHPG 100 μmol/L組處理72 h后KYE-450細胞總蛋白，用于mGluR1、mGluR5、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1的檢測。二喹淋甲酸(BCA)檢測法進行蛋白定量，取蛋白樣品30 μg，電泳后轉(zhuǎn)膜，5% 的脫脂奶粉封閉1 h，AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1抗體用 5%BSA稀釋(1∶100)，4℃過夜，TBST 洗膜(3次×10 min)，5%的牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶8 000)，TBS洗膜，按照ECL說明書1∶1配置發(fā)光工作液，凝膠成像儀成像。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡檢測mGluR1、mGluR5在食管癌細胞系中均有表達 mGluR1、mGluR5在正常食管細胞系Het-1A 和食管鱗癌細胞系KYSE-450中均有表達。見圖1。

圖1 mGluR1、mGluR5在正常食管細胞系及食管鱗癌細胞系中均有表達

2.2DHPG對細胞增殖的影響結(jié)果 10、50、100、150 μmol/L DHPG處理KYSE-450細胞24、48、72 h后，KYSE-450增殖抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而增高，且呈現(xiàn)劑量和時間的依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度DHPG對KYSE-450增殖的抑制率

與空白對照比較：1)P<0.05；與50 μmol/L DHPG組比較：2)P<0.05；與100 μmol/L DHPG組比較：3)P<0.05；與24 h比較：4)P<0.05；與48 h比較：5)P<0.05

2.3DHPG對細胞形態(tài)學(xué)影響 結(jié)果見圖2，空白對照組KYSE-450胞質(zhì)透亮，折光性強，細胞呈現(xiàn)出不規(guī)則星型或多角形。100 μmol/L DHPG處理KYS-E450細胞后，隨著時間的延長細胞逐漸皺縮，細胞核縮成點狀。

A:空白對照組；B：100 μmol/L DHPG組；標(biāo)尺：100 μm圖2 DHPG處理KYSE-450 24、48、72 h后細胞形態(tài)學(xué)變化

2.4Western印跡檢測AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1蛋白水平 選取加藥濃度0、100 μmol/L DHPG加藥72 h后，以GAPDH為內(nèi)參檢測AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1蛋白變化情況。結(jié)果顯示p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1表達水平明顯下降。見圖3。

圖3 DHPG處理后各蛋白變化情況

3 討 論

近年我國食管癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，5年生存率僅為19.9%〔1〕，尋找新的食管癌治療途徑是目前食管癌研究中的重要領(lǐng)域。谷氨酸受體不僅存在于神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周非神經(jīng)系統(tǒng)，包括正常組織和腫瘤組織〔2〕。文獻報道給予NMDA受體阻斷劑及AMPA受體阻斷劑分別抑制胰腺癌細胞、白血病細胞體外增殖〔10〕，給予mGluR1、mGluR5代謝型谷氨酸受體阻斷劑抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤〔5〕、肝癌〔8〕、口腔鱗癌〔7〕和小細胞肺癌〔11〕的增殖，上述結(jié)果表明NMDA、AMPA、mGluR1、mGluR5參與促進腫瘤的生長。然而，Iacovelli及其同事報道〔12〕，激活Ⅲ組代謝型谷氨酸受體mGluR4抑制髓母細胞瘤增殖，表明mGluR4參與腫瘤的生長抑制。這些研究結(jié)果提示谷氨酸受體在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，不同受體亞型對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用可能具有組織特異性。

本研究結(jié)果推測Ⅰ組代謝型谷氨酸受體的表達可能參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。本實驗研究結(jié)果顯示DHPG以劑量和時間依賴性方式抑制KYSE-450細胞增殖。代謝型谷氨酸受體屬于GPCR，文獻報道m(xù)GluRs可以激活A(yù)KT/mTOR信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能〔13〕；AKT/mTOR信號通路在惡性腫瘤的進展過程中具有過度激活的現(xiàn)象，而真核翻譯起始因子(4EBP1)是mTOR信號通路中重要的下游底物之一〔14〕。有研究顯示4EBP1在乳腺癌〔15〕、前列腺癌〔16〕中高表達與其預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果說明，DHPG對食管癌KYSE-450的增殖抑制作用可能與降低AKT/mTOR信號通路相關(guān)。Ⅰ組代謝型谷氨酸受體激動劑DHPG未來可能成為治療食管癌的一種新型藥物，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

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〔2016-12-19修回〕

(編輯 李相軍)

TheeffectofDHPGonproliferationofesophagealsquamouscellcarcinomacelllineKYSE-450

CHENYan-Min,ZHAOBao-Sheng,FENGJie,etal.

FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Weihui453100,Henan,China

ObjectiveTo study the effect of DHPG on the proliferation of esophageal squamous carcinoma KYSE-450 cell line and the possible mechanisms.MethodsKYSE-450 cells were cultured and MTT assay was performed to investigate the effect of DHPG on the proliferation of KYSE-450 cells. Western blot was utilized to detect the protein expression of group Ⅰmetabotropic glutamate receptors both in Het-1A cells derived from normal esophageal epithelia tissue and KYSE-450 cells derived from ESCC tissue. The alteration of phosphorylation of AKT, mTOR as well as 4EBP1 induced by DHPG treatment was examined by Western blot.ResultsBoth mGluR1 and mGluR5 were expressed in KYSE-450 cells. Application of DHPG obviously repressed KYSE-450 cell proliferation in a dose and time dependent manner. Phase contrast imaging showed that untreated control KYSE-450 cells were epithelial-like adherent cells, with a flat and polygonal shape. When treated with 100μmol/L DHPG, the cells gradually appeared to shrink and nuclei were progressively condensed into spots, and sometimes vacuolated, following the duration of drug treatment.When compared with the control group, the protein levels of p-AKT, p-mTOR and p-4EBP1 were significantly decreased at 72 h after 100 μmol/L DHPG administration.ConclusionsDHPG could inhibit KYSE-450 cell proliferation and the mechanism might be related to AKT/mTOR signaling pathway.

Esophageal squamous cell carcinoma; Group I metabotropic glutamate receptor; DHPG; Cell proliferation

R735.1

A

1005-9202(2017)19-4714-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.011

國家自然科學(xué)基金(81470271); 河南省科技廳科技攻關(guān)計劃項目(152102310110)；新鄉(xiāng)市重點科技攻關(guān)計劃項目(ZG15018)

劉玉珍(1964-)，女，教授，主要從事腫瘤轉(zhuǎn)移研究。

陳彥民(1990-)，男，碩士，主要從事食管癌轉(zhuǎn)移機制研究。