趙慧朵 程旭鋒 楚愛景

(河南省中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺病科，河南 鄭州 450000)

梔子苷對乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達的影響

趙慧朵 程旭鋒 楚愛景

(河南省中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺病科，河南 鄭州 450000)

目的觀察梔子苷對乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中白細(xì)胞介素(IL)-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β的影響。方法36只BALB/C小鼠隨機分為模型組(乳腺炎組)、梔子苷組(乳腺炎+梔子苷組)、地塞米松組(乳腺炎+地塞米松組)和對照組(假手術(shù)組)，建立脂多糖誘導(dǎo)乳腺炎小鼠模型HE染色觀察各組乳腺炎小鼠的乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化，采用ELISA法測定各組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量。結(jié)果HE染色顯示：模型組小鼠乳腺乳泡壁增厚，乳泡結(jié)構(gòu)破壞，乳泡內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤；梔子苷組和地塞米松組乳腺乳泡壁稍增厚，乳泡結(jié)構(gòu)輕度破壞，乳泡內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤；對照組小鼠乳腺組織未見明顯異常。模型組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量均高于對照組、梔子苷組和地塞米松組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量均高于對照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論梔子苷對小鼠乳腺炎有保護作用，其機制可能與梔子苷降低乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平有關(guān)。

梔子苷；乳腺炎；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

急性乳腺炎是乳房最常見的急性化膿性感染性疾病。梔子是中國傳統(tǒng)中藥材〔1〕，其成熟干燥的果實是主要中藥部分，梔子具有涼血解毒、清熱利尿、瀉火除煩等功效，梔子苷是從干燥的梔子果實中提取出來的，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等多種藥理作用〔2～4〕。本文擬觀察梔子苷對乳腺炎小鼠乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中白細(xì)胞介素(IL)-6，腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選擇健康BALB/C小鼠36只，購自吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，小鼠許可證號：SYXK(吉)2015-0005。根據(jù)隨機數(shù)字法隨機分為模型組(乳腺炎組)、梔子苷組(乳腺炎+梔子苷組)、地塞米松組(乳腺炎+地塞米松組)和對照組(假手術(shù)組)，每組9只小鼠。主要試劑：脂多糖(LPS)(美國Biolegend公司)，梔子苷(北京中國食品藥品檢驗研究院)，地塞米松注射液(新鄉(xiāng)常樂制藥有限公司)，小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國Biolegend公司)等。

1.2建立乳腺炎小鼠模型 將雌鼠配對成功后分籠喂養(yǎng)，雌鼠分娩后1 w隔離母鼠和幼鼠，待母鼠情緒穩(wěn)定后，每組取2只小鼠處死分離乳腺上皮細(xì)胞，每組剩余7只小鼠稱重，進行麻醉，麻醉成功后，梔子苷組母鼠腹腔注射梔子苷(50 mg/kg)、地塞米松組母鼠腹腔注射地塞米松(5 mg/ml)；模型組和對照組母鼠腹腔注射等量生理鹽水。1 h后，將各組小鼠固定到手術(shù)臺上，酒精消毒第4對乳頭，將乳頭前端剪開一小口，模型組、梔子苷組、地塞米松組乳頭內(nèi)注射50 μl脂多糖(2 mg/ml)，對照組注射等量生理鹽水。12 h后，梔子苷組母鼠腹腔注射梔子苷(50 mg/kg)、地塞米松組母鼠腹腔注射地塞米松(5 mg/ml)；模型組和對照組母鼠腹腔注射等量生理鹽水。建模后24 h處死小鼠，取出第4對乳腺組織進行實驗。

1.3乳腺組織的HE染色 將各組小鼠乳腺組織進行常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟及包埋，將包埋的石蠟切片切成厚0.5 μm的切片，進行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察各組小鼠乳腺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4測定各組小鼠乳腺組織中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量 在碎冰上將各組小鼠乳腺組織和磷酸鹽緩沖液進行粉碎，離心后棄去上層脂肪部分，取中間層上清液，采用ELISA法測定各組小鼠乳腺組織中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量。

1.5分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞 將每組分娩后1 w處死的2只小鼠浸入酒精消毒，分離乳腺組織，在含雙抗的青霉素瓶中洗滌，加入消化液消化，然后剪碎乳腺組織，將乳腺組織移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5 h，離心，棄去上清液，重懸細(xì)胞后濾網(wǎng)過濾，加入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，離心，棄去上清液，接種到含鼠尾膠原的細(xì)胞板中培養(yǎng)36 h。

1.6測定各組小鼠乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量 將各組分離的乳腺上皮細(xì)胞接種到24孔板中，每組7復(fù)孔梔子苷組加入100 μl梔子苷(100 μg/ml)，地塞米松組加入100 μl地塞米松(20 μg/ml)，1 h后模型組、梔子苷組、地塞米松組加入50 μl LPS(4 μg/ml)，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞液，離心后取上清液，采用ELISA法測定各組小鼠乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1乳腺炎小鼠模型的建立 模型組小鼠腹部乳腺部位發(fā)紅，乳腺組織出現(xiàn)紅腫熱痛等炎癥改變，對照組小鼠腹部乳腺部位和乳腺組織無明顯異常。表明乳腺炎小鼠造模成功。

2.2各組小鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)變化 模型組小鼠乳腺乳泡壁增厚，乳泡結(jié)構(gòu)破壞，乳泡內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤；梔子苷組和地塞米松組乳腺乳泡壁稍增厚，乳泡結(jié)構(gòu)輕度破壞，乳泡內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤；對照組小鼠乳腺組織未見明顯異常。見圖1。

圖1 各組小鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×100)

2.3各組小鼠乳腺組織中和乳腺上皮細(xì)胞IL-6，TNF-α和IL-1β表達量 模型組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量均高于對照組、梔子苷組和地塞米松組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量均高于對照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；梔子苷組和地塞米松組小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，表2。

表1 各組小鼠乳腺組織中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量

與模型組比較：1)P<0.05；與對照組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組小鼠乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β表達量

3 討 論

急性乳腺炎發(fā)病的主要原因為乳汁淤積，細(xì)菌經(jīng)過乳頭皸裂或者乳頭破損處浸入乳房組織內(nèi)。急性乳腺炎主要的致病菌為金黃色葡萄球菌，其次為鏈球菌等。小鼠乳腺炎模型可通過LPS誘導(dǎo)、金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)、內(nèi)毒素誘導(dǎo)等方法建立〔5～7〕。LPS是比較常用的誘導(dǎo)建立小鼠乳腺炎模型的方法，LPS是細(xì)菌死亡破壞后釋放出來的，是革蘭陰性菌內(nèi)毒素的組成部分，LPS可引起微循環(huán)障礙、發(fā)熱等，進入人體后增加血液中中性粒細(xì)胞數(shù)量，引起內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，LPS誘導(dǎo)建立小鼠乳腺炎模型可產(chǎn)生IL-6，TNF-α和IL-1β等炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，引起乳腺組織損傷。本研究也顯示LPS誘導(dǎo)建立的小鼠乳腺炎模型乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平明顯增加。

梔子苷在多種疾病中具有重要作用〔8～13〕，對呼吸系統(tǒng)具有抗哮喘、抗肺損傷作用；對消化系統(tǒng)具有保肝利膽、降血糖、保護胰腺組織等作用；對神經(jīng)系統(tǒng)具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善學(xué)習(xí)功能障礙等作用；梔子苷也具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗微生物作用。有研究發(fā)現(xiàn)梔子苷對乳腺炎有一定的保護作用〔14，15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梔子苷對乳腺炎有一定的保護作用，可以減輕乳腺炎炎癥，減輕乳腺組織的破壞程度，降低乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平；考慮梔子苷對乳腺炎的保護作用可能和梔子苷降低乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞中IL-6，TNF-α和IL-1β水平有關(guān)。

1廖夫生.中藥梔子研究進展〔J〕.廣州化工，2013；1：12-3，21.

2Ma TT，Li XF，Li WX，etal.Geniposide alleviates inflammation by suppressing MeCP2 in mice with carbon tetrachloride-induced acute liver injury and LPS-treated THP-1 cells〔J〕.Int Immunopharmacol,2015；29(2)：739-47.

3宋曉靜，孫 勇，付云鶴，等.梔子苷藥理作用的研究進展〔J〕.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015；7：78-80.

4Cai L，Li R，Tang WJ，etal.Antidepressant-like effect of geniposide on chronic unpredictable mild stress-induced depressive rats by regulating the hypothalamus-pituitary-adrenal axis〔J〕.Eur Neuropsychopharmacol.2015；25(8)：1332-41.

5Zhao Y，Zhou M，Gao Y，etal.Shifted T helper cell polarization in a murine staphylococcus aureus mastitis model〔J〕.PLoS One,2015；10(7)：e0134797.

6Gao XJ，Guo MY，Zhang ZC，etal.Bergenin plays an anti-inflammatory role via the modulation of MAPK and NF-κB signaling pathways in a mouse model of LPS-induced mastitis〔J〕.Inflammation,2015；38(3)：1142-50.

7王 亨，余光濤，顧銘杰，等.金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)大鼠乳腺炎模型的建立〔J〕.中國獸醫(yī)雜志，2015；6：7-9，13.

8Wang J，Hou J，Lei H，etal.Synergistic neuroprotective effect of microglial conditioned media treated with geniposide and ginsenoside Rg1 on hypoxia injured neurons〔J〕.Mol Med Rep,2015；12(4)：5328-34.

9王恩力，董 方，姚景春.梔子苷藥理學(xué)和毒理學(xué)研究進展〔J〕.中國藥房，2015；19：2730-3.

10Chen JY，Wu H，Li H，etal.Anti-inflammatory effects and pharmacokinetics study of geniposide on rats with adjuvant arthritis〔J〕.Int Immunopharmacol,2015；24(1)：102-9.

11Zhang Y，Yin F，Liu J，etal.Geniposide protects pancreatic INS-1E β cells from hIAPP-induced cell damage：potential involvement of insulin degrading-enzyme〔J〕.Cell Biol Int,2015；39(4)：373-8.

12Shi Q，Cao J，F(xiàn)ang L，etal.Geniposide suppresses LPS-induced nitric oxide，PGE2 and inflammatory cytokine by downregulating NF-κB，MAPK and AP-1 signaling pathways in macrophages〔J〕.Int Immunopharmacol,2014；20(2)：298-306.

13張文娟，李茂星，張泉龍，等.梔子苷的快速提取分離及其鎮(zhèn)痛抗炎作用研究〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012；21：170-4.

14Song X，Guo M，Wang T，etal.Geniposide inhibited lipopolysaccharide-induced apoptosis by modulating TLR4 and apoptosis-related factors in mouse mammary glands〔J〕.Life Sci,2014；119(1-2)：9-17.

15Song X，Zhang W，Wang T，etal.Geniposide plays an anti-inflammatory role via regulating TLR4 and downstream signaling pathways in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice〔J〕.Inflammation,2014，37(5)：1588-98.

〔2017-02-11修回〕

(編輯 徐 杰)

R655.8

A

1005-9202(2017)19-4712-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.010

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(13A320892)

趙慧朵(1981-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺疾病相關(guān)研究。