付晶晶, 楊彩霞, 韓 彤, 廖一鳴, 李 梁, 李夢新, 孫 偉, 王 蒴(.沈陽大學生命科學與工程學院，遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室，遼寧 沈陽 0044；.沈陽農(nóng)業(yè)大學分析測試中心，遼寧 沈陽 0866)

小西葫蘆黃花葉病毒遼寧分離物的鑒定與序列分析

付晶晶1, 楊彩霞1, 韓 彤1, 廖一鳴1, 李 梁1, 李夢新1, 孫 偉1, 王 蒴2
(1.沈陽大學生命科學與工程學院，遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室，遼寧 沈陽 110044；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學分析測試中心，遼寧 沈陽 110866)

從遼寧省沈陽市和蓋州市分別采集表現(xiàn)花葉的南瓜樣品,經(jīng)透射電鏡負染色實驗，觀察到典型的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)線狀病毒粒子.利用Potyvirus通用引物LegpotyF/LegpotyR分別對3個沈陽樣品和3個蓋州樣品進行RT-PCR擴增，得到預期片段，克隆并測序.Blast顯示6個病毒樣本與小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)同源性最高，均大于99%.利用已經(jīng)報道的特異引物ZYMV-F/ZYMV-R，從6個樣本中擴增到約1.2 kb的ZYMV片段，片段包含完整的外殼蛋白(CP)基因.基于CP的核苷酸序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)2個ZYMV遼寧分離物與山西分離物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高，達99.1%和99.4%.系統(tǒng)進化樹分析表明，2個ZYMV遼寧分離物與山西分離物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14]聚集在一個分支，推測ZYMV遼寧分離物與山西分離物親緣關系最近.

小西葫蘆黃花葉病毒; 遼寧分離物; 序列分析

Abstract:Cucurbitamoschatasamples showing yellow mosaic symptoms were collected from Shenyang and Gaizhou, Liaoning Province, and virions with a typical morphology ofPotyviruswere observed by transmission electron microscope (TEM). The universal degenerate primers LegpotyF/LegpotyR was used forPotyvirusesdetection for 3 symptomatic leaf samples from Shenyang and Gaizhou by RT-PCR. Subsequently, the expected fragments were amplified, cloned and sequenced. Blast results showed that all 6 samples shared the highest identities withZucchiniyellowmosaicvirus(ZYMV) (all above 99%). Based on specific primers ZYMV-F/ZYMV-R， 1.2 kb ZYMV fragment containing complete coat protein (CP) gene was obtained. Referring to the nucleotide sequence ofCP, homology analysis results confirmed that two Liaoning isolates of ZYMV had the highest homology with Shanxi isolate ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14] (KP742962), with identity being 99.1% and 99.4%. The phylogenetic tree results showed that they were also clustered with ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14] in the same branch. Liaoning isolates of ZYMV was considered being most related to Shanxi isolates.

Keywords:Zucchiniyellowmosaicvirus; Liaoning isolate; sequence analysis

小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus, ZYMV)是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus，也為PotatovirusY,PVY)的成員[1]，病毒粒子為彎曲線狀，無包膜，長度為750 nm.基因組為長9.5 kb的單鏈正義RNA(positive single-stranded RNA, +ssRNA)，5′端具有一個共價結合基因組連接蛋白(viral protein genome-linked, VPg)，3′端為20～160 nt個腺苷酸組成的Poly(A)尾巴[2].基因組編碼一個350 kD的多聚蛋白(polyprotein)，翻譯后加工切割成解旋酶、復制酶和衣殼蛋白等8～10個蛋白參與病毒的復制、運動和包裝[3].目前，研究較深入的是ZYMV的衣殼蛋白(coat protein,CP)，發(fā)現(xiàn)CP除了參與病毒的組裝，還參與病毒轉錄、移動和介體傳播[4].在田間，ZYMV主要以蚜蟲經(jīng)非持久性方式進行傳播[5-7]；自然寄主范圍廣泛，可侵染西葫蘆、南瓜、西瓜、羅漢果、黃瓜、甜瓜、冬瓜、絲瓜、節(jié)瓜、瓠瓜、苦瓜、香瓜等葫蘆科植物[8-13]，常造成葉片壞死、褪綠或黃斑駁以及果實畸形等癥狀，嚴重影響作物的產(chǎn)量和商品價值[14-15].近年來，ZYMV已在我國迅速蔓延，在北京、山東、湖南、江蘇、廣西、廣東、甘肅和新疆等地廣泛發(fā)生危害[8,10,13,16-20]，但尚未見其在遼寧發(fā)生的相關報道.2016年，筆者在遼寧沈陽和蓋州地區(qū)均發(fā)現(xiàn)疑似病毒侵染的南瓜樣品，通過透射電鏡觀察和分子檢測，明確侵染南瓜的病毒種類，并分析其分子特征，以期為該病害的防治提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

2016年8月，從遼寧省沈陽市和蓋州市采集表現(xiàn)花葉癥狀的南瓜樣品，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用.

1.2 方法

1.2.1 透射電鏡觀察 取典型花葉癥狀的新鮮葉片，置研缽中，加少量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PB)，研磨至勻漿狀，6 000 r·min-1離心3 min.取上清，銅網(wǎng)置其中吸附3 min后，于2%磷鎢酸中染色10 s，置于透射電鏡(Hitachi TEM system)下觀察.

1.2.2 植物總RNA的提取及病毒的RT-PCR檢測 利用RNASimple Total RNA Kit提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取南瓜病葉總RNA后，在Oligo(dT)15引物引導下，采用TIANScript RT Kit[天根生化科技(北京)有限公司]進行第一鏈cDNA的合成.具體操作：取總RNA 3 μL、Oligo(dT)15(10 μmol·L-1) 2 μL、Super Pure dNTPs (2.5 mmol·L-1each) 2 μL，補RNase-Free ddH2O至14.5 μL后混勻，置于70 ℃金屬浴加熱5 min，迅速在冰上冷卻2 min；短暫離心后加入TIANScript M-MLV反轉錄酶(200 U·L-1) 1 μL、RNase抑制劑(20 U·μL-1) 0.5 μL、5×First-Strand Buffer 4 μL，混勻后42 ℃ 50 min，90 ℃ 5 min終止反應，置冰上冷卻后加入RNase-Free ddH2O至50 μL備用.

以cDNA作為模板，先后用Potyvirus檢測通用引物[11]PVY-LegpotyF (5′-GCWKCHATG ATYGARGCHTGGG-3′)/PVY-LegpotyR(5′-AYYTGYTYMYCHCCATCCAT-3′)和ZYMY特異性引物[20]ZYMV-F(5′-AAGAAGAAGTGCGAGAATTGG-3′)/ZYMV-R(5′-CTTTACGCTTTAAAGGTGGGA-3′)進行PCR擴增(引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成).PCR反應體系為25 μL，循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用TIANgel Midi Purification Kit[天根生化科技(北京)有限公司]對目的DNA條帶進行回收和純化.回收產(chǎn)物與pMD18-T[寶生物工程(大連)有限公司]克隆載體于16 ℃連接1 h后，轉入DH5α菌株的感受態(tài)細胞進行過夜培養(yǎng).挑取單菌落，280 r·min-1、37 ℃搖床培養(yǎng)7 h，取3 μL菌液進行PCR鑒定.陽性樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序.

1.2.3 序列分析 測序結果及數(shù)據(jù)處理等借助DNAStar (DNASTAR Inc., Madison, USA)和DNAMAN version 6.0 (Lynnon Biosoft, Quebe Canada)軟件完成.利用NCBI (National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫的BLAST程序(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索同源序列.采用DNAStar的Clustal V程序分析同源性.利用Clustal_X version 1.83[21]進行完全比對后再用軟件MEGA version 7.0[22]的最大似然法繪制親緣關系樹，置信度設置為1 000，分支節(jié)點上的數(shù)值為后驗概率(>50%).

2 結果與分析

2.1 南瓜病葉樣品電鏡觀察結果

新鮮南瓜病葉于透射電鏡下進行病毒粒子的負染色觀察，可見750 nm×13 nm的線性粒子，病毒粒子外表面無包膜(圖1).病毒粒子形態(tài)特征顯示該病毒可能為Potyvirus屬成員.

2.2 RT-PCR檢測結果

利用屬通用引物PVY-LegpotyF/R對南瓜病葉的cDNA擴增得到701 bp的特異性片段，而健康南瓜葉片中未檢測到該片段(圖2A).測序結果顯示該片段與ZYMV高度同源.利用ZYMV特異性引物ZYMV-F/R對南瓜樣品擴增，獲得包含完整CP基因的長約1.2 kb的片段(圖2B).

圖1 南瓜病葉中的線性病毒粒子Fig.1 Filamentous virion detected in diseased pumpkin leaves

A:PVY-LegpotyF/R引物的擴增結果；B:ZYMV-F/R引物的擴增結果.M：Marker DL2000；1～3：沈陽樣品；4～6：蓋州樣品；7：健康樣品；CK：水.圖2 南瓜病葉ZYMV的RT-PCR檢測結果Fig.2 Detection of ZYMV in diseased pumpkin leaves by RT-PCR

2.3 序列分析

經(jīng)Blast比對，PVY-LegpotyF/R擴增片段與ZYMV的一致性為91%～97%，該片段含有部分CP基因.ZYMV-F/R擴增片段含有849 nts的CP基因(GenBank登錄號為KY495594-KY495599)，編碼282個氨基酸.6個分離物的同源性高達99.8%，選取ZYMV-LNsyA和ZYMV-LNgzA分離物進行同源性和系統(tǒng)進化分析.同源性分析顯示，它們均與ZYMV的中國山西菊花分離物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高，分別達99.1%和99.4%(表1).

表1 ZYMV 2個遼寧分離物與其他報道ZYMV分離物的CP基因的核苷酸序列同源性Table 1 Percentage of nucleotide sequence identity between CP gene of 2 Liaoning isolates and other published ZYMV isolates

續(xù)表1

基于CP基因構建系統(tǒng)進化樹，ZYMV-LNsyA和ZYMV-LNgzA與中國山西菊花分離物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)、韓國西葫蘆分離物ZYMV-[SK:Cucurbitapepo](AB369279)、韓國黃瓜分離物ZYMV-[SK:Cucumber](AF062518)、中國山西南瓜分離物ZYMV-[CN:SX:Squash](AY61102-AY611024)、韓國南瓜分離物ZYMV-[SK:Cucurbitamoschata](AY278998-AY279000)和中國河南甜瓜分離物ZYMV-[CN:HN:Melon](AY611022)聚集在第Ⅲ簇；第Ⅰ簇分離物最多，包括歐洲分離物(塞爾維亞、法國和德國)、南美分離物(委內瑞拉)、澳洲分離物(澳大利亞)和亞洲分離物(伊朗、以色列、敘利亞、印度和巴基斯坦)；第Ⅱ簇分離物主要來自歐洲(波蘭和意大利)、非洲(馬里和南非)和亞洲(中國和日本)；第Ⅳ簇分離物均來自中國臺灣和中國浙江；第Ⅴ簇是2個新加坡分離物；PMMV-[CN:LN](KU646837)作為外群組單獨成一個分支(圖3).Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ簇均為亞洲分離物，主要來自中國、韓國和新加坡.亞洲其他地區(qū)(日本、印度、伊朗、以色列和巴基斯坦)分離物與歐洲、非洲、美洲和澳洲分離物聚集在Ⅰ和Ⅱ簇中.可見，ZYMV沒有明顯的地理和寄主限制.

圖3 基于2個ZYMV遼寧分離物及42個已報道ZYMV CP核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequences of 2 ZYMV Liaoning isolates and 42 previously reported ZYMV isolates

根據(jù)第九次病毒分類委員會報道的Potyvirus分類標準(CP基因的核苷酸同源性低于76%，或者CP基因的氨基酸同源性低于80%，可認為是PVY屬的一個新種)[1]，可判定侵染遼寧沈陽和蓋州地區(qū)南瓜的病菌為小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus, ZYMV).

3 討論

Potyvirus是Potyviridae中最大的屬，包含143個確定種和32個暫定種[1].目前，遼寧僅報道了西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus, WMV)西瓜分離物[23]、PVY煙草分離物[24]、甘薯褪綠矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus, SPCSV)甘薯分離物[25]和百合斑駁病毒(Lilymottlevirus, LMoV)百合分離物[26]，尚無ZYMV的相關信息.ZYMV主要危害瓜類葫蘆科作物[8-13]，而瓜類作物又是遼寧省農(nóng)民增收的重要產(chǎn)業(yè)(種植面積約13.3萬hm2，產(chǎn)值約100億元)[27]，因此，有必要對ZYMV病害進行調查和檢測，為該病害的防治提供理論基礎.本研究首次確定遼寧沈陽和蓋州地區(qū)普遍發(fā)生的花葉南瓜上存在ZYMV，并基于CP核苷酸將ZYMV劃分為5個基因型，其中,遼寧分離物屬于Ⅲ型，而Ⅳ型基因是中國特有群體.目前，ZYMV中國分離物的基因分型均基于CP的系統(tǒng)進化分析[10,17,19-20]，如趙芹等[19]將ZYMV劃分為7個基因型，而李繼洋等[20]將ZYMV劃分為4個基因型.更準確的基因型劃分，將需要龐大的ZYMV分離物信息，因此，今后將繼續(xù)對遼寧地區(qū)ZYMV病害進行系統(tǒng)調查和檢測.

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(責任編輯:楊郁霞)

IdentificationandsequenceanalysisofZucchiniyellowmosaicvirusinLiaoning

FU Jingjing1, YANG Caixia1, HAN Tong1, LIAO Yiming1, LI Liang1, LI Mengxin1, SUN Wei1, WANG Shuo2
(1.Liaoning Key Laboratory of Urban Pest Management and Ecological Safety, College of Life Science and Bioengineering, Shenyang University, Shenyang, Liaoning 110044, China; 2.Forecasting and Analysis Center, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning 110866, China)

S432.1

A

1671-5470(2017)05-0488-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.002

2017-01-25

2017-04-11

遼寧省自然科學基金(2015020806)；遼寧省教育廳一般項目(L2015362)；遼寧省博士科研啟動基金(20121043)；沈陽大學博士科研啟動基金(20212365).

付晶晶(1993-)，女，碩士研究生.研究方向：植物病毒學.Email:343876551@qq.com.通訊作者楊彩霞(1980-)，女，副教授，博士.研究方向：植物病毒學.Email:xueyang27@126.com.