王晨陽，陳紅賢，王明梅，張 敏，王意敏，劉忠華

（北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

國槐槐角種胚愈傷組織黃酮粗提液的抗氧化性

王晨陽，陳紅賢，王明梅，張 敏，王意敏，劉忠華

（北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

將國槐Sophora japonica槐角種胚細胞懸浮培養(yǎng)后，對細胞生產(chǎn)的黃酮類化合物進行抗氧化特性研究，測定黃酮粗提液對羥自由基（·OH），超氧自由基（O2－·）和亞硝酸鹽的清除能力，測定黃酮粗提液對亞油酸過氧化和豬油自氧化的抑制能力，從而為研究黃酮化合物抗氧化活性的構(gòu)效理論提供依據(jù)。結(jié)果表明：①黃酮粗提液對羥自由基的清除能力隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大而增強，質(zhì)量濃度為354.00 mg·L－1時，清除率可達到96.58%，抗氧化效果明顯優(yōu)于相同質(zhì)量濃度的維生素C（VC）溶液；②黃酮粗提液對超氧自由基的清除能力隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大而增強，清除率可達61.54%，但是抗氧化效果弱于相同質(zhì)量濃度的VC溶液；③黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除能力隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大而增強，清除率可達79.91%，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抗氧化效果優(yōu)于相同質(zhì)量濃度的VC溶液；④黃酮粗提物對亞油酸自氧化有抑制作用，但抗氧化效果沒有相同質(zhì)量的VC強；⑤黃酮粗提物對豬油自氧化有抑制作用，抗氧化效果優(yōu)于相同質(zhì)量的二丁基羥基甲苯。總體來看，國槐槐角種胚細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的黃酮類化合物具有明顯的抗氧化活性，且在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃酮提取物的質(zhì)量濃度越大，其抗氧化性越好。圖5表3參25

植物學(xué)；槐角種胚；懸浮培養(yǎng)；黃酮類化合物；抗氧化性

Abstract:To provide a theoretical basis for the structure-activity theory of antioxidant activity for extracted flavonoids,a study was conducted on the antioxidant activity of flavonoid production after a suspension culture of S.japonica embryo cells.Antioxidant activity of crude flavonoids extracted from callus of the S.japonica embryo was not only studied with the method of scavenging hydroxyls,superoxide radicals,and nitrites;but also with the method of inhibiting self-oxidation of linoleic acid and pig oil.Results revealed that when the mass concentration was 354.00 mg·L－1,with an increasing concentration of flavonoids,the free radical scavenging activity （1） of a hydroxyl radical was reinforced with a scavenging ratio on the hydroxyl radical of 96.58%,which is significantly higher than the scavenging activity of vitamin C （P=0.001）,（2） of the superoxide radical was reinforced with a scavenging ratio on the superoxide radical of 61.54%,which is much lower than the scavenging activity of vitamin C （P=0.001）,and （3） of nitrite was reinforced with a scavenging ratio on nitrite of 79.91%,which is higher than the scavenging activity of vitamin C （P=0.001）.（4） The crude flavonoid extract could inhibit the self-oxidation of linoleic acid,which is with an inhibitive effect lower than the scavenging activity of vitamin C （P=0.001）and （5） of the self-oxidation of pig oil was inhibited.Taken together,obvious antioxidant activity was shown in flavonoid production for a suspension culture system of fructus sophoraeembryo cells with a greater concentration of flavonoid extract,for certain ranges of concentrations,having better antioxidant activity. ［Ch,5 fig.3 tab.25 ref.］

Key words:botany;fructus sophorae embryo;suspension culture;flavonoids;antioxidant activity

國槐Sophora japonica又名豆槐、白槐、家槐，屬于豆科Leguminosae槐屬Sophora喬木，喜光而稍耐蔭，在中國各省區(qū)廣泛栽培?；苯羌磭钡墓麑崳v果，念珠狀，其性寒、味苦，有涼血止血、清肝明目的功效?；苯呛卸喾N化學(xué)成分，主要成分為黃酮類化合物［1］，具有抑菌、抗病毒、降血壓等一系列功能［2－5］，并可作為質(zhì)量鑒定、藥材及其制劑的質(zhì)量控制指標［6］，引起了國內(nèi)外的廣泛研究。雖然國槐原產(chǎn)于中國并在中國廣泛分布，但多用作行道樹或庭院樹種，并且容易受到環(huán)境污染及病蟲害影響，藥用資源開發(fā)利用率較低，難以滿足需求［7］。目前，從國槐槐角中獲取具有極高藥用價值的黃酮產(chǎn)物，通常是從槐角中直接提取，由于經(jīng)常受到季節(jié)、地區(qū)等因素影響，限制了黃酮作為新型藥劑的推廣［8］。液體懸浮培養(yǎng)是植物細胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物最簡單有效并被廣泛應(yīng)用的方式［9］，因此，采用槐角愈傷組織懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)黃酮類化合物可以有效解決藥用植物資源有限的問題。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)黃酮類化合物是一個比較常見的方法，如采用杜仲Eucommia ulmoides，金蕎麥Fagopyrum dibotrys，甘草Glycyrrhiza uralensis［10－12］等植物作為外植體進行細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物已有了一定的研究，但是采用國槐槐角種胚進行細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物的研究報道還相對較少，將國槐槐角種胚細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的黃酮類化合物進行抗氧化性研究尚無報道。因此，筆者在本實驗室研究的基礎(chǔ)上，將國槐槐角種胚細胞懸浮培養(yǎng)后，對其生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物進行抗氧化特性研究，采用了5種不同方法，測定提取液對不同自由基、亞硝酸鹽的清除能力及抑制脂肪、脂肪酸自氧化的能力，可以為黃酮類化合物的活性成分分析和開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也能為其抗氧化活性的構(gòu)效理論提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗所用國槐槐角采自北京八家郊野公園內(nèi)，國槐槐角愈傷組織來自國槐種胚的誘導(dǎo)，篩選生長快、分散性好的槐角愈傷組織，將它們在B5固體培養(yǎng)基上繼代5次以上，獲得穩(wěn)定的愈傷組織后將其轉(zhuǎn)接到B5液體培養(yǎng)基中，在液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，繼代6次后得到愈傷組織即為本實驗所需材料［8,13］。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 固體培養(yǎng)基為： B5+1.00 mg·L－12,4-D+0.20 mg·L－16-BA（6-芐氨基嘌呤）， 蔗糖30.00 g·L－1， 瓊脂 6.00 g·L－1， 滅菌前 pH 6.60。 液體培養(yǎng)基為： B5+2.00 mg·L－12,4-D+0.50 mg·L－16-BA+0.05 mg·L－1NAA（萘乙酸）， 蔗糖 30.00 g·L－1， 滅菌前 pH 6.17。 培養(yǎng)基均在 121 ℃高壓條件下滅菌30 min。固體培養(yǎng)基放置于溫度為（25±1）℃的環(huán)境下培養(yǎng)，30 d繼代1次。獲得穩(wěn)定愈傷組織后，接種到裝液量為50.00 mL B5液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，接種量為40.00 g·L－1，該液體培養(yǎng)基懸浮體系在溫度為（25±1） ℃， 轉(zhuǎn)速為 110 r·min－1的搖床上全程暗培養(yǎng)， 25 d 繼代 1 次［7－8,13］。

圖1 槐角苷標準曲線Figure 1 Standard curve of sophoricoside

1.2.2 槐角苷標準曲線的繪制 黃酮類化合物含量的測定采用紫外分光光度法［14］，選用槐角苷為標準品，繪制標準曲線。精確稱取2.00 mg槐角苷標準品，用體積分數(shù)70%乙醇溶解后定容至100.00 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.02 mg·L－1的槐角苷標準溶液；依次量取配制好的槐角苷標準溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL定容至 10.00 mL， 得到質(zhì)量濃度分別為 2.00，4.00，6.00， 8.00， 10.00， 12.00 mg·L－1的槐角苷溶液，以體積分數(shù)為70%乙醇溶液為空白對照，在261.5 nm處測定槐角苷的吸光度。以吸光度為橫坐標，槐角苷質(zhì)量濃度為縱坐標繪制標準曲線（之前已測定過儀器的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性）（圖1）?；苯擒諛藴势吩?～12.00 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y＝8.090 5x＋0.090 5，R2＝0.998 9，x為不同質(zhì)量濃度溶液的吸光度，y為槐角苷溶液質(zhì)量濃度。

1.2.3 槐角細胞黃酮粗提液的提取 將烘干后的愈傷組織研磨，過80目篩，備用。稱取0.10 g粉末于10.00 mL離心管中，加入4.00 mL體積分數(shù)為70%乙醇，室溫下超聲提取40 min。提取后離心5 min，收集其上清液，合并到50.00 mL的雞心瓶，在（40±1）℃，60 r·min－1的條件下進行旋蒸，得到槐角細胞黃酮粗提液。

1.2.4 黃酮化合物產(chǎn)量的測定 取上述提取液稀釋30倍后測定在261.5 nm處的吸光度，重復(fù)3次。總黃酮的含量（X）以槐角苷計，用Y代表黃酮化合物產(chǎn)量。計算公式如下：

式（1）和式（2）中：c為稀釋后的提取液中槐角苷的質(zhì)量濃度（mg·L－1）；v為所提取槐角苷溶液的體積（mL）；m為精確稱取的供試材料的質(zhì)量（g）；wDW為收獲的細胞干質(zhì)量濃度（g·L－1）。結(jié)合槐角苷標準曲線，經(jīng)計算，樣品乙醇提取液中黃酮化合物的產(chǎn)量為354.00 mg·L－1。

1.2.5 不同質(zhì)量濃度梯度細胞提取液的配制 采用二倍稀釋法［15］將黃酮化合物質(zhì)量濃度為354.00 mg·L－1的細胞提取液進行稀釋，最終得到質(zhì)量濃度分別為354.00，177.00，88.50，44.25，22.13，11.06，5.53 mg·L－1等7個質(zhì)量濃度的黃酮粗提液。

1.2.6 水楊酸fenton試劑法測定羥自由基清除率 稱取0.083 4 g七水合硫酸亞鐵溶于少量蒸餾水中，然后轉(zhuǎn)移到50.00 mL容量瓶中，定容，得到6.00 mmol·L－1硫酸亞鐵溶液；稱取0.041 4 g水楊酸，加入少量乙醇，攪拌，然后轉(zhuǎn)移到50.00 mL容量瓶中用無水乙醇準確定容，得到6.00 mmol·L－1的水楊酸-乙醇體系（避光保存）；用移液槍量取333.40 μL質(zhì)量分數(shù)為30%的過氧化氫用蒸餾水定容至100.00 mL容量瓶中，得到質(zhì)量分數(shù)為0.1%的過氧化氫。在10.00 mL具塞試管中先后加入質(zhì)量濃度為6.00 mmol·L－1硫酸亞鐵溶液、6.00 mmol·L－1的水楊酸-乙醇、不同質(zhì)量濃度樣品，最后加入過氧化氫啟動反應(yīng)，設(shè)置8.00 mL反應(yīng)體系（表1）。37℃水浴反應(yīng)30 min后，在510.0 nm處測定吸光度。計算公式為：清除率（%）＝［1－（A－B）/C］×100%。其中：A為加入抗氧化劑后溶液的吸光度，B為提取樣液在測定波長下的吸光度（消除提取液本身的顏色對結(jié)果的干擾），C為未加入抗氧化劑時溶液的吸光度。

表1 反應(yīng)體系各物質(zhì)的添加量Table 1 Dosage of each solution in the reaction system

表2 反應(yīng)體系各物質(zhì)的添加量Table 2 Dosage of each solution in the reaction system

1.2.7 鄰苯三酚自氧化法測定超氧自由基清除率 稱取三羥甲基氨基甲烷12.11 g，用蒸餾水溶解定容至1 000.00 mL，得到0.10 mol·L－1的三羥甲基氨基甲烷溶液；量取50.00 mL濃度為0.10 mol·L－1的三羥甲基氨基甲烷溶液與22.90 mL，0.10 mol·L－1的氯化氫溶液混勻并用蒸餾水定容至100.0 mL，得到pH 8.2（25℃）濃度為 50.00 mmol·L－1的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液；稱取0.315 0 g鄰苯三酚固體，用 10.00 mmol·L－1的氯化氫溶液定容至 100.00 mL， 得到 25.00 mmol·L－1的鄰苯三酚溶液（避光保存）。在10.00 mL具塞試管中設(shè)置9.00 mL反應(yīng)體系，先后加入 50.00 mL 濃度為 0.10 mol·L－1的三羥甲基氨基甲烷溶液、不同質(zhì)量濃度樣品，混勻后在37℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在37℃預(yù)熱過的25.00 mmol·L－1鄰苯三酚溶液， 混勻后于37℃水浴中反應(yīng)5 min后加入1.00 mol·L－1的鹽酸終止反應(yīng)（表 2）， 在 420.0 nm處測定吸光度。計算公式為：清除率（%）＝ ［1－（A－B）/C］×100%。 其中： A 為加入抗氧化劑后溶液的吸光度，B為提取樣液在測定波長下的吸光度（消除提取液本身的顏色對結(jié)果的干擾），C為未加入抗氧化劑時溶液的吸光度。

1.2.8 鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽的清除率 分別量取1.00 mL不同質(zhì)量濃度樣品移入25.00 mL的容量瓶中，各加入5.00 mg·L－1的亞硝酸鈉標準溶液5.00 mL，在室溫下反應(yīng)60 min；加2.00 mL質(zhì)量分數(shù)為0.4%的對氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置5 min；加入1.00 mL質(zhì)量分數(shù)為0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液，搖勻，定容至刻度線，靜置15 min；另用以上相同步驟做一空白對照；在540.0 nm處測定吸光度，計算亞硝酸鹽的清除率。 計算公式為： 清除率（%）＝［（B空白對比吸光度－B加入黃酮吸光度）/B空白對比吸光度］×100%。

1.2.9 硫代巴比妥酸法測定亞油酸自氧化抑制作用 稱取愈傷組織粉末0.05，0.10，0.20，0.50 g，各用4.00 mL無水乙醇溶解；用無水乙醇配制體積分數(shù)為0.5%的亞油酸乙醇液，將愈傷組織粉末分別加入50.00 mL體積分數(shù)為0.5%的亞油酸乙醇液中混勻，以僅在50.00 mL體積分數(shù)為0.5%的亞油酸乙醇液中加4.00 mL無水乙醇為對照；在（40±1）℃烘箱中強化保存，定時攪拌，采用硫代巴比妥酸法測定吸光度；以相同質(zhì)量的VC做陽性對照，重復(fù)以上步驟。

1.2.10 碘量法測定豬油自氧化抑制作用 將豬油放在燒杯中，用文火熬煉；稱取研磨后的愈傷組織粉末0.05，0.10，0.20，0.50 g，各用8.00 mL無水乙醇溶解，分別加入50.00 g溫熱豬油中，攪勻，以僅在豬油中加8.00 mL無水乙醇為對照；在（70±1）℃烘箱中強化保存，定時攪拌，測其過氧化值；以相同質(zhì)量的二丁基羥基甲苯做陽性對照，重復(fù)以上步驟。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織黃酮粗提液對羥自由基的清除能力

圖2顯示了不同質(zhì)量濃度的槐角種胚愈傷組織黃酮粗提液和VC溶液對羥自由基的清除能力。由圖2可知：這2種抗氧化劑對羥自由基都具有清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增大，清除能力增強，說明對羥基自由基的清除能力與樣品的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。兩者對羥自由基的清除能力有一定的差距：當質(zhì)量濃度為354.00 mg·L－1（即未稀釋）時，黃酮粗提液對羥自由基的清除能力達到了96.58%，而VC溶液只有46.79%；當質(zhì)量濃度較小，為11.06和5.53 mg·L－1時，黃酮粗提液對羥自由基的清除率仍然在5.00%左右，而VC溶液卻不到1.00%。對其抗氧化性進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，在354.0～22.13 mg·L－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃酮粗提液對羥自由基的清除率極顯著高于相同質(zhì)量濃度的VC溶液；在質(zhì)量濃度為11.06 mg·L－1時，黃酮粗提液對羥自由基的清除率也顯著高于VC溶液；在質(zhì)量濃度為5.53 mg·L－1時，黃酮粗提液和VC溶液對羥自由基的清除率差異性不顯著，但高于VC溶液。

圖2 愈傷組織黃酮粗提液和VC溶液清除羥自由基的能力Figure 2 Hydroxyl radical scavenging activity of callus crude flavonoids extract and VC solution

2.2 愈傷組織黃酮粗提液對超氧自由基的清除能力

圖3 愈傷組織黃酮粗提液和VC溶液清除超氧自由基的能力Figure 3 Superoxide radical scavenging activity of callus crude flavonoids extract and VC solution

不同質(zhì)量濃度的槐角種胚愈傷組織黃酮粗提液和VC溶液對超氧自由基的清除作用見圖3，與清除羥自由基的作用相似，隨著黃酮粗提液和VC溶液質(zhì)量濃度的升高，對超氧自由基的清除能力也越強。但是2種抗氧化劑對超氧自由基的清除能力不同，當質(zhì)量濃度為354.00 mg·L－1（即未稀釋）時，黃酮粗提液對超氧自由基的清除能力為61.54%，而VC達到了95.75%；當質(zhì)量濃度較小，為11.06和5.53 mg·L－1時，黃酮粗提液對超氧自由基的清除率不到1.00%，而VC溶液的清除率仍在3.00%以上。對其抗氧化性進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，在354.00～11.06 mg·L－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC溶液對超氧自由基的清除率極顯著高于相同質(zhì)量濃度的黃酮粗提液；在質(zhì)量濃度為5.53 mg·L－1時，黃酮粗提液和VC溶液對超氧自由基的清除率雖然差異性不顯著，但低于VC溶液。

2.3 愈傷組織黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除能力

圖4顯示了不同質(zhì)量濃度的槐角種胚愈傷組織黃酮粗提液和VC溶液對亞硝酸鹽的清除作用。由圖4可知：這2種抗氧化劑對亞硝酸鹽都具有清除作用，與清除羥自由基、超氧自由基的作用相似，隨著黃酮粗提液和VC溶液質(zhì)量濃度的升高，對亞硝酸鹽的清除能力也隨之增強。但是2種抗氧化劑對亞硝酸鹽的清除能力不同，當質(zhì)量濃度為354.00 mg·L－1（即未稀釋）時，黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除能力為79.91%，而VC溶液只有51.60%；在354.00～44.25 mg·L－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除作用要高于相同質(zhì)量濃度的VC溶液；而當質(zhì)量濃度繼續(xù)減小至5.53 mg·L－1時，2種抗氧化劑對亞硝酸鹽的清除作用均在10.00%左右，但VC溶液對亞硝酸鹽的清除作用更強。對其抗氧化性進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)在354.00～88.50 mg·L－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除率極顯著高于相同質(zhì)量濃度的VC溶液；在質(zhì)量濃度為22.13 mg·L－1時，黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除率極顯著低于相同質(zhì)量濃度的VC溶液；當質(zhì)量濃度低于22.13 mg·L－1時，黃酮粗提液和VC溶液對亞硝酸鹽的清除率差異性不顯著，黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除率稍低于VC溶液。

圖4 愈傷組織黃酮粗提液和VC溶液清除亞硝酸鹽的能力Figure 4 Nitrite scavenging activity of callus crude flavonoids extract and VC solution

2.4 黃酮粗提物對亞油酸自氧化的抑制作用

黃酮類化合物抑制亞油酸的自氧化作用是基于不飽和脂肪酸的自由基反應(yīng),反應(yīng)過程中產(chǎn)生過氧化自由基,進而氧化生成環(huán)氧化物,環(huán)氧化物生成丙二醛,丙二醛與硫代巴比妥酸（TBA）作用生成TBA染料,其最大吸收波長為532.0 nm。因此,生成TBA染料的多少反映了532.0 nm處吸光度的大小,是衡量自由基鏈反應(yīng)進程的標志?？寡趸瘎┛梢种谱杂苫湻磻?yīng),最終表現(xiàn)為TBA染料生成較少,吸光度變?。?6］。表3顯示了不同質(zhì)量的槐角種胚愈傷組織黃酮粗提物和VC對亞油酸自氧化的抑制作用，添加抗氧化劑后，樣品的吸光度與對照組相比均減小。從實驗結(jié)果看：這2種抗氧化劑對亞油酸自氧化都具有抑制作用，且隨著抗氧化劑添加量增加，吸光度越小，抗氧化性越好。從實驗數(shù)據(jù)可以看出：黃酮粗提物及VC抑制亞油酸自氧化的能力相差不大，而黃酮粗提物抑制亞油酸自氧化的能力沒有相同質(zhì)量的VC強。

表3 2種抗氧化劑對亞油酸自氧化的抑制能力Table 3 Inhibition of self oxidation of linoleic acid by two kinds of antioxidants

2.5 黃酮粗提物對豬油自氧化的抑制作用

豬油在腐敗過程中，會產(chǎn)生過氧化物，過氧化值的大小，反映了過氧化物的多少?？寡趸瘎┛梢韵^氧化物的存在，最終表現(xiàn)為過氧化值的下降［16］。不同質(zhì)量的黃酮粗提物和二丁基羥基甲苯對豬油自氧化的抑制作用見圖5，與抑制亞油酸自氧化的作用相似，不同質(zhì)量的黃酮粗提物和二丁基羥基甲苯可消除豬油腐敗過程中產(chǎn)生的過氧化物，對豬油自氧化均具有明顯的抑制作用，隨著黃酮粗提物和二丁基羥基甲苯質(zhì)量的增加，過氧化值的下降的程度也增大，即對豬油自氧化的抑制作用也越強。另外從實驗結(jié)果看，愈傷組織的黃酮粗提物抑制豬油自氧化的效果優(yōu)于相同質(zhì)量的二丁基羥基甲苯。

3 結(jié)論與討論

羥基自由基被認為是具有較強毒性的自由基［17］，得電子能力極強，可以和大部分細胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，甚至能氧化損傷基因，對衰老和癌癥有著極大的影響。超氧自由基是代謝過程中生成的第1個自由基，同時也是其他部分氧自由基的來源，因為它可以進一步轉(zhuǎn)化成其他自由基［18］。亞硝酸鹽廣泛存在于環(huán)境中，但較多亞硝酸鹽攝入，可將人體血紅蛋白中的二價鐵離子氧化成三價鐵離子，使血紅蛋白失去攜氧能力，同時它還是形成強致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，及時清除亞硝酸鹽是食品安全的保障［19］。因此，本實驗測定槐角種胚細胞黃酮粗提液對羥自由基、超氧自由基、亞硝酸鹽的清除能力是研究其抗氧化活性必不可少的。油脂或油脂食品在儲存過程中，由于長時間接觸空氣，會產(chǎn)生危害人體健康的氫過氧化物，另外油脂在炸制過程中，既受熱又氧化，其過氧化物形成及分解成自由基的速度加快，對人體危害程度還會大大增加［20］，而人工合成的抗氧劑有一定毒性，所以有必要選擇合適的抗氧化劑削弱過氧化物的產(chǎn)生。本實驗選擇槐角種胚細胞黃酮提物液測定其對亞油酸和豬油自氧化的抑制作用，既能反應(yīng)黃酮粗提物抗氧化性活性的強弱，又能為食品安全提供必要保障。

結(jié)果顯示：槐角種胚細胞黃酮粗提液對羥自由基、超氧自由基、亞硝酸鹽都具有清除能力，具有較強的抗氧化活性，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除能力隨著黃酮粗提液質(zhì)量濃度的增大而增強，但是對各種自由基的清除能力有所不同。黃酮粗提液對羥自由基的清除能力極強，最高可達到96.58%，極顯著高于相同質(zhì)量濃度的VC溶液；對超氧自由基的清除能力也較強，最高可達到61.54%，但是其清除率極顯著低于相同質(zhì)量濃度的VC溶液，這說明槐角種胚細胞黃酮粗提液對羥自由基的清除能力大于對超氧自由基的清除能力。而對于亞硝酸鹽的清除能力，最高可達到79.91%，極顯著高于相同質(zhì)量濃度的VC溶液，但較低質(zhì)量濃度的黃酮粗提液對亞硝酸鹽的清除能力卻不及VC溶液。同時，槐角種胚細胞提取物可以去除亞油酸和豬油在自氧化過程中產(chǎn)生的過氧化物，對其自氧化有明顯的抑制作用，可見槐角種胚細胞提取物的應(yīng)用范圍較廣泛，可以在食品生產(chǎn)中有獨特的用處。這些抗氧化能力作用的發(fā)揮，主要是由于國槐種胚細胞懸浮培養(yǎng)后黃酮粗提液中所含的黃酮類化合物產(chǎn)生作用的結(jié)果，對不同物質(zhì)的清除能力的不同可能與提取液所含黃酮類化合物的種類和結(jié)構(gòu)不同有關(guān)［21］，測定它們對不同自由基的清除能力及對亞油酸過氧化和豬油自氧化的抑制能力可以為研究黃酮粗提液的成分及其抗氧化活性的構(gòu)效理論提供依據(jù)。

結(jié)合前人研究，在不同植物體內(nèi)提取的黃酮類化合物有著不同強度的抗氧化活性，其中在杜仲雄花、銀杏Ginkgo biloba葉、玫瑰茄Hibiscus sabdariffa花萼等提取的黃酮粗提物分別對羥基自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基等有較強的清除效果，并且其抗氧化活性均優(yōu)于相同質(zhì)量濃度的VC溶液［22－24］，與本實驗中國槐種胚細胞懸浮液黃酮粗提物的抗氧化性研究結(jié)果相似。在相同質(zhì)量濃度下，黃酮粗提物具有更優(yōu)的抗氧化活性，可能與黃酮類化合物本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性有關(guān)，一方面黃酮類化合物電子自旋密度分布的均勻性，同時在分子內(nèi)形成半醌式自由基時所需能量較低，其形成的自由基較穩(wěn)定，從而具有較高的抗氧化活性［25］；另一方面，黃酮類化合物可以直接清除反應(yīng)鏈中的自由基，切斷自由基鏈反應(yīng)，從而起到防止和斷裂鏈反應(yīng)的兩重功效［23］。

總體來看，國槐槐角種胚細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的黃酮類化合物具有明顯的抗氧化活性，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃酮提取物質(zhì)量濃度越大，其抗氧化性越好。國槐槐角種胚細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的黃酮類化合物是細胞培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)物，是一種具有抗氧化活性的天然綠色食品抗氧化劑，具有用量少、安全無毒等優(yōu)點。當今，食品工業(yè)發(fā)展迅速，含有天然活性成分的保健食品越來越受到現(xiàn)代人的推崇，而同時國槐槐角作為藥材存在原料不足、易受環(huán)境污染、病蟲害等影響，難以滿足需求，運用細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的槐角種胚細胞具有明顯的抗氧化活性，可以有效解決藥用植物資源有限的問題，應(yīng)用前景廣闊。

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Antioxidant activity of Sophora japonica embryo cells in a suspension culture system

WANG Chenyang,CHEN Hongxian,WANG Mingmei,ZHANG Min,WANG Yimin,LIU Zhonghua
（College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China）

S718.43；Q946.8

A

2095-0756（2017）05-0887-08

2016-09-18；

2017-01-15

國家自然科學(xué)基金資助項目（31470668）

王晨陽，從事藥用植物及其次生代謝研究。E-mail:wangcy_1991@163.com。通信作者：劉忠華，副教授，博士，從事植物生長發(fā)育及系統(tǒng)進化研究。E-mail:liuzh6@bjfu.edu.cn