陳 虎，賈 婕，羅群風(fēng)，吳東山，楊章旗

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)局馬尾松工程技術(shù)研究中心/廣西馬尾松工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530002）

馬尾松谷胱甘肽過氧化物酶PmGPX基因的克隆及表達(dá)分析

陳 虎，賈 婕，羅群風(fēng)，吳東山，楊章旗

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)局馬尾松工程技術(shù)研究中心/廣西馬尾松工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530002）

克隆獲得馬尾松Pinus massoniana PmGPX基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及在不同抗蟲材料表達(dá)模式分析。在前期馬尾松轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得該基因片段基礎(chǔ)上，用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得基因全長，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)分析該基因在不同抗蟲材料中的表達(dá)模式?？寺～@得基因cDNA全長序列，命名為PmGPX。該基因包含741 bp開放閱讀框，編碼246個(gè)氨基酸。序列分析表明：該基因具有GPX家族典型的保守結(jié)構(gòu)域，等電點(diǎn)PI 8.29，蛋白分子量27.08 kDa，與針葉植物北美云杉Picea sitchensis的同源性較高，為91%。與單子葉和雙子葉植物同源性較差，大部分在64%～80%，而在GPX家族典型保守結(jié)構(gòu)域的同源性較高，為82%～100%。qRT-PCR技術(shù)分析表明：PmGPX在所有組織中均有表達(dá)，在針葉中表達(dá)量最高，嫩葉的表達(dá)量是根的33.45倍，在根、花和球果中的表達(dá)量較低，不同材料日表達(dá)模式相似，總體上隨時(shí)間出現(xiàn) “升—降—升”模式。該基因在抗蟲材料中啟動(dòng)較早，且表達(dá)量高于對(duì)照。推測(cè)該基因參與了馬尾松抗蟲防御體系。圖5參29

林木育種學(xué)；馬尾松；谷胱甘肽過氧化物酶；PmGPX基因；克隆與表達(dá)

Abstract:The study PmGPX genes was played a role in Pinus massoniana insect resistance,that the great significance for in-depth insect-resistant resistance mechanism in Pinus massoniana.PmGPX,a cDNA region encoding glutathione peroxidase,was cloned in the transcriptome sequencing analysis of one insect-resistant material in Pinus massoniana.Analyses included an amino acid sequence and an expression （qRT-PCR）analysis.Results showed that the total length of open reading frame （ORF） was 741 bp encoding 246 amino acids.The amino acid sequence analysis showed three high conservative character fields of the GPX gene family for this gene.The isoelectric point of PmGPX was PI 8.29,and the protein molecular weight was 27.08 kDa.In genetic clustering,compared with some other plants,PmGPX showed a higher homology with Picea sitchensis （91%）but a low homology with other monocots and dicotyledonous plants （64%－80%）.However,homologies of the three typical conservative GPX family domains（G1,G2,G3）reached a higher level with other plants （82%－100%）.The expression analysis indicated that PmGPX was expressed in all kinds of tissues with higher expression levels in leaves （P＜0.01）,especially in young leaves （33.45 times more than the expression level in roots）.Daily expression patterns were same in different insect-resistant materials and showed up-down-up-regu-lated trend the day.In insect-resistant material,expression of PmGPX reached a higher point earlier than that of control （P＜0.05 in old leaves and tender stem）.The expression analysis also indicated that PmGPX was involved in the insect-resistant defense system of P.massoniana.This study laid a foundation for further analysis of the PmGPX biological function and its role in insect-resistant defense with Pinus massoniana.［Ch,5 fig.29 ref.］

Key words:forest tree breeding;Pinus massoniana;glutathione peroxidase;PmGPX;cloning and expression analysis

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPXs）是一種重要的過氧化物分解酶，能清除活性氧，阻止脂膜氧化，起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的作用，具有重要的生理功能［1］。自CRIQUI等［2］從煙草Nicotiana tabacum中獲得GPX基因后， 先后從柑橘Citrus［3］， 番茄Lycopersicon esculentum［4］， 水稻Oryza sativa［5］， 香蕉 Musa nana［6］， 荷花 Nelumbo nucifera［7］， 棗 Ziziphus jujube［8］等植物中獲得 GPX 基因。 近年來，對(duì)于植物GPXs的研究主要集中在生物脅迫和非生物脅迫（如高溫、低溫、干旱、重金屬毒害、耐鹽等）方面，尤其是GPXs在非生物脅迫中的功能作用，證實(shí)了GPX基因與植物抗逆性緊密相關(guān)。在非生物脅迫下，GPX基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，參與相關(guān)氧化還原途徑［9］。如蘋果Malus MdGSTU1提高蘋果的耐鹽能力［10］，過量表達(dá)NtGPX基因提高煙草的抗凍性［11］，番茄LePHGPX基因的過量表達(dá)提高植株耐高溫能力［12］。研究人員對(duì)擬南芥Arabidopsis thaliana GPX基因的功能研究取得較大進(jìn)展，新的GPX被不斷發(fā)掘（擬南芥目前已知8個(gè)），對(duì)其中7個(gè)GPX基因的研究證實(shí)，全部對(duì)非生物脅迫有應(yīng)答反應(yīng)，轉(zhuǎn)基因可提高植物抵御脅迫的能力［13］，如AtGPX3能顯著增強(qiáng)植株的抗旱性［14］，AtGPX1具有抗高溫下的氧化脅迫能力［15］。目前雖有多種植物GPX基因被發(fā)現(xiàn)，并開展相關(guān)功能研究，但主要集中于單子葉和雙子葉植物，對(duì)裸子植物的研究較少。馬尾松Pinus massoniana屬裸子植物松科Pinaceae松屬Pinus植物，是中國南方重要的用材林樹種［16］，但在馬尾松生長過程中常受到病蟲害的危害，給林業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來嚴(yán)重?fù)p失，制約了馬尾松人工林的健康發(fā)展。本研究在高通量測(cè)序分析基礎(chǔ)上結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，獲得谷胱甘肽過氧化物酶基因，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)研究其不同組織、不同抗性材料、不同時(shí)間表達(dá)模式，為探求馬尾松蟲害防御機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料包括抗蟲馬尾松品種 ‘松韻’ ‘Songyun’和對(duì)照GC101無性系，材料選自廣西馬尾松桐棉種源，采自廣西馬尾松種質(zhì)資源庫。該庫栽植于2007年，樹齡8年生，栽植株行距為4 m×4 m，根、莖、葉、花、果采自普通馬尾松無性系，雌雄球花樣品采自2015年2月，其他組織采自2015年4月。日變化葉和莖的材料采自2015年5月，采樣時(shí)間分別在當(dāng)日的7：00，10：00，13：00，16：00，19：00，所有樣品采摘后放入液氮中保鮮，帶回實(shí)驗(yàn)室存放于－80℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及PmGPX克隆 實(shí)驗(yàn)所有樣品的RNA采用多酚多糖植物RNA提取試劑盒（天根公司）進(jìn)行提取，具體步驟按說明書進(jìn)行。提取完成后進(jìn)行凝膠電泳檢查質(zhì)量，參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，進(jìn)行凝膠檢查和濃度測(cè)定（采用核酸定量儀）后備用。根據(jù)前期馬尾松轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中PmGPX的部分 cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)獲得的序列在 2端設(shè)計(jì)特異引物，3′端引物（5′-ATGGCATCCTCTTTCGCAGCATCT-3′）， 5′端引物（5′-TGCAGCAAGCAGATTCTGTATATCC-3′）。 以不同組織等量混合cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)定退火溫度為56.0℃，具體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增體系和參數(shù)參照Taq DNA聚合酶說明書進(jìn)行操作，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢查獲得目的條帶后，用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，連接、轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR檢查正確后測(cè)序。

1.2.2 序列分析 采用在線SOSUI和Plant-mPLoc亞細(xì)胞定位，利用Proteomics Server，SignalP 4.1 Server，SOPMA，TargetP 1.1 Server，DAS軟件分析基因等電點(diǎn)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性和跨膜結(jié)構(gòu)，利用Motif Scan和SMART分析基因的功能結(jié)構(gòu)域。將PmGPX基因完整氨基酸序列在美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行覆蓋率和同源性比較，利用DNAMAN軟件構(gòu)建PmGPX與其他植物的進(jìn)化樹。

1.2.3 基因表達(dá)模式分析 根據(jù)馬尾松內(nèi)參基因篩選結(jié)果［17］，利用UBI4基因和CYP基因作為內(nèi)參基因，內(nèi)參引物分別為UBI4F:AGCTCCGACACCATTGATAA，UBI4R:CCAAAGTACGTCCAT CTTCCA，CYPR:CAAGGGTTCGTCGTTCCAC，CYPF:GGCAAACTTCTCGCCGTA，同時(shí)設(shè)計(jì)PmGPX基因引物，PmGPX1F:TCAAACTCCCCGTCTTATGG，PmGPX1R：GCTCCAACTGAATCCT TGC。 參照 SYBR Premix Ex TaqⅡ（Prefect real-time）試劑盒，構(gòu)建qRT-PCR體系和擴(kuò)增程序，其中退火為58℃，采用45個(gè)循環(huán)作熔解曲線。設(shè)生物學(xué)重復(fù) 3 個(gè)·樣品－1， 根據(jù) 2－ΔΔCt法［18］計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因全長獲得

對(duì)馬尾松不同抗蟲材料高通量測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有個(gè)基因在抗蟲材料中大量表達(dá)（log2.Fold_1.1491），該基因在KEGG代謝途徑中只參與谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）和花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）途徑。這2個(gè)途徑中只有該基因上調(diào)表達(dá)，通過對(duì)序列在NCBI進(jìn)一步比對(duì)，確定為谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase）基因。通過進(jìn)行擴(kuò)增、比對(duì)，獲得了該基因完整開放閱讀框（ORF）序列，命名為PmGPX。該基因完整開放閱讀框（ORF）共包括741 bp，編碼246個(gè)氨基酸（圖1）。

圖1 PmGPX基因cDNA序列及氨基酸序列Figure 1 cDNA and amino acid sequence of PmGPX

2.2 PmGPX基因序列分析

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)PmGPX編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：該基因不含信號(hào)肽，有6個(gè)絲氨酸（Ser）和1個(gè)色氨酸（Try）磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)糖基化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中：α-螺旋占30.49%，隨機(jī)卷曲占38.62%，延伸鏈占20.33%，β-轉(zhuǎn)角占10.57%；該基因等電點(diǎn)為8.29，蛋白分子量為27.08，在113～117個(gè)氨基酸處存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位于葉綠體。

對(duì)PmGPX蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域顯示，具有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，4個(gè)N-?；稽c(diǎn)，2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn)，二硫鍵氧化還原酶結(jié)構(gòu)域、硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域、固氮鐵蛋白、抗氧化蛋白AhpC/TSA家族結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽過氧化物酶結(jié)構(gòu)域，以及谷胱甘肽氧化酵素活性部位和信號(hào)位點(diǎn)（圖1）。

2.3 PmGPX蛋白同源性及進(jìn)化

PmGPX核酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，序列同源性在62%～100%，相似度在74%～94%，與白云杉Picea glauca和北美云杉Picea sitchensis相似度最近，與葡萄Vitis vinifera，煙草，龍眼Dimocarpus longan等植物相似度為74%～78%。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，序列同源性在64%～100%，除與北美云杉相似度在91%外，與其他相似度為58%～81%，大部分為64%～80% ，與山崳菜Eutrema yunnanense，亞麻芥Camelina sative，菜豆Phaseolus vulgaris的相似度低，總體上除與針葉類同源性較高外，其他都較低。但對(duì)谷胱甘肽過氧化物酶保守域同源性比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，PmGPX氨基酸序列與其他植物具有很高的同源性，特別是在3個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域G1，G2，G3高度保守，PmGPX構(gòu)成GPX催化三聯(lián)體的3個(gè)氨基酸（Cys119，Gln150，Trp209）， 具有植物 GPX 蛋白活性中心的3個(gè)保守半胱氨酸（Cys）殘基 Cys119，Cys148，Cys167（圖2）。

圖2 PmGPX氨基酸序列比對(duì)Figure 2 Multiple sequence alignment of amino acid of the PmGPX proteins isolated

采用鄰接法（neighbor-joining method）對(duì)20個(gè)植物的GPX基因構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系樹，馬尾松與北美云杉聚為一類，并且與大葉藻的同源關(guān)系較近，與山崳菜，亞麻芥，菜豆，無油樟Amborella trichopoda，小米Setaria italica和玉米Zea mays的同源關(guān)系較遠(yuǎn)。推測(cè)馬尾松PmGPX基因與針葉植物，尤其是與云杉的該基因在進(jìn)化過程是相似的，而與其他植物則存在較大差異，單子葉植物玉米、香瓜Cucumis melo同源關(guān)系較遠(yuǎn)，雙子葉植物間相對(duì)的分化較?。▓D3）。

2.4 PmGPX基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)根、莖、葉、花、果中PmGPX基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析表明，PmGPX基因在所有組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯的差異。PmGPX基因主要表達(dá)于針葉和莖中，在針葉中的表達(dá)量要高于其他組織，在嫩葉中的表達(dá)量為根中表達(dá)量的33.45倍，針葉成熟度的不同表達(dá)量差異也明顯，嫩葉中表達(dá)量是成熟葉的2.72倍。PmGPX基因在不同成熟莖中的表達(dá)量差異不明顯，雖僅次于在葉中的表達(dá)量，但相差11.04倍，在根、雌雄花、果等4個(gè)組織中的表達(dá)量相差不大，表達(dá)量均較少（圖4）。

為進(jìn)一步研究PmGPX基因在不同材料1 d內(nèi)的變化模式，采用qRT-PCR進(jìn)行分析,結(jié)果如圖5所示。在嫩葉和老葉中，2個(gè)材料PmGPX基因表達(dá)變化趨勢(shì)相似，都是 “升—降—升”模式。在嫩葉中抗蟲材料在10：00時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，是7：00表達(dá)量的2.65倍，而對(duì)照中該基因從7：00－16：00的表達(dá)量變化不大，只有到19：00時(shí)才達(dá)到峰值。老葉中2種材料的表達(dá)規(guī)律一致，不同的是PmGPX在抗蟲材料中的表達(dá)要高于對(duì)照，在13：00時(shí)表達(dá)量要高于對(duì)照。從莖中的表達(dá)模式分析，PmGPX在不同成熟莖和不同抗性材料中的變化趨勢(shì)一致，隨時(shí)間推移，表達(dá)量不斷上升。不同的是在嫩莖中前4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，2種材料的表達(dá)量基本相同，在19：00時(shí)抗蟲材料的表達(dá)量才出現(xiàn)明顯的上升。而在老莖抗蟲材料中PmGPX的表達(dá)量始終高于對(duì)照，在13：00時(shí)兩者的表達(dá)量相差3.48倍。

圖3 PmGPX與其他GPX氨基酸序列的聚類分析Figure 3 Amino acid sequences cladogram analysis between PmGPX and other GPX

圖4 馬尾松PmGPX基因在不同組織的表達(dá)Figure 4 Expression of PmGPX gene in different organs by fluorescent quantitative RT-PCR

3 討論

在馬尾松抗蟲材料轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異分析發(fā)現(xiàn)，在谷胱甘肽代謝存在唯一大量上調(diào)表達(dá)的基因，并且參與了花生四烯酸代謝途徑，通過克隆比對(duì)確定為谷胱甘肽過氧化物酶基因，命名為PmGPX。該基因與針葉植物云杉同源性較高，在谷胱甘肽過氧化物酶保守域與其他植物同源性也較高，說明植物GPX基因在進(jìn)化過程中雖然N端序列發(fā)現(xiàn)了改變，但在GPX基因功能結(jié)構(gòu)域中的變化不大。另外，在PmGPX序列具有GPX中3個(gè)保守的特征性結(jié)構(gòu)域，及GPX蛋白活性中心的3個(gè)保守半胱氨酸（Cys）殘基。目前已知的植物GPX的活性位點(diǎn)由Cys作為催化殘基來代替動(dòng)物體內(nèi)的硒代半胱氨酸［6,19］，馬尾松PmGPX也在Cys119處替代了動(dòng)物PHGPXs中的硒代半胱氨酸殘基，進(jìn)一步證明PmGPX是GPX的家族成員。

PmGPX存在二硫鍵氧化還原酶結(jié)構(gòu)域、硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽過氧化物酶結(jié)構(gòu)域等功能結(jié)構(gòu)域，在植物體內(nèi)GPXs是含有巰基的過氧化物酶類，通過催化GSH來減少過氧化氫或有毒化合物，起到解毒和保護(hù)細(xì)胞免受破壞［20－21］。

MILLA等［13］推測(cè)擬南芥中的GPX基因分布于3條染色體上，定位在葉綠體、線粒體、胞質(zhì)等亞細(xì)胞器中，如AtGPX2定位于細(xì)胞質(zhì)。本研究PmGPX預(yù)測(cè)定位于葉綠體中，推測(cè)AtGPX1與抵御光氧化脅迫有關(guān)。活性氧在植物細(xì)胞代謝中主要來源于葉綠體、線粒體，亞細(xì)胞定位與功能有直接關(guān)系，馬尾松PmGPX發(fā)揮的作用可能與光合或產(chǎn)生活性氧有關(guān)。

圖5 熒光定量PCR檢測(cè)PmGPX基因不同抗蟲材料的表達(dá)Figure 5 Expression of PmGPX gene in resistant and susceptible varieties of Pinus massoniana by qRT-PCR

本研究中馬尾松PmGPX在所有組織中均有表達(dá)，與已有研究結(jié)果一致，說明PmGPX在馬尾松生長過程中起到清除細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的作用［13］，但PmGPX基因在葉和莖中的表達(dá)最高，這與擬南芥［13］和油菜Brassica napus［22］的研究結(jié)果一致，而香蕉MaGPX在花和根中表達(dá)量較高［6］，白菜 Brassica pekinensis BrGPX6a在早期子葉胚中的表達(dá)量較高，在成熟胚中表達(dá)較低［23］。不同植物或同一植物GPX在不同組織中的表達(dá)均有所差別，可能與不同組織中活性氧的分布有關(guān)聯(lián)［7,13,24］。由于PmGPX基因在葉中，尤其是嫩葉中的表達(dá)量最高，而在雌雄花和根中表達(dá)量極低，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因亞細(xì)胞定位于葉綠體的可能。

PmGPX基因在不同抗性材料同一組織中的表達(dá)模式基本一致，主要區(qū)別在于抗性品種PmGPX基因表達(dá)量始終高于對(duì)照，并且隨時(shí)間延長，表達(dá)量提升速度和達(dá)到峰值的時(shí)間均比對(duì)照要早。從選出的抗逆性材料來看，耐鋁小麥Triticum sestivum和水稻品種，在受到鋁脅迫后GPX活性明顯提高，而對(duì)照則出現(xiàn)下降趨勢(shì)［25-26］，同樣耐鹽品種在鹽脅迫下，本身含有或能夠迅速提高植株的抗氧化能力，對(duì)照則較低［27］。從非生物脅迫下，香蕉MaGPX在鹽、干旱等脅迫下表達(dá)量上升［7］，擬南芥AtGPX1表達(dá)量的上升，會(huì)提高抵御光氧化脅迫［15］。

目前，有關(guān)GPX基因在植物抗蟲功能的研究還較少，馬尾松PmGPX基因在抗蟲材料中的高表達(dá)，現(xiàn)有研究表明：植物中GSH合成和酶活性提高，能夠增加植物對(duì)多種脅迫的抵抗能力，相反在環(huán)境脅迫下GPXs的mRNA水平也會(huì)提高，在谷胱甘肽代謝中GPX基因表達(dá)量提高，能夠提高氧化谷胱甘肽量，從而轉(zhuǎn)化成GSH， 提高植物抵御環(huán)境脅迫的能力［28-29］。馬尾松PmGPX在抗蟲材料中高表達(dá)，提高了防御蟲害的能力，另外，PmGPX基因在抗蟲材料花生四烯酸代謝中高量表達(dá)，推測(cè)該基因可能提高該途徑15-oxoETE和5-oxoETE代謝物含量，從而提高丙酮含量，提高了防御抗蟲的能力，但通過何種信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與來起作用［14］，有利于抵御蟲害次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生，起到抗蟲效果還有待進(jìn)一步研究。

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Cloning and expression analysis of the PmGPX gene encoding glutathione peroxidase in Pinus massoniana

CHEN Hu,JIA Jie,LUO Qunfeng,WU Dongshan,YANG Zhangqi
（Engineering Research Center of Masson Pine of State Forestry Administration/Engineering Research Center of Masson Pine of Guangxi,Guangxi Forestry Research Institute,Nanning 530002,Guangxi,China）

S791.2

A

2095-0756（2017）05-0856-08

2016-07-05；

2016-09-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31660219）；廣西 “八桂學(xué)者”專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2011A015）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014GXNSFBA118104）

陳虎，高級(jí)工程師，從事林木遺傳育種研究。E-mail:chenhubeijing-2008@163.com。通信作者：楊章旗，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，從事林木遺傳育種研究。E-mail：yangzhangqi@163.com