周祎 蔣馥蔓 王子蓮

(中山大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科胎兒中心，廣東 廣州 510080)

胎兒單基因遺傳病的無創(chuàng)檢測技術研究進展

周祎 蔣馥蔓 王子蓮

(中山大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科胎兒中心，廣東 廣州 510080)

1 單基因病和NIPT技術(non-invasive prenatal test)

單基因疾病(monogenedisease)是指由一對等位基因控制的疾病或臨床病理表現(xiàn)，即按照孟德爾方式傳遞的疾病，也稱孟德爾遺傳病(medeliandisease)。根據(jù)致病基因所在染色體的不同可將單基因病分為常染色體遺傳病、性染色體遺傳病和線粒體遺傳病，性染色體遺傳病包括X染色體遺傳病和Y染色體遺傳病。根據(jù)致病基因表現(xiàn)型的不同可將單基因分為顯性遺傳病和隱性遺傳病。截止到2017年1月20日，OMIM(online medelian inheritance in man)數(shù)據(jù)庫已收入單基因病8000多種，遺傳發(fā)病機制明確的單基因病近5000種。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全球出生人口所有單基因病的發(fā)病率約為10/1000，常見的單基因病有地中海貧血、鐮狀細胞貧血、血友病、囊胞性纖維癥、脆性X綜合征、亨廷頓舞蹈病、軟骨發(fā)育不全、苯丙酮尿癥、G6PD缺乏癥等。單基因病大多沒有治愈方法，并且治療成本高，因此進行產(chǎn)前遺傳檢測是預防患單基因病以及提前進行臨床干預的主要方法。

檢測胎兒單基因遺傳病最為直接的方法是獲取胎兒組織或細胞進行檢測。臨床上常用的方法是通過絨毛膜取樣和羊膜穿刺獲取胎兒細胞進行產(chǎn)前診斷，但這兩種方式均為有創(chuàng)取樣，會伴隨一定的流產(chǎn)風險[1]。此外，羊膜穿刺一般在妊娠中期進行，可能會拖延后續(xù)的臨床干預[2]。孕婦外周血中，胎兒游離DNA(cell free fetal DNA, cfDNA)的發(fā)現(xiàn)[3]，使胎兒遺傳病無創(chuàng)檢測有了理論可能性。NIPT是基于胎兒游離DNA進行胎兒遺傳病無創(chuàng)檢測的成功應用，NIPT檢測范圍是胎兒染色體異常情況，檢測的分辨率處在染色體水平和較大片段的缺失重復，而對于點突變或者小片段的缺失重復等單基因病的致病變異無法進行準確的檢測[5,6]。

利用胎兒游離DNA進行單基因病的檢測技術發(fā)展主要受制于3個因素。首先，根據(jù)單基因病的遺傳特點，不同類型的單基因病致病原因的復雜程度不同，因而檢測的策略各有差異；第二，母體外周血中胎兒游離DNA含量很低(10%左右)[4,7]，母親自身的游離DNA給檢測帶來很大的背景噪聲，從而使得母源性變異無法進行檢測；第三，低濃度的胎兒游離DNA會導致無法檢出結果或造成假陰性與假陽性結果等。隨著檢測技術的發(fā)展，近年來單基因病無創(chuàng)檢測技術有了飛快的發(fā)展，即胎兒染色體非整倍性無創(chuàng)檢測技術的成功應用之后，將成為研究和臨床領域下一個技術突破點。

2 非母親來源的變異檢測

在母體外周血DNA中，找到與母親自身攜帶的遺傳信息不同的序列或變異信息，可以直接或間接地檢測出胎兒的遺傳變異情況。父源特異性的非致病序列可以作為遺傳檢測的標記物，可用于排除某些性別連鎖的單基因遺傳病。父源特異性的致病序列以及胎兒新發(fā)遺傳變異的檢測可以直接用于胎兒單基因病遺傳分析。

2.1 父源變異檢測-性染色體檢測策略 胎兒cfDNA的發(fā)現(xiàn)是在母體血漿中發(fā)現(xiàn)了胎兒來源的Y染色體片段[3]。因此父源特異性變異檢測是cfDNA用于胎兒遺傳病檢測的早期探索應用。檢測Y染色體特有的基因或者遺傳序列，一方面用于性別判定，一方面用于檢測性染色體連鎖的單基因遺傳病。采用PCR技術通過檢測母親外周血中的Y染色體特異基因SRY或DSY14獲取胎兒性別[10]。如果胎兒是女胎則可以排除諸如血友病的X染色體連鎖隱性遺傳病。而在NIPT中，定量檢測Y染色體片段含量，除了性別判斷之外，還可以估算出母體血漿中胎兒游離DNA的濃度[11]，而這一指標是影響單基因病無創(chuàng)檢測技術發(fā)展的一個重要因素。此外，有研究利用X染色體上的父源特異性短串聯(lián)重復序列作為遺傳標記物來獲取女胎遺傳信息[12]。

2.2 父源變異檢測-突變基因連鎖SNP檢測策略 除了上述針對性染色體遺傳信息進行檢測的策略外，對于常染色體而言，尋找與母親遺傳信息不同的父源特異性變異也是最直接、最早的研究的思路之一。顯性單基因病中，若發(fā)現(xiàn)父源變異信息，則可以判斷為患病胎兒。隱性單基因病中，若未發(fā)現(xiàn)父源特異性變異信息，則可以排除胎兒患病或者患兒為重癥患兒的情況[13]。另一方面，若父親和母親攜帶相同變異，還可以通過尋找與父源變異連鎖的SNP來檢測胎兒是否攜帶父源變異，進而對胎兒患病情況進行判定[15]。Ding等[14]利用與HBB突變連鎖的父源特異性SNP位點檢測胎兒游離DNA中父親來源的變異。父母雙方的SNP位點信息充足的情況下，父親來源的HBB突變與rs2187610snp位點的連鎖關系被確定，采用SABER方法可以檢測出SNP位點連鎖的HBB突變，進而確定胎兒的單倍體型，該方法可以排除重型β-地中海貧血突變。特點是無論父母雙方是否攜帶同一種HBB突變，都可以通過與HBB連鎖的SNP位點來排除父源性的突變，進而排除胎兒患重型β-地中海貧血突變的可能。局限在于需要更多地發(fā)現(xiàn)與HBB突變連鎖的特異性SNP位點來保證檢測的適用性和準確度。

全基因組深度測序?qū)μ簡位蜻z傳病進行檢測的方法拓展了這個策略的應用，Lo等[15]選擇父親雜合母親純合的SNP位點進行母體血漿中父親來源的等位基因檢測。如果母體外周中檢測到父親特異性的等位基因可以確定胎兒遺傳了父源特異性基因，如果未檢測到則可以推斷胎兒遺傳了父母同型等位基因。該方法的特點是SNP位點在全基因組范圍內(nèi)分布，并且通過一種二項分布建模(binomial mixture model)提高了檢測的準確率。

2.3 胎兒新發(fā)變異檢測胎兒新發(fā)變異的檢測策略 與父源特異性變異檢測的思路一致，都是檢測母親自身不存在的變異信息。傳統(tǒng)的PCR技術以設計針對特定變異類型的探針為基礎，并不能準確檢測出胎兒新發(fā)變異。高通量測序技術使得獲取胎兒全基因組信息成為可能，但是由于新發(fā)變異率很低以及高通量測序中存在的錯誤率，胎兒新發(fā)變異的檢出率和檢測效果并不理想[16]。Lo等[15]通過提高全基因組的測序深度結合多步過濾假陽性突變的生物信息學分析方法提高了胎兒新發(fā)變異檢測準確度和敏感度。

檢測非母源性變異和特異序列的策略，通過簡單的PCR技術即可進行檢測，其應用范圍在本質(zhì)上屬于定性檢測的范疇，并且檢測建立在已知特異性標記序列或變異的基礎上。進行單基因病無創(chuàng)檢測受到胎兒cfDNA濃度的影響，而無論是父源特異性變異還是胎兒特異性變異的定量，均和胎兒游離DNA含量直接相關，因此可能會因為胎兒濃度過低，而導致檢測錯誤[4,6]。另外，利用父源特異SNP進行檢測的策略中，需要提前獲取與父源特異突變連鎖的SNP位點，并且需要足夠多的SNP位點信息來排除PCR和測序過程中出現(xiàn)的錯誤，以及因胎兒cfDNA含量過低導致的檢測失敗[4,13,14]。

3 母親來源的變異檢測

檢測胎兒游離DNA是否母親來源的變異難度很大。首先，區(qū)分母親自身的DNA與胎兒游離DNA中母親來源的DNA，尚無特定的分子標記進行區(qū)分；其次，孕婦外周血中，母親自身的DNA片段高達90%，而胎兒游離DNA占比僅為10%左右[5]，無法采用檢測特異性突變的方式獲得準確的結果。基于NIPT的理論基礎，主要采用定量檢測策略，通過構建胎兒的單倍體型，進而判定胎兒是否攜帶了母親來源的變異。目前主要的策略有3種：RMD策略[17]、RHDO策略[18，19]和GRAD策略[15]。

3.1 RMD策略 RMD策略是相對突變劑量(relative mutation dosage)檢測方法的簡稱。該方法是在用于NIPT檢測中的RCD法[18]的基礎上的延伸，其原理見圖1所示。通過計算突變等位基因和野生型等位基因的比率進而計算出母親和胎兒對外周血游離DNA的貢獻。比如，母體外周血含有100個基因組當量(GE)，其中胎兒游離DNA占10%，那么母親來源的游離DNA為90GE，假設母親的基因型為MN，如果胎兒基因型為NN，那么，母親本身對等位基因M和N的貢獻均為90個拷貝，而胎兒對等位基因N貢獻為20，進而可以計算出M/N=9∶11。通過比較等位基因M和N的相對劑量可以獲得胎兒的單倍體型信息。Lun等[15]在2008年首次介紹了RMD策略結合序貫概率比(SPRT)計算的方法，成功檢測出β-地中海貧血HBB基因兩種突變的信息。該研究中利用的是dPCR技術，除了RMD策略，還開發(fā)了一種cfDNA富集方法——核酸片段選擇，用于解決胎兒游離DNA濃度過低問題。該方法受限于dPCR的高成本和設計特異性探針的復雜性，在臨床推廣應用中具有一定的局限性；但是該方法的策略思路及其在胎兒游離DNA片段富集的成功探索為后續(xù)的研究提供了基礎。

圖1 RMD策略原理示意圖[17]

3.2 RHDO策略 RHDO(relative haplotype dosage) 是對胎兒所遺傳的父母雙方的單倍體型劑量進行相對定量分析的方法[2,16,17]。其原理如圖2所示。選取父母雙親的SNP位點用來構建兩組不同的單倍體型(HapⅠ和HapⅡ)，其中父親的基因型為純合，母親的基因型為雜合。胎兒所遺傳的單倍體型，一半來自父親，一半來自母親。在母親外周血中，母親自身的單倍體型為雜合，而胎兒的單倍體型則有雜合和純合兩種情況。胎兒單倍體型為純合時，母體血漿中HapⅠ和HapⅡ的劑量會出現(xiàn)不平衡。那么通過 SPRT(sequential probability ratio test)序貫概率比檢驗計算母體外周血中HapⅠ和HapⅡ的相對含量，則可以推斷出胎兒的遺傳信息。

Lo等[16]利用高通量測序?qū)δ阁w外周血游離DNA進行檢測，證明了在母體血漿中檢測胎兒全基因組以及檢測胎兒單基因遺傳病的可行性。該研究選取了攜帶兩種不同類型β-地中海貧血突變的夫婦，檢測其胎兒的遺傳情況。其中父親來源的變異利用父源特異性SNP進行檢測，而母親來源的變異則采用RHDO策略進行檢測。采用這種胎兒全基因組檢測的方法進行單基因病的無創(chuàng)檢測的前提是已知父母的變異類型以及特異性的SNP位點。在這項概念驗證研究中，母親的單倍體型是通過胎兒絨毛膜取樣獲得胎兒遺傳物質(zhì)而獲取的，在實際臨床應用中則需要通過家族先證者的遺傳信息或者來自數(shù)據(jù)庫中的已知信息來解決這一問題。只利用了基因組區(qū)域中父親純合而母親雜合的等位基因SNP位點，對由于始祖效應或近親婚姻導致的父母雙方致病基因區(qū)域單倍體型結構非常相似的情況卻沒有提及。并且檢測的分辨率還受到測序深度和胎兒游離DNA濃度的影響，全基因組測序的成本也是限制該方法臨床應用的瓶頸。但是基于全基因組測序RHDO策略相對于前述基于dPCR技術的RMD策略具有一定的優(yōu)勢。一方面，全基因組范圍的檢測使的該技術能夠拓展應用到多種類型的單基因病檢測中。另一方面，利用多個變異構成的單倍體型進行檢測相對于僅檢測一種變異，可以獲得更多的遺傳信息，使的在較低深度下可以獲得檢測結果。

Lam等[17]進一步優(yōu)化了基于高通量測序技術的RHDO策略。該研究先利用dPCR技術獲得了父母雙親的單倍體型信息，進而對目標區(qū)域進行靶向靶向測序，解決了全基因組測序的高成本限制。對父母雙方單倍體型基因上的SNP位點進行分類(type α和type β)，再綜合判斷胎兒是否攜帶了雙親的致病突變位點，解決了父母雙方SNP位點均為雜合時的問題。較之前的檢測分析方法相比，本研究采用的實驗方法和分析流程更加適宜用于臨床檢測，而且成本價格效益更高。

圖2 RHDO策略原理示意圖[4]

3.3 深度測序GRAD策略 GRAD(genome-wide relative allelic dosage) 全基因組相對等位基因劑量是RMD策略思想與全基因組測序技術結合的方法[13]。GRAD策略可以通過深度測序獲得的高質(zhì)量基因組信息直接檢測母體血漿中雜合等位基因的序列信息，進而通過SPRT方法檢測出母體中雜合等位基因的相對含量，從而在原理上與RMD策略相同。而與前述全基因組測序RHDO策略不同的是GRAD無需構建母親的單倍體型，并且高深度全基因組測序?qū)z測的分辨率提升了約90倍。RHDO全基因組測序中檢測出母親來源的單倍體型區(qū)域為7332[16]，而GRAD全基因組測序中檢測出母親來源的雜合SNP為656676[13]。利用該方法成功檢測出心面綜合征胎兒cfDNA中母源性遺傳信息，準確率達到96.8%。此外，該研究對母體血漿采用無PCR擴增的建庫方法，證實母體血漿的游離DNA片段末端具有一定的規(guī)律性特點。某些片段末端傾向性的與胎兒游離DNA或母親游離DNA片段相關，利用這個特點可以進行胎兒DNA濃度的估計。GRAD策略應用受到測序深度、特異性SNP數(shù)量以及胎兒游離DNA濃度的影響。尤其是高深度測序的高成本仍然是其臨床應用的一大限制，但隨著測序成本的降低，這個策略具有明顯的應用優(yōu)勢。另外，無PCR擴增的建庫方法的成功應用，也為三代測序技術(單分子實時測序)在無創(chuàng)單基因病檢測中的應用開啟了研究方向。

4 總結和展望

母體外周血中游離DNA的發(fā)現(xiàn)使無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術有了實質(zhì)性進展，而高通量分子檢測技術，尤其是NGS技術的發(fā)展使NIPT在研究和臨床檢測中實現(xiàn)了廣泛應用。NIPT技術與胎兒cfDNA結合使無創(chuàng)單基因病檢測具有了理論上的可能性。不同于胎兒染色體非整倍性的無創(chuàng)檢測，胎兒單基因病無創(chuàng)檢測對檢測技術、檢測策略的要求更高，技術難點也更多。在技術上，依靠胎兒游離DNA進行單基因病檢測的發(fā)展經(jīng)歷了從普通PCR、qPCR、dPCR、到低深度NGS,再到高深度NGS的過程，未來三代測序技術(單分子實時測序技術)的發(fā)展應用將成為后續(xù)研究的一個方向。而就目前的研究進展來看NGS技術以其通量大、應用靈活、可拓展性好、成本不斷降低等特點，在單基因病無創(chuàng)檢測的臨床應用中具備一定的優(yōu)勢。在檢測策略上，從定性排除發(fā)展到了定量檢測。尤其是對母親來源DNA的檢測從無法檢測，到通過構建單倍體型檢測，發(fā)展到了不依賴單倍體型的檢測方法。檢測范圍從單個突變位點和單個序列擴展到了全基因組的范圍。因此，胎兒單基因病的無創(chuàng)檢測技術將成為未來研究的重點和有望突破的熱點。

[1] Mujezinovic F, Alfirevic Z.Procedure-related complications of amniocentesis and chorionic villous sampling:a systematic review[J].Obstet Gynecol, 2007, 110(3):687-694.

[2] Han DSC, Lo YMD.Non‐invasive prenatal testing of monogenic fetal characteristics by maternal plasma DNA analysis[J].ISBT Science Series, 2015, 10(S1):197-205.

[3] Lo YMD, Corbetta N, Chamberlain PF, et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet, 1997, 350:485 -487.

[4] Chiu RWK, Cantor CR, Lo YMD.Non-invasive prenatal diagnosis by single molecule counting technologies[J].Trends in genetics, 2009, 25(7):324-331.

[5] Chiu RWK, Chan KCA, Gao Y, et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(51):20458-20463.

[6] Peters D, Chu T, Yatsenko SA, et al.Noninvasive prenatal diagnosis of a fetal microdeletion syndrome[J].New England Journal of Medicine, 2011, 365(19):1847-1848.

[7] Lo YM, Tein MS, Lau TK.et al.Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum:implications for noninvasive prenatal diagnosis[J].Am J Hum Genet, 1998, 62:768-775.

[8] Wright CF, Wei Y, Higgins JPT, et al.Non-invasive prenatal diagnostic test accuracy for fetal sex using cell-free DNA a review and meta-analysis[J].BMC Research Notes, 2012, 5(1):476.

[9] Jiang F, Ren J, Chen F, et al.Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test:an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies[J].BMC Medical Genomics, 2012, 5(1):57.

[10] Tang NLS, Leung TN, Zhang J, et al.Detection of fetal- derived paternally inherited X-chromosome polymorphisms in maternal plasma[J].Clin Chem,1999,45:2033-2035.

[11] Chiu RWK, Lau TK, Leung TN, et al.Prenatal exclusion of b- thalassaemia major by examintion of maternal plasma[J].Lancet, 2002, 360:998-1000.

[12] Ding C, Chiu RWK, Lau TK, et al.MS analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids:application to noninvasive prenatal diagnosis[J].Proc Natl AcadSci U S A, 2004, 101(29):10762-10767.

[13] Chan KCA, Jiang P, Sun K, et al.Second generation noninvasive fetal genome analysis reveals de novo mutations, single-base parental inheritance, and preferred DNA ends[J].Proc Natl AcadSci U S A, 2016, 113(50):E8159-E8168.

[14] Kitzman JO, Snyder MW, Ventura M, et al.Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus[J].Sci Transl Med,2012 4(137):137ra76.

[15] Lun FMF, Tsui NBY, Chan KCA, et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(50):19920-19925.

[16] Lo YMD, Chan KCA, Sun H, et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus[J].Science Translational Medicine, 2010, 2(61):61ra91-61ra91.

[17] Lam KWG, Jiang P, Liao GJW, et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma:application to β-thalassemia[J].Clinical chemistry, 2012, 58(10):1467-1475.

[18] Lo YMD, et al.(2007) Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy.Proc Natl Acad Sci USA 104:13116-13121.

R714.53

A

2017-04-30)

編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2017.02.001