莫榮珍，徐樹娟，金 燦，王 偉，季一兵

(中國藥科大學(xué) 理學(xué)院，江蘇 南京 210009)

新型聚合物多孔涂層毛細管開管柱的制備及電色譜研究

莫榮珍，徐樹娟，金 燦，王 偉*，季一兵*

(中國藥科大學(xué) 理學(xué)院，江蘇 南京 210009)

以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為前驅(qū)體制備了新型聚合物多孔涂層毛細管開管(PLOT)柱固定相。通過優(yōu)化聚合反應(yīng)時間、致孔劑比例及交聯(lián)劑比例獲得了色譜性能良好的PLOT柱，掃描電鏡結(jié)果顯示毛細管柱內(nèi)的多孔涂層厚度適中且均勻。在毛細管電色譜模式下，PLOT柱以反相色譜分離機理有效分離了中性、酸性和堿性小分子。人血清白蛋白(HSA)共價結(jié)合的蛋白親和PLOT柱對5對手性對映體實現(xiàn)了較好的分離，且其分離度遠高于HSA修飾的單層聚合物毛細管開管柱。PLOT柱分離烷基苯的日內(nèi)、日間和柱間的相對標準偏差分別小于1.7%、4.8%和7.8%。

多孔涂層毛細管開管柱；毛細管電色譜；人血清白蛋白；手性分離

手性分離是現(xiàn)代藥學(xué)研究的熱點，常用的手性分離方法有手性衍生化法、手性添加法和手性固定相法等。手性固定相法因手性選擇劑用量少、不需衍生化樣品等優(yōu)點而備受關(guān)注。人血清白蛋白(HSA)作為一種常用的蛋白類手性固定相，因具有手性識別位點多、范圍廣的優(yōu)點[1]，常被用于手性藥物分離[2-4]或蛋白-藥物相互作用[5-7]的研究。目前研究中HSA多作為整體柱手性固定相，但分離柱效較低[8-9]。而毛細管開管柱幾乎沒有渦流擴散現(xiàn)象，可有效提高分離柱效，且具備分離速度快、柱滲透性好、制備過程簡單、不易產(chǎn)生氣泡和斷流現(xiàn)象等優(yōu)點[10]。然而相對比表面積小和柱容量低限制了開管柱在手性分離領(lǐng)域中的應(yīng)用。

多孔涂層毛細管開管(PLOT)柱是在毛細管柱內(nèi)涂覆或鍵合上一定厚度的多孔涂層固定相。與其他類型開管柱相比，多孔涂層固定相能更有效地增加開管柱的相對比表面積和柱容量。目前PLOT柱多用于氣相色譜(GC)[11-13]、液相色譜(LC)[14-16]和固相萃取[17-18]等分離領(lǐng)域，在毛細管電色譜(CEC)中的應(yīng)用研究較少。而CEC兼?zhèn)涿毠茈娪?CE)高效性和高效液相色譜(HPLC)高選擇性的雙重優(yōu)點，與PLOT柱聯(lián)用可以提高樣品分析速度、分離柱效和靈敏度，減少樣品用量和分析成本。

常用于制備PLOT柱多孔涂層的材料有金屬骨架[19]、硅膠顆粒[20]等非聚合物和聚合物[21-23]兩大類。研究表明，聚合物材料比非聚合物材料具備更穩(wěn)定的物理、化學(xué)性質(zhì)，表面的官能團更易改性，能滿足更多的分離分析需求。聚合物多孔涂層是通過熱或光引發(fā)的原位聚合反應(yīng)制得，光引發(fā)法反應(yīng)速度快難控制、且需昂貴的特氟龍毛細管柱和特殊的反應(yīng)設(shè)備。熱引發(fā)法反應(yīng)速度慢、操作簡單易行，更適合于PLOT柱的制備[24]。目前文獻中關(guān)于熱引發(fā)制備PLOT柱的步驟過于繁瑣或耗時[23,25-27]，因此探索一種制備簡單且周期短的PLOT柱制備工藝具有重要的研究意義。

本文以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為前驅(qū)體在熱引發(fā)下制備了新型的聚合物多孔涂層毛細管開管柱，該方法經(jīng)濟環(huán)保，簡單易行，有效縮短了PLOT柱的制備周期。與單層聚合物毛細管開管柱相比，新型PLOT柱在CEC模式下對中性、堿性和酸性小分子的分離效果明顯提高，這表明聚合物多孔涂層的引入有效增加了毛細管開管柱的柱容量。本文首次將HSA以戊二醛法共價結(jié)合到PLOT柱中，實現(xiàn)了5對手性對映體的有效分離，為開管柱在手性藥物分離的應(yīng)用提供了參考，具有較好的發(fā)展前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HP3DCE 7100 毛細管電泳儀(美國Agilent公司)，S-3400NⅡ掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ODGC-14B氣相色譜柱溫箱(日本Shimadzu公司)；pHs-25型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(美國Sartorius公司)；SWQ-IA智能數(shù)字恒溫水浴鍋(南京桑力電子設(shè)備廠)。

石英毛細管柱(50 μm I.D.×365 μm O.D.，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；GMA、EDMA、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、正丙醇、1,4-丁二醇、戊二醛、氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、乙苯、丙苯、丁苯(上海阿拉丁試劑有限公司);偶氮二異丁腈(AIBN，上海第四試劑廠)；人血清白蛋白(HSA，美國Sigma公司)；硫脲、苯甲酸類、苯胺類、手性藥物消旋體(南京化學(xué)試劑廠)。其余試劑均為分析純，實驗用水為純凈水。所有試劑使用前經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾。

1.2 蛋白親和PLOT柱的制備

1.2.1毛細管柱預(yù)處理毛細管柱依次用1 mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl溶液沖洗，水沖至中性，氮氣揮干。注入50%(體積分數(shù)) 的γ-MAPS甲醇溶液，柱密封后50 ℃水浴反應(yīng)12 h，甲醇沖洗，氮氣揮干，備用。

1.2.2 PLOT柱的制備精密稱取3.5 mg AIBN，加入一定體積GMA、EDMA、1,4-丁二醇和正丙醇溶液，其中(GMA+EDMA)/(正丙醇+1,4-丁二醇)為35%(質(zhì)量比)，搖勻后通氮除氧，注入預(yù)處理好的毛細管柱內(nèi)，柱密封后60 ℃水浴反應(yīng)一段時間，甲醇沖掉多余反應(yīng)液后沖水，備用。該柱為PLOT柱。

1.2.3蛋白親和PLOT柱的制備將15%的氨水溶液注入PLOT柱內(nèi)，柱密封后40 ℃水浴反應(yīng)5 h，水沖至中性，得氨基柱(NH2-PLOT柱)。用100 mmol/L磷酸鹽溶液(pH 8.0) 配制的10%戊二醛反應(yīng)液避光動態(tài)注入氨基柱5 h，水沖至中性，得戊二醛柱(GA-PLOT柱)。室溫下用100 mmol/L磷酸鹽溶液(pH 4.5) 配制2 g/L的HSA反應(yīng)溶液(含NaCNBH31 g/L)動態(tài)灌注戊二醛柱10 h，用100 mmol/L磷酸鹽溶液(pH 4.5)沖柱2 h，運行緩沖液平衡1 h，得蛋白親和PLOT柱(HSA-PLOT柱)。

1.2.4蛋白修飾的單層聚合物毛細管開管柱的制備根據(jù)參考文獻[28]制備GMA觸須式聚合物毛細管開管柱(GMA柱)，以“1.2.3”方法制備HSA修飾的觸須式聚合物毛細管開管柱(HSA-GMA柱)。

1.3 電色譜條件

毛細管柱使用前用運行緩沖液平衡30 min至基線平穩(wěn)；小分子的檢測波長為210 nm，手性對映體的檢測波長為214 nm；運行電壓為10～30 kV，柱溫為20～30 ℃；柱長為41.5 cm，有效柱長為30 cm。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合反應(yīng)條件的優(yōu)化

表1 不同聚合反應(yīng)時間對PLOT柱滲透性和電滲流的影響Table 1 Influence of polymerization time on the permeability and EOF of PLOT column

experimental conditions：ratio of monomers(GMA-EDMA)：2∶1;ratio of porogens(n-propano-1,4-butanediol)：6∶1;running buffer：10 mmol/L phosphate buffer(pH 7.0);applied voltage：20 kV;injection：2 kV×2 s;EOF marker,thiourea

2.1.1聚合反應(yīng)時間的優(yōu)化聚合反應(yīng)時間在一定程度上會影響聚合物多孔涂層的厚度。為獲得涂層厚度適中的PLOT柱，本實驗以掃描電鏡(SEM)、電滲流(EOF)和柱滲透性(以滲透率K值表示)結(jié)果為依據(jù)，考察了不同聚合反應(yīng)時間對PLOT柱涂層形貌結(jié)構(gòu)和色譜性能的影響。結(jié)合圖1和表1實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著聚合反應(yīng)時間從30 min 延長至50 min，毛細管柱內(nèi)涂層厚度不斷增加(圖1)，電滲流和滲透性降低(表1)。若反應(yīng)時間過短，形成的多孔涂層太薄，不能有效增加柱容量；若反應(yīng)時間太長，形成的涂層過厚，亦不能保持良好的柱滲透性和電滲流。綜合考慮涂層均勻度、柱滲透性和電滲流，選擇聚合反應(yīng)時間為40 min。

圖1 不同反應(yīng)時間制備的多孔涂層掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of polymer porous layer after different polymerization times A.30 min,B.40 min,C.50 min;the other experimental conditions were the same as those in Table 1

表2 交聯(lián)劑比例和致孔劑比例對PLOT柱滲透性和電滲流的影響Table 2 Influence of ratio of cross-linker (GMA-EDMA)and porogens(n-propanol-1,4-butanediol) on the permeability and EOF of PLOT column

*the EOF cannot be measured by bubbles or plugging of capillary column

2.1.2交聯(lián)劑比例的優(yōu)化聚合物反應(yīng)液中單體交聯(lián)劑比例對多孔涂層形貌結(jié)構(gòu)和機械性能的影響較大[29]。本實驗中保持單體交聯(lián)劑與致孔劑的比例不變，考察了不同交聯(lián)劑比例(質(zhì)量比)對PLOT柱性能的影響。結(jié)果如表2所示：當GMA-EDMA為3∶1時制備的PLOT柱滲透性和電滲流較差；當GMA-EDMA為3∶2時制備的PLOT柱多孔涂層較疏松，未能牢固結(jié)合到毛細管柱內(nèi)壁上，導(dǎo)致電滲流不穩(wěn)定；而GMA-EDMA為2∶1時制備的PLOT柱有較好的柱滲透性和穩(wěn)定的電滲流。這可能是由于交聯(lián)劑EDMA含量的增加使多孔涂層的孔徑變小，導(dǎo)致PLOT柱滲透性和電滲流變小。綜合考慮柱滲透性和電滲流，選擇GMA-EDMA(2∶1)制備PLOT柱。

2.1.3致孔劑比例的優(yōu)化本文使用正丙醇和1,4-丁二醇組成的二元致孔劑系統(tǒng)，正丙醇含量增加會使聚合反應(yīng)相分離提早發(fā)生，使得多孔涂層孔徑變大，導(dǎo)致PLOT柱滲透性和電滲流增大[29]。由表2可知，正丙醇含量較低(1∶1、3∶1)時制備的PLOT柱滲透性和電滲流較?。欢己窟^高(9∶1)時，形成的多孔涂層稀疏且不能牢固地結(jié)合到毛細管柱內(nèi)壁上，導(dǎo)致了不穩(wěn)定的電滲流。當正丙醇比例適中(6∶1)時所制備的PLOT柱滲透性較好，電滲流較穩(wěn)定，更適于PLOT柱的制備。

2.2 PLOT柱的電色譜性能研究

2.2.1 PLOT柱分離中性小分子中性小分子在運行緩沖液中不帶電，可用于表征毛細管柱性能。本實驗以烷基苯作為中性小分子的代表研究了PLOT柱的分離機理和分離性能。

為改善烷基苯的分離，在運行緩沖液中添加乙腈作為有機添加劑，考察了不同乙腈濃度對烷基苯分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著乙腈濃度的增加，烷基苯的保留時間和分離度減小，柱效不斷增加。在乙腈濃度為35%時，烷基苯實現(xiàn)基線分離的同時可獲得較高的柱效，繼續(xù)增大乙腈濃度，烷基苯不能實現(xiàn)基線分離。表明乙腈的加入增加了烷基苯的洗脫能力，而烷基苯的洗脫順序為苯、乙苯、丙苯、丁苯，這與其疏水性大小一致。說明烷基苯在PLOT柱內(nèi)的保留機制為反相色譜保留機制。

實驗還考察了運行電壓對4種烷基苯分離的影響，結(jié)果顯示：隨著運行電壓的增加，烷基苯的柱效和分離度呈先增加后減小的趨勢。這可能是隨著運行電壓的升高，烷基苯分子的縱向擴散降低，分離柱效增加，分離度隨之增加。而運行電壓過大會導(dǎo)致焦耳熱效應(yīng)，使色譜峰展寬，烷基苯柱效降低，分離度下降。綜合柱效和分離度，實驗選擇運行電壓為25 kV。

柱溫影響運行緩沖液粘度，從而影響烷基苯的保留和分離。實驗考察了不同柱溫對烷基苯分離的影響，結(jié)果顯示，烷基苯的柱效和分離度隨著柱溫的升高呈先增加后減小的趨勢。當柱溫較低時，烷基苯的分離度和柱效較低。這可能是由于柱溫較低，流動相粘度較大，柱內(nèi)電滲流較小，色譜峰出現(xiàn)展寬和拖尾現(xiàn)象。當柱溫為25 ℃時烷基苯的柱效和分離度最優(yōu)。隨著柱溫進一步升高，PLOT柱內(nèi)的焦耳熱效應(yīng)增加，色譜峰展寬，分離度降低。綜合考慮分離度和柱效，選擇柱溫為25 ℃。

2.2.2 PLOT柱分離荷電小分子為拓寬PLOT柱的分離范圍，實驗考察了PLOT柱對酸性小分子苯甲酸類和堿性分子苯胺類的分離情況。如圖2所示，與單層聚合物毛細管開管柱相比，PLOT柱對苯甲酸類和苯胺類小分子均獲得了更好的分離效果。這說明聚合物多孔涂層固定相的引入可以有效增加毛細管開管柱的比表面積和柱容量，同時也可以提供更多的疏水作用基團，增大了苯甲酸類和苯胺類的分離度。

圖2 苯甲酸類和苯胺類在GMA柱(A，C)和PLOT柱(B，D)的分離色譜圖Fig.2 Separation chromatograms of benzoic acids and anilines on GMA column(A,C) and PLOT column(B,D)experimental conditions for A and B：running buffer：10 mmol/L phosphate buffer(pH 7.0),applied voltage：-25 kV，injection：1 kV×1 s;experimental conditions for C and D：running buffer：20% acetonitrile-10 mmol/L phosphate buffer(pH 6.5),applied voltage：15 kV,injection：10 kV×3 s,applied external pressure：2 bar for D;peak identification：1.3-fluorobenzoic acid;2.m-toluic acid;3.3,4-dichlorobenzoic acid;4.o-phenylenediamine;5.4-chloro-1,2-phenylenediamine;6.p-chloroaniline

2.2.3 PLOT柱的重復(fù)性與穩(wěn)定性以電滲流作為標準考察了PLOT柱涂層的穩(wěn)定性，連續(xù)進樣電滲流標記物10針，每針間沖柱10 min，以電滲流計算進樣精密度的相對標準偏差(RSD)為3.8%，表明PLOT柱的多孔涂層機械性能良好，進樣穩(wěn)定性較好。為考察PLOT柱的分離重現(xiàn)性，以烷基苯類小分子的分離度(Rs)和選擇性因子(α)的RSD作為PLOT柱重復(fù)性和穩(wěn)定性的評價標準。結(jié)果如表3所示：烷基苯Rs和α的日內(nèi)RSD值分別小于1.7%和 0.5%，日間RSD值分別小于4.8% 和2.7%；柱間RSD值分別小于7.8%和3.9%。這表明PLOT柱的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

表3 PLOT柱中烷基苯分離度和選擇性因子的相對標準偏差Table 3 RSDs of resolution and selectivity factor for alkylbenzenes separation on PLOT columns RSD/%

圖3 HSA蛋白親和PLOT柱分離5對手性對映體(A)及色氨酸對映體在HSA-GMA柱(B)與HSA蛋白親和PLOT柱(C)上的分離色譜圖Fig.3 Resolutions of five pairs of enantiomers on HSA-PLOT column(A) and the separation ability of(±)-tryptophan on HSA-GMA(B) and HSA-PLOT(C)running buffer:10 mmol/L phosphate buffer(pH 8.4);applied voltage:15 kV;injection:2 kV×2 s

2.3 蛋白親和PLOT柱的電色譜性能研究

2.3.1蛋白親和PLOT柱的電滲流表征電滲流(EOF)大小在一定程度上可以表征毛細柱內(nèi)壁官能團的鍵合情況。實驗考察了蛋白柱制備過程中每步反應(yīng)后的電滲流。結(jié)果顯示：PLOT柱內(nèi)EOF較小(1.161×10-4cm2·V-1·s-1)，經(jīng)氨水開環(huán)后，氨基質(zhì)子化帶部分正電荷而使EOF降至0.859 4×10-4cm2·V-1·s-1；隨著戊二醛反應(yīng)的進行，覆蓋了柱內(nèi)氨基，電滲流增大；HSA修飾后電滲流明顯增加至2.300×10-4cm2·V-1·s-1，說明HSA成功鍵合到PLOT柱上。

2.3.2蛋白親和PLOT柱分離手性對映體為了研究蛋白親和PLOT柱的手性分離能力，實驗分離了色氨酸、克倫特羅、撲爾敏、普萘洛爾、特拉唑嗪5對手性對映體，結(jié)果如圖3A所示。所有對映體在HSA-GMA中沒有分離跡象(如圖3B)。而在HSA蛋白親和PLOT柱上5對手性對映體均獲得了較好分離，其中色氨酸對映體的分離度為1.72(如圖3C)。這表明聚合物多孔涂層的引入有效增加了HSA的鍵合量和開管柱的手性分離能力。蛋白親和PLOT柱分離色氨酸對映體的柱效分別為37 323和3 680，明顯高于Hage等[8-9]和Hong等[30]制備的蛋白親和整體柱。綜上所述，PLOT柱獨特的涂層厚度有效改善了整體柱縱向擴散和開管柱蛋白鍵合量小的缺點，在手性分離中具有較好的發(fā)展前景。

3 結(jié) 論

本文制備了一種蛋白修飾的新型PLOT柱固定相，聚合物多孔涂層的引入有效增加了毛細管開管柱的柱容量和蛋白配基鍵載量。無論是PLOT柱對中性、酸性、堿性小分子的分離效果，還是蛋白親和PLOT柱對5對手性對映體的分離效果均優(yōu)于單層聚合物毛細管開管柱。此外，蛋白親和PLOT柱的柱效與整體柱相比得到了明顯提高，這為開管柱在手性分離研究方面的應(yīng)用提供了寶貴經(jīng)驗。

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Preparation of a Novel Polymer Porous Layer Open Tubular Capillary Column and Its Electrochromatographic Study

MO Rong-zhen,XU Shu-juan,JIN Can,WANG Wei*,JI Yi-bing*

(College of Science，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

A novel polymer porous layer stationary phase containing the copolymer of glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate(GMA-EDMA) was fabricated, and applied as a porous layer open tubular capillary(PLOT) column.To obtain a suitable capillary for electrochromatography,various conditions including the polymerization time,the ratio ofn-propanol/1,4-butanediol and GMA/EDMA in the polymerization mixture were optimized.Scanning electron microscopy demonstrated a nearly uniform polymer porous layer on the inner wall of the open tubular capillary column.In the capillary electrochromatographic mode,the PLOT column provided the reasonable separation of neutral,acidic and basic small molecules based on a reversed phase mechanism.After immobilizing the chiral selector human serum albumin(HSA),the HSA-PLOT column performed a better chiral recognition for five pairs of enantiomers compared with the single-layer polymer coated open tubular capillary column modified with HSA.The intra-day,inter-day and column-to-column relative standard deviations for alkylbenzenes separated on the PLOT column were less than 1.7%,4.8% and 7.8%,respectively.

porous layer open tubular capillary column;capillary electrochromatography;human serum albumin(HSA);chiral separation

O657.8；TQ460.72

:A

：1004-4957(2017)09-1081-06

2017-02-24；

：2017-04-23

*

：王 偉，博士，研究方向：藥物分析及手性藥物分析，Tel:025-86185150，E-mail：qdhcpu@126.com 季一兵，博士，教授，研究方向：藥物分析新材料與新技術(shù)，Tel：025-86185150，E-mail：jiyibing@msn.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.004