何施逸 鄧志博 王乾力 李韞韜 杜永洪

低強(qiáng)度超聲輻照聯(lián)合氫醌乳膏對(duì)SD大鼠黃褐斑模型的療效觀察

何施逸 鄧志博 王乾力 李韞韜 杜永洪

目的 探討低頻低強(qiáng)度超聲輻照聯(lián)合氫醌乳膏治療SD大鼠黃褐斑病灶的療效，有望為臨床治療黃褐斑提供新的思路。方法 將建模成功的18只SD大鼠黃褐斑模型隨機(jī)分對(duì)照組、氫醌組及低強(qiáng)度超聲輻照聯(lián)合氫醌組（以下簡(jiǎn)稱聯(lián)合組），每組各6只。氫醌組脫毛后均勻涂上氫醌乳膏輕揉至吸收；聯(lián)合組在氫醌組治療基礎(chǔ)上，同時(shí)采用聲強(qiáng)0．32 W/cm2、頻率為42 kHz的超聲輻照12 min；對(duì)照組則保持皮膚暴露，不做任何處理。連續(xù)治療14 d后，觀察各組SD大鼠治療前及治療期間各生理指標(biāo)及斑塊變化趨勢(shì)；比較各組治療后血清、肝臟、皮膚超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）含量。光鏡下觀察各組治療后黑素顆粒的變化。結(jié)果 18只SD大鼠黃褐斑模型均成功建模，各組實(shí)驗(yàn)大鼠治療前及治療期間各項(xiàng)生理指標(biāo)無(wú)明顯變化。聯(lián)合組斑塊面積減少，顏色變淺；氫醌組變化略小。聯(lián)合組及氫醌組治療后SOD活力均較對(duì)照組上升，MDA含量均較對(duì)照組下降；且聯(lián)合組變化更為顯著，與氫醌組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。聯(lián)合組和氫醌組治療后皮膚組織病理圖均可見(jiàn)黑色顆粒減少，其中聯(lián)合組黑色素顆粒呈散在分布；氫醌組黑色素顆粒呈線性分布。結(jié)論 低頻低強(qiáng)度超聲輻照聯(lián)合氫醌乳膏對(duì)SD大鼠黃褐斑病灶的治療效果顯著優(yōu)于單用氫醌乳膏的治療效果。

超聲輻照，低強(qiáng)度；氫醌；黃褐斑；協(xié)同作用；大鼠

關(guān)于黃褐斑發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，其組織學(xué)特點(diǎn)主要表現(xiàn)為表皮中黑素和黑素小體增加，黑素細(xì)胞活性增強(qiáng)［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究［2］表明，在一些不利因素的影響下，正常皮膚的平衡遭到破壞，表皮基底層黑色素細(xì)胞分裂增加，活性增強(qiáng)，黑素形成增加、易行。有學(xué)者［3］認(rèn)為，黃褐斑是皮膚衰老的表現(xiàn)之一，原因是皮膚組織中自由基含量增加，細(xì)胞功能遭到破壞。而超氧化物歧化酶（SOD）作為機(jī)體內(nèi)的一種自由基清除酶，其活性降低，清除氧自由基的能力下降，使脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生過(guò)多。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物。故通過(guò)測(cè)定SOD和MDA含量可間接反映氧自由基在體內(nèi)生成和清除情況，進(jìn)一步反映黃褐斑生成及恢復(fù)情況。隨著超聲醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，超聲作為一種促進(jìn)皮膚藥物滲透的安全治療手段，已受到行業(yè)關(guān)注。研究［4］發(fā)現(xiàn)，低頻超聲具有顯著的空化作用，能破壞角質(zhì)層的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，增加皮膚黏膜通透性，即具有顯著的增透效應(yīng)。江浩波等［5］也證實(shí)超聲波導(dǎo)入氨甲環(huán)酸治療黃褐斑的療效好，安全性高，依從性好，值得臨床推廣。氫醌乳膏是治療皮膚黃褐斑的最有效藥物之一。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建SD大鼠黃褐斑模型，檢測(cè)肝臟和皮膚組織勻漿，以及血清中的SOD活力及MDA含量，推測(cè)借助超聲導(dǎo)入氫醌乳膏對(duì)于治療黃褐斑是否有協(xié)同增強(qiáng)效果，同時(shí)為低頻低強(qiáng)度超聲輻照聯(lián)合外用藥膏應(yīng)用于臨床黃褐斑的局部治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)大鼠黃褐斑模型建立及分組

健康清潔級(jí)、SD大鼠18只，雌性，體質(zhì)量（289．5± 3．2）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，經(jīng)改良蒲春霞等［6］制備黃褐斑大鼠模型方法，于實(shí)驗(yàn)大鼠后腿根部按25 mg/kg肌肉注射黃體酮注射液，1次/d，左右腿交替，連續(xù)注射30 d。待確定建成黃褐斑大鼠模型后，將其隨機(jī)分為低頻低強(qiáng)度超聲輻照聯(lián)合氫醌組（以下簡(jiǎn)稱聯(lián)合組）、氫醌組及對(duì)照組，每組各6只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。

二、材料與儀器

全自動(dòng)樣品快速研磨儀［上海凈信科技（Tissuelyser－24），型號(hào)：7i8s－24］；黃體酮注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，20 mg/1 ml，國(guó)藥準(zhǔn)字：H120233）；0．9%氯化鈉溶液；1 ml帶針注射器；SOD測(cè)定試劑盒（WST－1法，96T，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20160810）；MDA測(cè)定試劑盒（TBA法，96 T，南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20161009）；氫醌乳膏（廣東人人康藥業(yè)有限公司，0．2 g/10 g，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20040088，規(guī)格：10 g×1支/盒）；低頻低強(qiáng)度超聲設(shè)備（蘇州工業(yè)園區(qū)海納科技有限公司），頻率42 kHz，輸出功率0．13～1．27 W/cm2，連續(xù)可調(diào)節(jié)，探頭直徑45 mm。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1．各組處理方法：對(duì)照組正常飼養(yǎng)，保持皮膚暴露，不做任何處理。氫醌組在背部固定區(qū)域待皮膚剃毛后，均勻涂上氫醌輕揉至大概吸收，1次/d。聯(lián)合組先用0．8 ml的1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，在背部固定區(qū)域皮膚（脫毛后）均勻涂抹氫醌乳膏輕揉至大概吸收后，劑量同氫醌組；同時(shí)將預(yù)熱好的低頻超聲探頭放于涂抹氫醌區(qū)域12 min，聲強(qiáng)為0．32 W/cm2，每次累積輻照8 min后用冷水冷卻探頭后繼續(xù)輻照。均連續(xù)治療14 d。每日治療前，觀察各組SD大鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量、進(jìn)食及皮膚黃褐斑病變情況，測(cè)量SD大鼠黃褐斑病灶面積大小變化情況。

2.血清及皮膚肝臟組織勻漿的制備：第14天，將所有實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔麻醉后，迅速剪開皮膚，在心臟部位抽取血液5 ml，離心10 min（3500 r/min）取血清進(jìn)行檢測(cè)；后取肝臟和背部皮膚樣本，用預(yù)冷4℃的0．9%氯化鈉溶液漂洗，除去血液，濾紙拭干后稱質(zhì)量，將組織剪碎，置于勻漿器中加入0．9%氯化鈉溶液，將其研磨成10%的組織勻漿，隨后將勻漿液離心10 min（3500 r/min），取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

3.皮膚病理切片標(biāo)本的制備：在實(shí)驗(yàn)大鼠背部病變部位取1．0 cm×1．0 cm大小皮膚，95%乙醇溶液固定24 h后，10%福爾馬林溶液再固定，然后常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

4.實(shí)驗(yàn)大鼠血清及皮膚和肝臟組織中SOD、MDA含量的檢測(cè)：按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，采用分光光度法測(cè)定樣品管的吸光度值，計(jì)算血清和組織中SOD、MDA的含量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

隨著每日黃體酮注射液的使用，實(shí)驗(yàn)大鼠的毛色逐漸泛黃、粗糙；且30 d后實(shí)驗(yàn)大鼠血清MDA明顯增高，SOD顯著下降，與建模前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)所入選大鼠黃褐斑模型均成功建立。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠建模前后血清SOD及MDA比較（x±s）

一、治療前及治療期間各組實(shí)驗(yàn)大鼠生理指標(biāo)情況

建模期間大鼠精神狀態(tài)良好，進(jìn)食規(guī)律；治療期間，聯(lián)合組大鼠進(jìn)食量減少，體質(zhì)量略有下降。見(jiàn)圖1，2。聯(lián)合組超聲輻照大鼠時(shí)均未見(jiàn)燙傷皮膚。

圖1 治療期間各組實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量變化

圖2 治療期間各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)食量變化情況

二、各組實(shí)驗(yàn)大鼠黃褐斑皮膚病灶變化情況

與治療前對(duì)比，治療第14天，聯(lián)合組的大鼠背部皮膚斑塊面積明顯變小，顏色變淺，氫醌治療組斑塊面積也有變小，但不及聯(lián)合組變化明顯。經(jīng)測(cè)量見(jiàn)表2和圖3～6。

表2 治療前及治療期各組實(shí)驗(yàn)大鼠皮膚斑塊面積變化情況（x±s） cm2

圖3 治療期間各組實(shí)驗(yàn)大鼠皮膚斑塊面積變化趨勢(shì)

圖4 建模后大鼠背部皮膚斑塊（箭頭示）

圖5 聯(lián)合組治療第14天大鼠背部皮膚斑塊（箭頭示）

三、各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清及皮膚和肝臟組織中SOD、MDA含量的比較

治療后，聯(lián)合組和氫醌組血清及肝臟和皮膚組織中的SOD活力均較對(duì)照組升高，MDA含量均較對(duì)照組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。聯(lián)合組與氫醌組血清及肝臟和皮膚組織中的SOD活力比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。見(jiàn)表3。

圖6 氫醌組治療第14天大鼠背部皮膚斑塊（箭頭示）

表3 各組治療后血清及肝臟和皮膚組織中SOD及MDA的含量比較（x±s）

四、各組治療后皮膚病理學(xué)變化情況

光學(xué)顯微鏡下，聯(lián)合組和氫醌組大鼠皮膚組織基底層和棘層的黑色素顆粒數(shù)量均較對(duì)照組減少，其中聯(lián)合組的黑色素顆粒大多呈線性散在分布，氫醌組呈線型密集分布，而對(duì)照組的黑色素顆粒較多且呈層狀分布。見(jiàn)圖7～9。

圖7 聯(lián)合組大鼠皮膚病理圖示棘層和基底層黑色素顆粒（箭頭示）散在分布（HE染色，×100）

圖8 氫醌組大鼠皮膚病理圖示棘層和基底層黑色素顆粒（箭頭示）呈單線型分布（HE染色，×100）

圖9 對(duì)照組大鼠皮膚病理圖示棘層和基底層黑色素顆粒（箭頭示）呈層狀密集分布（HE染色，×100）

討論

黃褐斑是一種臨床常見(jiàn)的獲得性色素代謝異常性皮膚病。在亞洲地區(qū)的中青年女性中發(fā)病率較高，表現(xiàn)為在面部的眼周、額部、顴頰部及口周對(duì)稱性出現(xiàn)黃褐色至深褐色的斑片，界限清楚，該病雖無(wú)明顯自覺(jué)癥狀，但嚴(yán)重影響患者的容貌和心理。近年來(lái)，隨著社會(huì)環(huán)境的變化，生活壓力的增大，黃褐斑的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)［7］。氫醌是目前公認(rèn)治療黃褐斑最有效的藥物之一。氫醌與酪氨酸酶的底物酪氨酸結(jié)構(gòu)相似，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸酶的活性，影響黑色素的形成，還可抑制DNA和RNA復(fù)合體，剝蝕黑素小體，破壞黑素細(xì)胞［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氫醌組治療14 d后血清及肝臟和皮膚組織中的SOD活力顯著高于對(duì)照組，MDA含量顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）；且觀察黃褐斑皮膚組織病理圖發(fā)現(xiàn)，氫醌組皮膚黑色素有所減少，確證氫醌有一定療效。但其存在用藥時(shí)間長(zhǎng)、劑量較大、有刺激性且不穩(wěn)定的缺點(diǎn)［9］。

超聲的空化機(jī)械效應(yīng)在一定強(qiáng)度和輻照時(shí)間范圍內(nèi)能提高細(xì)胞膜通透性，細(xì)胞膜短時(shí)間內(nèi)開放使細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生物質(zhì)交換（即聲孔效應(yīng)），且其作用過(guò)程可逆。通過(guò)低頻超聲對(duì)皮膚產(chǎn)生的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、空化的聲微流作用和輻射壓等，能提供10倍于常規(guī)給藥方法的持續(xù)穩(wěn)定的滲透率，且低頻超聲經(jīng)皮給藥相比靜脈給藥是一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛、感染風(fēng)險(xiǎn)低的給藥途徑，與口服給藥相比具有無(wú)胃腸道降解、無(wú)首關(guān)消除，并能提供長(zhǎng)達(dá)7 d的藥物持續(xù)釋放等優(yōu)勢(shì)［10］。由于皮膚角質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)含水量和氣核均較多，故角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)易產(chǎn)生空泡，從而形成水性通道。藥物及大分子化合物易于通過(guò)這些水性通道。因此，低頻超聲促滲可更有效地提高皮膚特別是角質(zhì)層的通透性，使藥物被動(dòng)擴(kuò)散更為迅速，也使大分子藥物經(jīng)皮促滲成為可能。低頻超聲透皮給藥已被廣泛應(yīng)用于離體實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)，到目前為止，無(wú)論是小分子透皮傳輸還是大分子透皮傳輸均有很多成功的例子，如劉雯等［11］采用絲白祛斑軟膏聯(lián)合超聲波導(dǎo)入治療黃褐斑，研究結(jié)果表明超聲波導(dǎo)入藥物能有效促進(jìn)藥物的滲透吸收，提高治療黃褐斑的有效率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，連續(xù)治療14 d后聯(lián)合組SOD活力較對(duì)照組及氫醌組均顯著增強(qiáng)，MDA含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），且聯(lián)合組與氫醌組血清及肝臟和皮膚組織中的SOD、MDA比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。同時(shí)觀察病理圖發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠表皮基底層及棘層內(nèi)黑素顆粒含量較高，且呈層狀擴(kuò)散分布；氫醌組治療后黑素顆粒減少，靠近角化層成條分布，無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象；聯(lián)合組治療效果最顯著，僅見(jiàn)少量漸斷分布、顏色較淺的黑素顆粒殘留。

臨床上低頻超聲強(qiáng)度的選擇應(yīng)以產(chǎn)生最大的促滲效果，而又不至于燙傷皮膚，產(chǎn)生皮膚損傷為準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采用的超聲強(qiáng)度為0．32 W/cm2，約8 min后探頭開始發(fā)燙，采用冷水循環(huán)降溫，未見(jiàn)實(shí)驗(yàn)大鼠皮膚燙傷。此外，在治療前后實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)食量及體質(zhì)量均略有下降，由此可見(jiàn)0．32 W/cm2對(duì)大鼠黃褐斑的治療是安全可行的。但是，大鼠和人的皮膚略有不同，在臨床上使用超聲促進(jìn)藥物導(dǎo)入皮膚的超聲輻照強(qiáng)度及時(shí)間尚需要進(jìn)一步的討論。張國(guó)良和徐禮鮮［12］從組織學(xué)的角度證明，0．5 W/cm2的低頻超聲在臨床應(yīng)用安全可靠。

綜上所述，低強(qiáng)度超聲輻照聯(lián)合氫醌乳膏治療黃褐斑的療效在實(shí)驗(yàn)室檢查、病理方面均顯著優(yōu)于單純使用氫醌乳膏治療的效果，且安全可行，可為臨床治療黃褐斑提供參考。

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Effect of low intensity ultrasound irradiation combined with hydroquinone ointment on chloasma in SD rats

HE Shiyi，DENG Zhibo，WANG Qianli，LI Yuntao，DU Yonghong
College of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Objective To investigate the effect of using low intensity ultrasound combined with hydroquinone ointment on the treatment of chloasma in SD rats，which is expected to provide a new idea for clinical treatment of chloasma. Methods Eighteen chloasma SD rats were randomly divided into control group，hydroquinone group and low intensity ultrasound combined with hydroquinone group，6 rats in each group.The combined group was irradiated with ultrasound at the intensity of 0.32 W/cm2and frequency of 42 kHz for 12 min，the hydroquinone group was evenly coated with hydroquinone to absorb after the hair removal，while the control group was only exposed the skin without any treatment.The changes of physiological indexes in SD rats were observed before and during the experiment.Plaque images were collected and the change trend was observed.Serum，liver，and skin were removed，and their SOD activity and MDA content were measured.After 14 d continuous treatment，the changes of melanin granules were observed under optical microscope.Results Eighteen SD rats with chloasma were all successfully built. There were no significant changes in physiological indexes before and after treatment among three groups.Plaque area in combined group reduced and became pale，while hydroquinone group did not show obvious changes.After treatment，the activity of SOD was increased，while the content of MDA was decreased in the combined group and hydroquinone group compared with the control group，with the changes being more obvious in the combined group，there was difference（P<0.05）.Pathological observation showed that the number of melanin granules was reduced after treatment，and the distribution of melanin granules was discrete in the combined group and linear in hydroquinone group.Conclusion The effect of using low intensity ultrasound combined with hydroquinone is significantly superior to single hydroquinone on the treatment of SD rats with chloasma.

Ultrasound irradiation，low intensity；Hydroquinone；Chloasma；Synergies；Rat

R-332；R445.1

A

2017－05－31）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81127901）；重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究專項(xiàng)（csct2016jcyjA0098）

400016 重慶市，重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地——重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（何施逸、李韞韜、杜永洪）；重慶醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院（鄧志博、王乾力）

杜永洪，Email：duyonghong＠yeah．net