高琳惠 尹 艷 李 佳 馬玥萌 李文斌 李博文 張夏楠

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069； 2 貴州大學(xué)，貴陽，550025)

基于ITS序列位點(diǎn)特異性PCR鑒別桃仁與苦杏仁

高琳惠1尹 艷2李 佳1馬玥萌1李文斌1李博文1張夏楠1

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069； 2 貴州大學(xué)，貴陽，550025)

目的：對桃仁和苦杏仁進(jìn)行分子鑒定研究，建立基于ITS序列位點(diǎn)特異性的PCR鑒定方法。方法：收集桃仁、苦杏仁樣品，提取基因組總DNA，用ITS通用引物進(jìn)行測序，通過BioEdit軟件進(jìn)行序列比對，根據(jù)特異位點(diǎn)設(shè)計鑒別引物進(jìn)行特異性PCR反應(yīng)，并對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果：基于ITS序列設(shè)計的特異性鑒別引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鑒別研究，在位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)條件考察中，25 μL反應(yīng)體系DNA模板用量適宜范圍為0.05～1 ng，退火溫度在59 ℃時特異性最佳，實(shí)驗建立的方法對不同DNA聚合酶和PCR儀均具有普適性。結(jié)論：該研究設(shè)計的位點(diǎn)特異性引物在一定條件下的PCR反應(yīng)中，桃仁能夠擴(kuò)增出333 bp清晰條帶，而苦杏仁沒有該條帶，從而實(shí)現(xiàn)了桃仁與苦杏仁的快速、準(zhǔn)確鑒別。

桃仁;苦杏仁;ITS;位點(diǎn)特異性PCR;分子鑒定

桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch或山桃P.davidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟種子，性平，味苦、甘，歸心、肝、大腸經(jīng)，具有活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘之功效，用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，肺癰腸癰，跌撲損傷，腸燥便秘，咳嗽氣喘[1]?？嘈尤蕿樗N薇科同屬植物山杏P.armeniacaL.var.ansu Maxim.、西伯利亞杏P.sibiricaL.、東北杏P.mandshurica(Maxim.)Koehne或杏P.armeniacaL.的干燥成熟種子，性微溫、味苦，歸肺、大腸經(jīng)，具有降氣止咳平喘，潤腸通便之功效，用于咳嗽氣喘，胸滿痰多，腸燥便秘[1]。桃仁與苦杏仁在外觀上非常相似，經(jīng)脫皮、炮制加工后更難區(qū)分，然而兩者藥理作用顯著不同，桃仁屬于活血化瘀藥，杏仁屬于止咳平喘藥。且兩者主要化學(xué)成分均為苦杏仁苷，應(yīng)用傳統(tǒng)鑒別方法容易出現(xiàn)誤差。此外，苦杏仁中苦杏仁苷含量較高，該化合物被苦杏仁酶代謝分解后會產(chǎn)生有毒的氫氰酸，過量則會引起中毒，桃仁和苦杏仁的混用容易引起潛在的用藥風(fēng)險[2]。因此，建立一種快速、簡易、準(zhǔn)確鑒定桃仁和苦杏仁的分子鑒定體系，對于控制桃仁的藥材質(zhì)量以及用藥安全都具有十分重要的意義。本實(shí)驗基于ITS序列位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)對桃仁和苦杏仁藥材樣品進(jìn)行鑒別，設(shè)計特異性鑒別引物并對特異性PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，實(shí)驗確定的鑒別方法穩(wěn)定、快速，為桃仁和苦杏仁的準(zhǔn)確鑒別提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 樣品 桃仁與苦杏仁樣品來源有：購自河北安國中藥材市場和安徽亳州藥材市場的藥材，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院李佳副教授鑒定(編號：1,2,10,11,12,19)；采集自山西、河北、北京的桃仁、山桃仁、苦杏仁樣品由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定(編號：8,9,18,24,25,26)；全國中藥資源普查中心提供的桃仁與苦杏仁樣品(編號：3,4,5,6,7,13,14,15,16,17,20,21,22,23)，樣品信息見表1。桃仁標(biāo)準(zhǔn)藥材(山桃，121560-201302，編號T)、苦杏仁標(biāo)準(zhǔn)藥材(杏，121554-201204，編號X)購于中國食品藥品檢定研究院。NCBI下載序列見表2。

表1 本實(shí)驗所用樣品材料

表2 NCBI下載序列信息

1.2 儀器 PCR儀(Applied Biosystems Veriti；Eppendorf AG 22331)；微量核酸定量儀(NanoDrop 2000C)；高級熒光化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(FUSION-SL)。

1.3 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型DP305-2，TIANGEN)；2×EasyTaq PCR SuperMix(AS111，TRANS)；2×Taq PCR StarMix(A112，GenStar)；Ex Taq DNA聚合酶(RR53AM，TakaRa)；Phusion超保真PCR Master Mix(M0531，BioLab)；2K DNA Marker(E110，TransGen)。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA的提取、通用引物PCR擴(kuò)增及測序 取樣品約100 mg，經(jīng)粉碎后，用植物基因組DNA提取試劑盒提取各藥材總DNA，最后用50 μL無菌水洗脫。樣品用通用引物ITS[3](序列見表1)以高保真酶擴(kuò)增樣品DNA并進(jìn)行雙向測序。PCR擴(kuò)增體系為Phusion超保真PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物各0.75 μL，DNA 2 μL，無菌水9 μL，總體系25 μL。PCR擴(kuò)增程序見表3。PCR產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序部測序，各樣品均采用正反雙向測序，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表3 引物及PCR反應(yīng)條件

1.4.2 序列分析 將測序結(jié)果與網(wǎng)上桃仁與苦杏仁序列用CLUSTAL X軟件進(jìn)行序列比對，使用MEGA6用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，Bootstrap(1000次重復(fù))檢驗各分支的支持率。

1.4.3 特異性鑒別引物的設(shè)計 將所測得的序列與GenBank中的桃仁與苦杏仁ITS序列用BioEdit軟件進(jìn)行比對分析，找出具有穩(wěn)定差異的特異性片段，篩選獲得變異位點(diǎn)，通過該位點(diǎn)運(yùn)用Premier Primer 5.0軟件針對桃仁的特異性片段設(shè)計多對鑒別引物，并由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.4 PCR引物特異性篩選 用所設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR所用25 μL反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL，正反向引物各0.5 μL，DNA稀釋20倍后取1 μL，無菌水補(bǔ)齊。PCR產(chǎn)物采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測。以結(jié)果出現(xiàn)整齊、清晰條帶為陽性，其余為陰性，由此判斷引物特異性。

1.4.5 特異性PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 為獲得最優(yōu)的位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)條件，對其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了DNA模板濃度(0.005 ng/μL、0.01 ng/μL、0.02 ng/μL、0.05 ng/μL、0.1 ng/μL、0.2 ng/μL、0.25 ng/μL、0.5 ng/μL、1 ng/μL、2 ng/μL)、退火溫度(55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃)、聚合酶種類(Ex Taq DNA聚合酶、2×Taq PCR StarMix、2×EasyTaq PCR SuperMix)、不同PCR儀(Applied Biosystems Veriti；Eppendorf AG 22331)對PCR反應(yīng)的影響。反應(yīng)體系為：DNA聚合酶12.5 μL，正反向引物各0.5 μL，DNA 1 μL，無菌水補(bǔ)足25 μL。

2結(jié)果與分析

2.1 通用引物PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果 ITS通用引物擴(kuò)增樣品的成功率為100%，即全部具有明亮清晰條帶。擴(kuò)增結(jié)果如圖1。

圖1 通用引物PCR結(jié)果

注：a：桃仁1-9以及桃仁標(biāo)準(zhǔn)藥材T；b：山桃10-18；c：杏仁19-26以及苦杏仁標(biāo)準(zhǔn)藥材X；M：DNA分子標(biāo)記

2.2 基于ITS序列桃仁與苦杏仁樣品的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 采用Mega 6分析軟件進(jìn)行桃仁與苦杏仁系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。見圖2，采用Kimura2-parameter距離，系統(tǒng)樹各分支的置信度用bootstrap method檢驗，共進(jìn)行1 000次循環(huán)。由圖2可知，桃仁樣品與桃仁標(biāo)準(zhǔn)藥材聚為一支，苦杏仁與苦杏仁標(biāo)準(zhǔn)藥材聚為一支，表明ITS序列用于桃仁與苦杏仁的分子鑒定具有一定的理論依據(jù)。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的桃仁與杏仁藥材的鄰接(NJ)樹

注：桃仁：1，2，10，11，17，18，T，AF318744.1，AF318741.1，JQ280475.1;苦杏仁：19，20，21，22，24，X，AF318756.1，EF211085.1

2.3 特異性引物PCR擴(kuò)增 用篩選的特異PCR引物G4-7(序列見表3)對提取的桃仁和苦杏仁DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。如圖3所示，桃仁標(biāo)準(zhǔn)藥材與桃仁樣品特異性擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，條帶整齊、清晰明亮，大小333 bp，而苦杏仁標(biāo)準(zhǔn)藥材與苦杏仁樣品特異性擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性，證明該引物具有良好的特異性。

圖3 特異引物PCR結(jié)果

注：a：桃1-9以及桃仁標(biāo)準(zhǔn)藥材T；b：山桃10-18；c：杏19-26以及苦杏仁標(biāo)準(zhǔn)藥材X M：DNA分子標(biāo)記

2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化

2.4.1 DNA模板量的考查 對25 μL PCR反應(yīng)體系中的模板DNA用量進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖4，DNA模板濃度在2 ng/μL時苦杏仁出現(xiàn)假陽性條帶，而在0.02 ng/μL時桃仁不能出現(xiàn)清晰、明亮條帶，且其引物二聚體明顯增多(見圖4)，因此確定本方法DNA模板濃度適宜范圍應(yīng)為0.05～1 ng/μL。實(shí)驗采用0.05 ng/μL DNA模板濃度繼續(xù)進(jìn)行其他條件的考察。

圖4 DNA模板濃度優(yōu)化結(jié)果

注：1-13：桃仁，19-22：苦杏仁;M：DNA分子標(biāo)記

2.4.2 退火溫度的考查 設(shè)置退火溫度分別為55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果見圖5。從結(jié)果可見，桃仁均出現(xiàn)整齊、清晰條帶，而苦杏仁均無條帶，表明退火溫度對其無明顯影響，采用59 ℃作為此方法的退火溫度。

圖5 退火溫度考查結(jié)果

注：1-13：桃仁，19-22：苦杏仁;M：DNA分子標(biāo)記

2.4.3 DNA聚合酶的考察 對Ex Taq DNA聚合酶，2×Taq PCR StarMix，2×EasyTaq PCR SuperMix 3種聚合酶進(jìn)行考察。結(jié)果如圖6。采用不同聚合酶的PCR反應(yīng)，偽品均無條帶，而正品均有333 bp特異性擴(kuò)增條帶，說明特異性引物可用多種酶進(jìn)行實(shí)驗，無單一局限性。

圖6 不同酶考查結(jié)果

注：1，10：桃仁，19：苦杏仁。a：Ex Taq DNA聚合酶，b：2×Taq PCR StarMix，c：2×EasyTaq PCR SuperMix;M：DNA分子標(biāo)記

2.4.4 PCR儀對實(shí)驗結(jié)果重復(fù)性的影響 選用2種不同型號的PCR儀(Eppendorf AG 22331、Applied Biosystems Veriti)進(jìn)行考察，結(jié)果桃仁均出現(xiàn)整齊、明亮清晰的條帶，苦杏仁均無條帶出現(xiàn)(圖7)，表明此方法穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，PCR儀對其結(jié)果無明顯影響。

圖7 不同PCR儀考查結(jié)果

注：1，10：桃仁，19：苦杏仁。a：Eppendorf AG 22331 PCR儀；b：Applied Biosystems Veriti PCR儀;M：DNA分子標(biāo)記

3討論

由于桃仁品種繁雜，形態(tài)變異大，且與苦杏仁形態(tài)相似，尤其是山桃仁在形態(tài)上與杏仁更加難以區(qū)分，故傳統(tǒng)鑒別在實(shí)際應(yīng)用中很難將兩者準(zhǔn)確區(qū)別。位點(diǎn)特異性引物PCR具有操作簡單、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，使用特異性引物可以極大降低PCR的假陽性率，保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[4]，特別是近年來快速PCR技術(shù)迅速發(fā)展，使得中藥材分子鑒定在現(xiàn)場快速鑒定上的應(yīng)用成為了可能[5-6]。如李振華等[7]通過位點(diǎn)特異PCR的方法證明了荒漠肉蓯蓉能擴(kuò)增出331 bp的條帶，而混偽品不能，從而實(shí)現(xiàn)了荒漠肉蓯蓉與其混偽品的快速、準(zhǔn)確鑒別。陳康等[8]在位點(diǎn)特異性引物PCR方法的基礎(chǔ)上改良實(shí)驗條件，應(yīng)用快速PCR方法通過顯示熒光區(qū)分真?zhèn)紊哳愃幉?，所建立的蛇類藥材快速PCR真?zhèn)螜z測方法可在30～45 min完成。趙丹等[9]對太子參藥材及其混偽品的rDNA-ITS片段進(jìn)行比對分析，應(yīng)用特異性引物PCR方法將太子參藥材及其混偽品進(jìn)行了很好的區(qū)分。

DNA條形碼技術(shù)在物種鑒別分類上起到了越來越重要的作用[10-12]。植物常用鑒別序列是ITS序列，包括ITSl、ITS2，分別位于18S～5.8S rDNA、5.8S～26S rDNA之間，長度分別為187～298 bp和187～252 bp，而18S、5.8S、26S rDNA的序列又非常保守，所以其通用引物可適用物種范圍廣泛[13]。Chen等[3]比較了藥用植物中7個候選的DNA條形碼(psbA-trnH、rbcL、matK、rpoC1，ycf5，ITS2以及ITS)，并且測試了ITS2鑒別753個屬4 800個物種的6600個樣品的成功率，結(jié)果為其鑒別成功率在種水平上為92.7%，最終認(rèn)為ITS2可做為更廣泛的藥用植物鑒別DNA條形碼。林韻涵等對藥材桃仁及其近緣種進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明ITS2序列作為DNA條形碼可以有效地鑒定藥材桃仁及其近緣種。因此本實(shí)驗最初選用桃仁及苦杏仁藥材ITS2序列進(jìn)行測序，但由于其親緣關(guān)系較近，序列相似度較高，且多處均為單個堿基的不同，因此難以設(shè)計鑒別度較好的特異引物。中國植物條形碼工作組[14]對來自42目75科141屬1 757個物種的6 286個種子類植物樣本的rbcL，matK，psbA-trnH，ITS序列進(jìn)行研究，結(jié)果表明ITS有最高的鑒別能力，建議ITS/ITS2應(yīng)成為種子植物的核心條形碼。因此本實(shí)驗即對桃仁及苦杏仁藥材ITS序列進(jìn)行測序，2種藥材ITS序列中Poly結(jié)構(gòu)較多，突變?nèi)笔闆r較嚴(yán)重，并不是所有藥材均能測序成功，但根據(jù)所測序結(jié)果以及與網(wǎng)上序列進(jìn)行比對分析，設(shè)計特異性鑒別引物，結(jié)果表明其引物特異性好，鑒別能力高，可作為桃仁及苦杏仁藥材鑒別的特異引物。

本實(shí)驗通過特異引物篩選和條件優(yōu)化，最終確定25 μL PCR反應(yīng)體系時，引物G4-7在DNA模板加樣量0.05～1 ng范圍內(nèi)，退火溫度55～63 ℃時可將桃仁與苦杏仁進(jìn)行有效的鑒別。該方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于桃仁與苦杏仁的分子鑒別以及桃仁藥材分子鑒定的推廣與應(yīng)用，且為桃仁藥材的快速鑒別提供了參考依據(jù)。

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(2016-11-30收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄)

IdentificationofPersicaeSemenandArmeniacaeSemenAmarumbyPCRAmplificationofSpecificAllelesBasedonITSSequences

Gao Linhui1,Yin Yan2,Li Jia1,Ma Yuemeng1,Li Wenbin1,Li Bowen1,Zhang Xia′nan1

(1SchoolofTraditionalChineseMedcine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2SchoolofPharmaceuticalSciences,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)

To identify Persicae semen amarum using DNA molecular identification,and establish classical PCR identification mesthod.The internal transcribed spacer (ITS) of nuclear ribosomal DNA of Persicae Semen and Armeniacae semen amarum were amplified and bidirectionally sequenced.ITS sequences were analysed by BioEdit.Specific identification primers were designed according to the ITS sequences of specific alleles,and PCR reaction system was optimized.Persicae Semen and Armeniacae Semen Amarum can be identificated by the specfic peimers G4-7 based on ITS sequences.In the condition′s concentration is between 0.05-1 ng for a 25 μL PCR reaction,the best annealing temperature is 59 ℃.This method is well used for different DNA polymerases and different PCR instruments.The result showed that the 333 bp identification band can be amplified in Persicae semen,while it can not be amplified in Armeniacae semen amarum.It is confirmed that the PCR amplification system of specific alleles can be used to identify Persicae semen and Armeniacae semen amarum fastly and accurately.

Persicae Semen; Armeniacae Semen Amarum; ITS; PCR amplification of specific alleles; Molecular identification

R284；R917

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.050

國家自然科學(xué)基金(81303166)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)專項(201407003)

高琳惠(1993.07—)，女，在讀研究生，研究方向：分子生藥學(xué)，E-mail：gaolinhui1993@qq.com

張夏楠(1982.04—)，女，博士，講師，研究方向：分子生藥學(xué)，E-mail：xnzhang@ccmu.edu.cn