王領(lǐng)弟，杜義龍，楊明宇，臧亞茹，潘海峰*

(1.承德醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 藥劑科，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

·基礎(chǔ)研究·

聚類分析和主成分分析法研究刺玫果指紋圖譜

王領(lǐng)弟1，杜義龍2，楊明宇2，臧亞茹1，潘海峰2*

(1.承德醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 藥劑科，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

目的：研究刺玫果藥材的指紋圖譜，為其有效質(zhì)量控制提供參考。方法：采用高效液相色譜法采集18批刺玫果的指紋圖譜，通過(guò)相似度分析、聚類分析和主成分分析對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：最終建立了刺玫果的指紋圖譜，主要成分得到有效分離，共得到10個(gè)共有峰，并確定了4個(gè)特征峰的峰歸屬。樣品可被聚成4類，并且3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為73.432%。結(jié)論：所建指紋圖譜可為刺玫果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)提供參考。

刺玫果；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析

刺玫果RosadavuricaPall.為薔薇科薔薇屬植物，別名刺木果、山刺玫、刺莓果、野刺玫果，廣泛分布于東北、華北等地[1]。主要含有黃酮、有機(jī)酸、香豆素等類成分[2-3]?！吨兴幋筠o典》記載其健脾消食、活血調(diào)經(jīng)、斂肺止咳[4]。實(shí)驗(yàn)表明，刺玫果具有抗衰老、抗癌、抗血栓形成、抗血小板聚集及增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能等作用[5-6]。刺玫果是山玫膠囊的主要原藥材之一[7-8]，藥材質(zhì)量直接關(guān)乎成品質(zhì)量。目前，模式識(shí)別方法在指紋圖譜等多維數(shù)據(jù)分析中有很大優(yōu)勢(shì)，也是其重要的分析手段[9-10]，其中聚類分析與主成分分析法廣泛應(yīng)用于品質(zhì)鑒定與樣品分類研究中[11]。筆者對(duì)18批不同產(chǎn)地的刺玫果藥材進(jìn)行高效液相指紋圖譜研究，并用相似度分析、聚類分析和主成分分析3種方法對(duì)不同產(chǎn)地刺玫果的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為刺玫果的內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)和分類提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100 Series液相色譜儀；對(duì)照品沒(méi)食子酸(批號(hào)：110831-200302)、金絲桃苷(批號(hào)：111521-200303)、蘆丁(批號(hào)：100080-200707)和槲皮素(批號(hào)：100081-200907)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

18批刺玫果藥材樣品于2014年9月采自各地，由河北承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫Rosadavurica的成熟干燥果實(shí)；樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 刺玫果藥材來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A和B分別為0.5%磷酸水溶液和乙腈；梯度洗脫(0～20 min，5%～10% B；20～30 min，10%～26% B；30～50 min，26%～55% B)；流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm。

2.2 供試品溶液的制備

取刺玫果藥材粉末(過(guò)6號(hào)篩)2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加60%甲醇水溶液持續(xù)提取5 h，濃縮，濃縮液用甲醇完全轉(zhuǎn)移至容量瓶中并定容，離心，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒(méi)食子酸3.0 mg、蘆丁0.4 mg、金絲桃苷3.0 mg和槲皮素0.2 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

2.4 精密度試驗(yàn)

取S1號(hào)刺玫果供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4%，表明儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品S1號(hào)6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4%，表明儀器的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S1號(hào)供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，于0、4、8、12、24 h進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 特征圖譜的建立

將18批不同來(lái)源的刺玫果藥材的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2004A版》相似度軟件，利用峰面積、峰高以及全譜進(jìn)行匹配，以S1號(hào)樣品HPLC指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，并建立18批刺玫果藥材的指紋圖譜，見(jiàn)圖1。

將刺玫果的圖譜數(shù)據(jù)處理分析后得到其特征圖譜，其中有10個(gè)共有峰，通過(guò)多種對(duì)照品比對(duì)得知3號(hào)峰為沒(méi)食子酸，6號(hào)峰為蘆丁，7號(hào)峰為金絲桃苷，10號(hào)峰為槲皮素，見(jiàn)圖2。

注：R.對(duì)照品。圖1 18批刺玫果指紋圖譜疊加圖和對(duì)照?qǐng)D譜

注：A.混合對(duì)照品；B.刺玫果；3.沒(méi)食子酸；6.蘆??；7.金絲桃苷；10.槲皮素。圖2 刺玫果和對(duì)照品指紋圖譜

2.8刺玫果指紋圖譜結(jié)果分析

2.8.1 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2004A版》，以平均數(shù)法(時(shí)間窗為0.1)計(jì)算各樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果分別為0.986、0.820、0.982、0.994、0.984、0.986、0.988、0.997、0.999、0.988、0.984、0.986、0.983、0.999、0.994、0.996、0.998、0.999。相似度結(jié)果表明，18批刺玫果藥材有良好的相似性，但仍存在一定差異。

2.8.2 聚類分析 以不同產(chǎn)地刺玫果藥材的10個(gè)共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，以平均Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間聯(lián)接的方法對(duì)18批刺玫果進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)類間距為5～10時(shí)，刺玫果藥材被分為4大類，Ⅰ類包括S4、S8、S9、S14、S15、S16、S17、S18；Ⅱ類包括S7、S10、S11、S12、S13；Ⅲ類包括S1、S3、S5、S6；Ⅳ類包括S2。

圖3 18批刺玫果聚類分析樹(shù)狀圖

2.8.3 主成分分析 主成分分析法是一種應(yīng)用廣泛的多元統(tǒng)計(jì)方法，用于簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)，快速實(shí)現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識(shí)別[12]。本文以刺玫果10個(gè)共有峰的峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算18批刺玫果的主成分得分，得到其主成分得分平面圖，見(jiàn)圖4。

表2 刺玫果主成分分析特征值

圖4 刺玫果主成分分析得分圖

3 討論

本文采用高效液相色譜法建立了刺玫果的指紋圖譜，標(biāo)定出10個(gè)共有峰，并根據(jù)對(duì)照品指認(rèn)出其中4個(gè)，18批刺玫果與對(duì)照?qǐng)D譜匹配相似度較高。但因僅憑相似度結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確鑒定刺玫果的產(chǎn)地來(lái)源，參考各共有峰之間的差異，本實(shí)驗(yàn)再通過(guò)聚類分析和主成分分析對(duì)18批刺玫果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中，聚類分析將不同基原的刺玫果藥材分為4大類，如吉林安圖、黑龍江伊春和河北承德的刺玫果聚為一類，東北小興安嶺、東北大興安嶺和遼寧葫蘆島的刺玫果聚為一類，安徽亳州產(chǎn)的刺玫果與其他均不能聚為一類，這可能與刺玫果生長(zhǎng)環(huán)境(產(chǎn)地、氣候、土壤等)有關(guān)。利用主成分分析，得到了3個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為73.432%，其中，第3個(gè)主成分經(jīng)對(duì)照品比對(duì)得知是沒(méi)食子酸，其余兩個(gè)主成分未知，還需結(jié)合質(zhì)譜等手段進(jìn)一步確定。模式識(shí)別中，聚類分析和主成分分析的結(jié)果基本一致，并可以與相似度結(jié)果相互驗(yàn)證。

本文在前文基礎(chǔ)上重新優(yōu)化了HPLC色譜條件[7]，色譜條件更簡(jiǎn)單易行。主要側(cè)重用聚類分析和主成分分析法對(duì)不同產(chǎn)地刺玫果的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，主成分分析能篩選出共有的特征成分，與聚類分析結(jié)合使用，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)了單純用相似度評(píng)價(jià)指紋圖譜的不足，可多角度綜合評(píng)判刺玫果藥材的質(zhì)量。

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StudyonFingerprintAnalysisofFruitsofRosadavuricabyPrincipalComponentAnalysisandClusterAnalysis

WANGLingdi1，DUYilong2，YANGMingyu2，ZANGYaru1，PANHaifeng2*

(1.Departmentofpharmacy，AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China；2.HebeiKeyLaboratoryofStudyandExploitationofChineseMedicine，ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective：To study the fingerprints of the dried fruits ofRosadavurica，and provide reference for their effective quality control.Methods：The HPLC fingerprints of 18 batches of the dried fruits ofR.davuricawere performed，and subsequently analyzed through the similarity analysis，cluster analysis and principal component analysis.Results：The fingerprints of the dried fruits ofR.davuricawere established，the main components were effectively separated，10 peaks were obtained，and the four characteristic peaks were confirmed.The samples were classified into four groups，and three principal components make up 73.432% of the total variance.Conclusion：The fingerprints provide a reference for the quality standards of the dried fruits ofR.davurica.

Rosadavurica；fingerprint；cluster analysis；principal component analysis

] 潘海峰，教授，研究方向：中藥分析及中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)；Tel：(0314)2291186，E-mail：phf2301@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.009

2016-07-06)

*[