程宗琦，陳 琳，姚 鑫，金 奕(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 1003； . 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 15006)

【實(shí)驗(yàn)研究】

消疹止癢噴劑治療EGFRI相關(guān)性皮疹的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究?

程宗琦1,2，陳 琳2，姚 鑫2，金 奕2
(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023； 2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006)

目的：探究消疹止癢噴劑對(duì)皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖分化及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響及其作用機(jī)制。方法： MTT法觀察不同濃度消疹止癢噴劑對(duì)皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCaT生長(zhǎng)能力的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound healing)及Transwell實(shí)驗(yàn)考查消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT及巨噬細(xì)胞RAW264.7運(yùn)動(dòng)能力的影響，采用western blotting實(shí)驗(yàn)考察消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞的PI3K、AKT、tPA、CD147及RAW264.7細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2(Matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響，采用RT-PCR考察消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞的MMP-2、MMP-9 mRNA水平的影響。結(jié)果：消疹止癢噴劑可以劑量依賴性地促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖，抑制其分化；Wound healing實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中，隨著消疹止癢噴劑濃度提高，HaCaT及巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移數(shù)目呈遞減趨勢(shì)；隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，HaCaT及巨噬細(xì)胞RAW264.7侵襲能力呈遞減趨勢(shì)；消疹止癢噴劑可以劑量依賴性抑制HaCaT細(xì)胞PI3K和AKT增殖蛋白表達(dá)，同時(shí)降低分化蛋白tPA和CD147的表達(dá)；此外消疹止癢噴劑可以顯著抑制RAW264.7 MMP2和MMP9的mRNA和蛋白水平表達(dá)。結(jié)論：消疹止癢噴劑促進(jìn)皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖并抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是其治療EGFRI相關(guān)性皮疹的重要機(jī)制之一。

消疹止癢噴劑；HaCaT；RAW264.7；增殖分化；遷移侵襲

表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(EGFRI)包括小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)和單克隆抗體[1]。EGFRI可改善晚期NSCLC患者的生活質(zhì)量及總生存率已成為不爭(zhēng)的事實(shí)。這類藥物基本無傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物的骨髓抑制、心臟毒性和神經(jīng)毒性等，其主要副作用為皮膚不良反應(yīng)，發(fā)生率大于50%，但大部分為輕中度，嚴(yán)重者約占10%[2]。一方面皮疹的出現(xiàn)可能是治療獲益的信號(hào)，多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，皮疹的嚴(yán)重程度與EGFRI治療療效呈正相關(guān)，皮疹患者的生存期顯著優(yōu)于未出現(xiàn)皮疹的患者。另一方面EGFRI相關(guān)皮膚不良反應(yīng)可能干擾正常治療，嚴(yán)重者甚至影響患者生活質(zhì)量并導(dǎo)致治療中斷而影響療效[3]。因此在不改變EGFRI治療的前提下，有效控制皮膚不良反應(yīng)具有重要意義。

EGFR在皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖分化等方面起重要作用，即刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制其分化，保護(hù)細(xì)胞抵抗紫外線相關(guān)損傷，抑制炎癥并加速創(chuàng)面愈合，如該作用被阻斷便會(huì)導(dǎo)致EGFRI相關(guān)皮膚不良反應(yīng)。EGF必須與EGFR結(jié)合形成二聚體，激活內(nèi)源性酪氨酸蛋白激酶后，才能影響角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持[4]。酪氨酸蛋白激酶激活是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)反應(yīng)的關(guān)鍵啟動(dòng)因素，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化、生存和遷移以及血管生成與轉(zhuǎn)移。EGF等配體也參與傷口愈合過程，如HB-EGF可加速角質(zhì)細(xì)胞遷移，促進(jìn)傷口愈合。皮膚EGFR缺失的基因工程小鼠，表現(xiàn)為干燥、指甲易碎和表皮變薄，且廣泛的頭發(fā)毛囊缺陷可導(dǎo)致頭發(fā)纖細(xì)易斷和毛囊混合性的炎癥浸潤(rùn)、毛囊上皮破壞，以上反應(yīng)與EGFRI引起的皮膚改變相似[2]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，EGFRI可抑制基底角化細(xì)胞EGFR的磷酸化，并減少M(fèi)itogen-activated Protein Kinase (MAPK)的表達(dá)，從而導(dǎo)致皮膚正常角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、提前分化及異常遷移，促使某些皮膚反應(yīng)的發(fā)生。抑制EGFR介導(dǎo)的信號(hào)通路可引起生長(zhǎng)抑制和凋亡、細(xì)胞遷移減少、細(xì)胞黏附和分化增加、炎癥反應(yīng)激活，進(jìn)而影響角質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致特異性的皮膚表現(xiàn)[5]。

目前針對(duì)EGFRI靶向藥物引發(fā)的皮膚不良反應(yīng)，主要治療手段多為局部使用抗生素、類固醇激素等，但因其療效不理想、副作用大限制其臨床運(yùn)用[6]，因此尋找一種合理的方法治療EGFRI相關(guān)性皮疹具有重要意義[7]。中藥是我國(guó)的瑰寶，嘗試從中藥中尋找出針對(duì)疾病靶標(biāo)的創(chuàng)新藥物已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中，分子靶向藥物所致皮膚毒性屬于“藥毒”范疇，表現(xiàn)為“肺熱血瘀”，用宣肺涼血祛瘀中藥可辨證論治。“消疹止癢噴劑”為我院自制中藥制劑，由紫草、野菊花等5味中藥組成，其中紫草功能清熱涼血、解毒透疹，野菊花解毒消癰，地膚子清熱利濕止癢，側(cè)柏葉善清血熱，冰片清熱止痛，諸藥合用達(dá)清熱解毒、涼血止血、散瘀消腫之功效。前期開展的藥理實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，其具有較好的抗炎消疹作用[8]。本研究利用皮膚角質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞在體外模擬EGFRI相關(guān)性皮疹發(fā)病機(jī)制，闡述“消疹止癢噴劑”治療EGFRI相關(guān)皮膚不良反應(yīng)的分子機(jī)理，為開發(fā)“消疹止癢噴劑”成為一種安全、有效治療EGFRI相關(guān)性皮疹的復(fù)方制劑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

DMEM(美國(guó)Gibco公司 Cat. 12101-062 Lot. 758136)，胎牛血清(Hyclone公司Cat：SH30396.02 Lot. KPF21391)，MTT(Promega公司，Lot.30502302)。消疹止癢噴劑(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院自制)，制劑原料藥購(gòu)自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)巢建國(guó)教授鑒定，紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.的干燥根，野菊花為菊科植物野菊ChrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序，側(cè)柏葉為柏科植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉，側(cè)柏葉為藜科植物地膚Kochiascoparia(L.)Schrad.的干燥成熟果實(shí)，梅片為龍腦香科植物龍腦香Dryobalanops aromatica Gaertn. f.的樹干提取結(jié)晶。PI3K兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.4257)，AKT兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.4685)，MMP-2兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.87809)，MMP-9兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.13667)，tPA兔一 抗(Santa Cruz公司，Lot.sc-59721)，CD147兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.13287)及GAPDH兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.5174)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常肝細(xì)胞LO2、角質(zhì)細(xì)胞HaCaT、巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自上海中科院，HaCaT及RAW264.7細(xì)胞于含10%胎牛血清以及1×105IU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。LO2細(xì)胞于含10%胎牛血清以及1×105IU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 消疹止癢噴劑對(duì)LO2及HaCaT細(xì)胞增殖的檢測(cè) LO2細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，1640完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，接種于96孔板中，5×103個(gè)細(xì)胞每孔。待細(xì)胞單層貼壁后加入消疹止癢噴劑，測(cè)試最高濃度為100 μL·mL-1, 3倍稀釋。對(duì)照組加入等體積的DMSO，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，24 h后加入20 μL MTT溶液繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h。搖床避光震搖15 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)定吸光度值(OD值)，結(jié)果以藥物對(duì)吸光度值表示[9-10]。抑制率=(正常組OD值-加藥組OD值)/正常組OD值。HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，接種于96孔板中，5×103個(gè)細(xì)胞每孔。待細(xì)胞單層貼壁后加入消疹止癢噴劑，使其終濃度為2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、10 μL·mL-1。對(duì)照組加入等體積的DMSO，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別于24、48、72 h后加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h。搖床避光震搖15 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)定吸光值(OD值)，結(jié)果以藥物的吸光度值表示。乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購(gòu)自碧云天公司(Lot.C0017)。新鮮配制10 mU/ml、5 mU/ml、2.5 mU/ml、1.25 mU/ml、0.65 mU/ml、0 mU/ml濃度的LDH標(biāo)準(zhǔn)品，在酶標(biāo)儀上用490 nm檢測(cè)吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照組加入等體積的DMSO，設(shè)置2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、8 μL·mL-1、12 μL·mL-1和16 μL·mL-1濃度孔(每組3個(gè)復(fù)孔)。將培養(yǎng)板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，24 h后收集每個(gè)樣本培養(yǎng)液離心后收集上清，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋10倍，取50 μL加入到96孔板，加入試劑盒中LDH檢測(cè)液，在酶標(biāo)儀上用490 nm檢測(cè)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)公式計(jì)算出測(cè)定樣品中LDH的酶活性，根據(jù)測(cè)定結(jié)果對(duì)不同樣品處理組的酶活性進(jìn)行歸一化處理。

1.2.3 消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化制成1×109·mL-1細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿各加入1ml細(xì)胞懸液，其余為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，共10 ml體系。細(xì)胞分組及給藥方式同上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后提取蛋白，并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。變形后取50 μg上樣，用10%分離膠、5%濃縮膠電泳：0.02A每塊膠至溴酚藍(lán)消失，之后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。一抗PI3K (稀釋比例1∶1000，購(gòu)自Cell Signaling Technology，貨號(hào)4249)， AKT (稀釋比例1∶1000，購(gòu)自Cell Signaling Technology，貨號(hào)4685)，tPA (稀釋比例1∶1000，購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，貨號(hào)sc-59721)及CD147 (稀釋比例1∶1000，購(gòu)自Cell Signaling Technology，貨號(hào)13287)，4 ℃孵育過夜后加1∶10000辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，加入化學(xué)發(fā)光試劑，用Kodak膠卷曝光；以GAPDH (稀釋比例1∶1000，購(gòu)自Cell Signaling Technology，貨號(hào)5174)作為內(nèi)參作灰度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 用滅菌的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到6孔板內(nèi)，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。種入HaCaT細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)， 細(xì)胞分組及給藥方式同上。用碧云天免疫染色固定液(P0098)固定完畢，可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌2次，每次5 min。 加入碧云天免疫染色封閉液(P0102)封閉60 min。 一抗tPA及CD147按照1∶500比例用免疫染色一抗稀釋液(P0103)稀釋一抗。按照1∶500比例用免疫熒光染色二抗稀釋液(P0108)稀釋熒光標(biāo)記的二抗，室溫結(jié)合2 h。DAPI染細(xì)胞核，直接到熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT及RAW264.7細(xì)胞遷移能力的影響 準(zhǔn)備直尺和Marker筆照射紫外線滅菌。將6孔板用封口膜封好倒置于超凈臺(tái)上，用Marker筆沿著6孔板直徑平行等距劃線用于定位。含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)HaCaT或RAW264.7細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞、消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105·mL-1備用。將上述細(xì)胞懸液加入6孔板中，每孔體積2 mL，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞待其呈融合狀態(tài)則可進(jìn)行劃痕。按照與預(yù)先所定位橫線垂直方向，使用一個(gè)100 μL無菌槍頭進(jìn)行劃痕，槍頭擺放要與六孔板垂直，保證劃痕的寬度一致。劃痕完畢后用槍緩慢吸出培養(yǎng)液，加入適量的PBS將細(xì)胞清洗3遍，除去細(xì)胞碎片。棄PBS，每孔加入不同濃度的消疹止癢噴劑(0 μL·mL-1、2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、10 μL·mL-1)，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，在劃痕的不同時(shí)間點(diǎn)(0 h，48 h)將6孔板置于倒置顯微鏡下拍照，觀察劃痕愈合的程度。

1.2.6 消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT及RAW264.7細(xì)胞侵襲能力的影響 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干。吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50 μl含10 g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37 ℃ 30 min,使基質(zhì)膠水化再吸去剩余培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)HaCaT及RAW264.7細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前24 h撤血清饑餓。消化細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度2×106·mL-1。在24孔板中加入DMEM培養(yǎng)基，每孔600 μL。取上述細(xì)胞懸液90 μL加入Transwell小室上室中，同時(shí)各孔加入濃度分別為20 μL·mL-1、60 μL·mL-1、100 μL·mL-1的消疹止癢噴劑藥液，體積10 μL，終濃度2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1，對(duì)照組加入等體積的DMSO，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。將小室浸于24孔板的培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)孵育6 h，取出小室用鑷子輕輕取下濾膜，5%戊二醛4 ℃固定10 min，取出用0.1%結(jié)晶紫染液于水平搖床染色30 min，PBS漂洗3次，用棉簽擦掉膜上層未穿過的細(xì)胞置于載玻片上，200倍鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7 消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化制成1×109·mL-1細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿各加入1ml細(xì)胞懸液，其余為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液共10 ml體系。細(xì)胞分組及給藥方式同上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后提取蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。變形后取50 μg上樣，用10%分離膠、5%濃縮膠電泳，即0.02A每塊膠，至溴酚藍(lán)消失，之后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。一抗MMP-2 (1∶1000)及MMP-9 (1∶1000)，4 ℃孵育過夜后加1∶10000辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，加入化學(xué)發(fā)光試劑。用Kodak膠卷曝光，以GAPDH為內(nèi)參作灰度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 消疹止癢噴劑對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，消疹止癢噴劑作用24 h可以劑量依賴性地抑制LO2細(xì)胞的增殖，IC50值為10.95 μL·mL-1(結(jié)果見圖1A)。為排除消疹止癢噴劑對(duì)正常細(xì)胞毒性的作用，我們初步選用2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1下消疹止癢噴劑進(jìn)一步開展后續(xù)研究。同時(shí)，顯微鏡下觀察濃度為2 μL·mL-1、 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對(duì)正常肝細(xì)胞LO2形態(tài)學(xué)的影響。圖1B顯示，2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對(duì)正常肝細(xì)胞LO2的細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。為進(jìn)一步確證2 μL·mL-1、 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對(duì)LO2的細(xì)胞毒作用，選用LDH釋放實(shí)驗(yàn)證實(shí)與空白對(duì)照組比較，在此3濃度下的消疹止癢噴劑無誘導(dǎo)LO2細(xì)胞LDH釋放增加(圖1C)。

圖1 消疹止癢噴劑對(duì)正常肺細(xì)胞LO2生長(zhǎng)及形態(tài)的無明顯影響注：A. LO2細(xì)胞用消疹止癢噴劑干預(yù)24 h后測(cè)定其對(duì)LO2細(xì)胞的增殖抑制率；B. 不同濃度消疹止癢噴劑對(duì)LO2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的作用(標(biāo)尺100 μm)；C. 不同濃度消疹止癢噴劑對(duì)LO2細(xì)胞LDH釋放的影響

2.2 消疹止癢噴劑促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞HaCaT增殖

觀察不同濃度消疹止癢噴劑在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HaCaT增殖的影響發(fā)現(xiàn)，2 μL·mL-1消疹止癢噴劑作用24 h對(duì)HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目無明顯促進(jìn)效應(yīng)。但作用48 h及72 h h后，消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞數(shù)目有顯著促進(jìn)作用。6 μL·mL-1和10 μL·mL-1的消疹止癢噴劑在24、 48 h及72 h培養(yǎng)條件下，能明顯誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞HaCaT的增殖(圖2A)。PI3K-AKT信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài), 在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用。為初步探究消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT的增殖核心信號(hào)通路的影響，采用免疫印跡法考察PI3K和AKT蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組GAPDH的條帶亮度相近，而PI3K和AKT在消疹止癢噴劑處理細(xì)胞后，與對(duì)照組比較處理組亮度有明顯差異，可見有明顯的增強(qiáng)(圖2B)。

2.3 消疹止癢噴劑誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞分化

觀察不同濃度消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT分化蛋白表達(dá)的影響，免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2 μL·mL-1消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞分化調(diào)控蛋白tPA及CD147無明顯抑制作用。但6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞分化調(diào)控蛋白tPA及CD147的表達(dá)有顯著抑制作用(圖3A)。CD147分子是一種新的低分化角質(zhì)形成的細(xì)胞標(biāo)志蛋白,可能抑制正常角質(zhì)形成細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的分化。運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，6 μL·mL-1消疹止癢噴劑能顯著抑制HaCaT細(xì)胞CD147的表達(dá)(圖3B)。

2.4 消疹止癢噴劑抑制HaCaT細(xì)胞遷移侵襲

圖2 不同濃度消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響注：A. 2 μL/ml消疹止癢噴劑能輕微促進(jìn)HcCaT細(xì)胞的增殖，10 μL/ml消疹止癢噴劑能明顯誘導(dǎo)HcCaT細(xì)胞的增殖；B. 考察消疹止癢噴劑對(duì)HcCaT細(xì)胞增殖核心蛋白PI3K及AKT蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用

圖3 不同濃度消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞分化指標(biāo)蛋白的作用注：A. 免疫印跡法考察消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞分化相關(guān)蛋白tPA及CD147表達(dá)的影響(GAPDH為內(nèi)參蛋白)；B. 免疫熒光實(shí)驗(yàn)考察消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞分化指示蛋白tPA及CD147表達(dá)的作用(標(biāo)尺50 μm)

圖4 消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞侵襲數(shù)目的影響注：A. 劃痕實(shí)驗(yàn)考察消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞在體外遷移能力的影響(標(biāo)尺100 μm)；B. 侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞侵襲能力的抑制作用(標(biāo)尺100 μm)

圖5 消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞侵襲數(shù)目的影響注：A. 劃痕實(shí)驗(yàn)考察消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞在體外遷移能力的影響(標(biāo)尺100 μm)；B. 侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞侵襲能力的抑制作用(標(biāo)尺100 μm)

圖6 消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)的影響注：A. 免疫印跡法評(píng)價(jià)消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的抑制作用；B. Realtime PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞MMP-2和MMP-9 mRNA水平的抑制作用

觀察不同濃度消疹止癢噴劑作用于不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響發(fā)現(xiàn)，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，細(xì)胞劃痕的愈合程度呈遞減趨勢(shì)，結(jié)果以0 h和48 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)為例，呈現(xiàn)空白對(duì)照組和消疹止癢噴劑作用不同時(shí)間點(diǎn)HaCaT細(xì)胞的劃痕愈合情況，并在0 h和48 h測(cè)量每組HaCaT細(xì)胞顯微鏡圖像中空白間距測(cè)量間距(單位為CM)。如圖4A顯示，在消疹止癢噴劑0 μL·mL-1組0 h空白處研究發(fā)現(xiàn)，48 h時(shí)對(duì)照組劃痕區(qū)域的HaCaT細(xì)胞發(fā)生明顯遷移，而隨著消疹止癢噴劑濃度的增加，劃痕區(qū)域細(xì)胞愈合程度呈降低趨勢(shì)。觀察不同濃度消疹止癢噴劑對(duì)HaCaT細(xì)胞Transwell小室侵襲能力的影響發(fā)現(xiàn)，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，細(xì)胞侵襲能力呈遞減趨勢(shì)。圖4B顯示，100×顯微鏡觀察HaCaT細(xì)胞侵襲情況，對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)目較多，消疹止癢噴劑各濃度組處理24 h后，細(xì)胞侵襲數(shù)目與對(duì)照組比較呈降低趨勢(shì)，200×顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野來計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲的數(shù)目，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，2 μL·mL-1消疹止癢噴劑可以抑制MDA-M-231細(xì)胞侵襲(P<0.05)， 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止癢噴劑可以顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲(P<0.01)。

2.5 消疹止癢噴劑抑制RAW264.7細(xì)胞遷移及侵襲

觀察不同濃度消疹止癢噴劑作用于不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞遷移的影響發(fā)現(xiàn)，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞劃痕的愈合程度呈遞減趨勢(shì)。圖5A顯示，在劃痕后48 h時(shí)，對(duì)照組劃痕區(qū)域的RAW264.7細(xì)胞發(fā)生明顯遷移，而隨著消疹止癢噴劑濃度的增加，劃痕區(qū)域RAW264.7細(xì)胞的愈合程度呈降低趨勢(shì)。與遷移結(jié)果一致，消疹止癢噴劑對(duì)細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)，隨著消疹止癢噴劑濃度的提高，RAW264.7細(xì)胞穿過Transwell小室的侵襲能力呈遞減趨勢(shì)。圖5B顯示，對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)目較多，消疹止癢噴劑在2 μL·mL-1時(shí)可以抑制RAW264.7細(xì)胞的侵襲(P<0.05)，在6 μL·mL-1和10 μL·mL-1時(shí)可以顯著抑制RAW264.7細(xì)胞侵襲(P<0.01)。

2.6 消疹止癢噴劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞MMP-2/9蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平的影響

圖6A顯示，Western blotting結(jié)果顯示，消疹止癢噴劑作用24 h后可以在一定程度上劑量依賴性地抑制RAW264.7細(xì)胞中MMP-2/9的蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，消疹止癢噴劑顯著抑制MMP-2、MMP-9 的mRNA表達(dá)。Realtime PCR的結(jié)果采用ddCT法進(jìn)行計(jì)算后，圖6B顯示RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，MMP-2、MMP-9在消疹止癢噴劑2 μL·mL-1時(shí)較對(duì)照組(消疹止癢噴劑0 μL·mL-1)的表達(dá)量有較弱降低，約為對(duì)照組表達(dá)量的3/4；MMP-2、MMP-9在消疹止癢噴劑6 μL·mL-1時(shí)，較對(duì)照組(消疹止癢噴劑0 μL·mL-1)其表達(dá)量顯著降低，約為對(duì)照組表達(dá)量的1/2；MMP-2、MMP-9在消疹止癢噴劑10 μL·mL-1時(shí)，較對(duì)照組其表達(dá)量顯著降低，約為對(duì)照組表達(dá)量的1/4。

3 討論

3.1 眾所周知，腫瘤已成為人類健康的最大殺手，人類一直不遺余力地尋找治療腫瘤的最佳方法。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，對(duì)靶向藥物的研究逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的主要突破點(diǎn)，受到醫(yī)學(xué)界的普遍重視。越來越多的抗腫瘤分子靶向藥物被應(yīng)用于臨床而發(fā)揮良好的療效，在眾多的靶向藥物當(dāng)中，表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(EGFRI)目前應(yīng)用最為廣泛[9]。EGFRIs已經(jīng)證明，可改善非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、大腸癌患者的總生存期，靶向藥物耐受性好，通常出現(xiàn)輕微或中度的毒副反應(yīng)。盡管大多數(shù)不良反應(yīng)是可以得到迅速處理的，但是嚴(yán)重甚至危及生命的不良反應(yīng)仍能夠發(fā)生，其中最常見的是皮膚不良反應(yīng)[10]。通過皮膚活檢的方法，研究吉非替尼治療前和治療過程中的皮膚變化，發(fā)現(xiàn)治療前和治療中表皮厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但治療后顆粒層變薄且部分中斷。另外，治療后患者的嗜酸性粒細(xì)胞角質(zhì)層變薄，伴有散在的角化不全灶，且該層正常的網(wǎng)紋型特征消失。研究者還在某些標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，苔蘚樣組織反應(yīng)發(fā)生在毛囊和毛囊間的皮膚，中性粒細(xì)胞毛囊炎、角蛋白栓以及漏斗擴(kuò)大微生物沉積也有報(bào)告[11]。組織活檢發(fā)現(xiàn)，真皮淺層周圍的混合性炎癥浸潤(rùn)(特別是濾泡周圍)、濾泡破裂以及表皮皮膚棘層松解。顯微鏡下觀察痤瘡樣皮疹病灶發(fā)現(xiàn)，有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的毛囊炎和毛囊周圍炎，其他研究亦獲同樣的結(jié)論。同時(shí)發(fā)現(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞增殖標(biāo)志物PI3K和AKT表達(dá)顯著減少。角質(zhì)細(xì)胞是EGFRI介導(dǎo)皮膚毒性的作用靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)研究表明，EGFRI對(duì)皮膚黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均無作用，而EGFRI作用于增殖的未分化角質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)終末分化標(biāo)記如tPA、CD147的表達(dá)[12]。

為盡量排除和減少藥物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和增殖抑制作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選用濃度范圍在(2 μL·mL-1～10 μL·mL-1)的消疹止癢噴劑作為研究對(duì)象，主要的目的是觀察其對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化及遷移侵襲能力的影響。本研究通過MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，消疹止癢噴劑可以劑量依賴性地促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)目。通過劃痕愈合試驗(yàn)和Transwell小室侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，消疹止癢噴劑可以抑制角質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移以及侵襲能力，通過Western blot技術(shù)觀測(cè)消疹止癢噴劑對(duì)角質(zhì)細(xì)胞增殖分化相關(guān)因子的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，角質(zhì)細(xì)胞中的PI3K和AKT在加入不同濃度的消疹止癢噴劑處理后，其蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)消疹止癢噴劑可以抑制角質(zhì)細(xì)胞中分化調(diào)控蛋白tPA及CD147的表達(dá)。

有研究證實(shí)，EGFRI通過增加在基底層的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑P27、角蛋白-1、信號(hào)轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活因子3的表達(dá)，引起基底角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和過早成熟分化，同時(shí)伴有炎性巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。為進(jìn)一步探究消疹止癢噴劑在體外是否能抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞遷移侵襲過程，以及是否是通過降低MMP-2/9的表達(dá)進(jìn)而抑制遷移侵襲，分別采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Tranwell侵襲實(shí)驗(yàn)及免疫印跡實(shí)驗(yàn)開展相關(guān)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消疹止癢噴劑能抑制RAW264.7細(xì)胞MMP-2/9蛋白的表達(dá)，同時(shí)對(duì)MMP-2/9的mRNA水平表達(dá)亦有顯著降低效應(yīng)。但需要注意的是，本實(shí)驗(yàn)所涉及的細(xì)胞模型均采用的是正常狀態(tài)下的細(xì)胞，為進(jìn)一步真實(shí)還原病理狀態(tài)下的細(xì)胞模型，本課題組考慮今后選用被EGFRI類藥物刺激狀態(tài)下的角質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞模型。此外，EGFRI類藥物是針對(duì)EGFR基因突變研究出的分子靶向藥物，我們通過對(duì)相關(guān)基因的敲除建立裸鼠模型，比較研究“消疹止癢噴劑”對(duì)EGFRI相關(guān)性皮疹的作用機(jī)制。

3.2 隨著EGFRI類藥物的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)問題愈加突出，尤以皮疹發(fā)生率最高，對(duì)EGFRI相關(guān)性皮疹的治療也迫在眉睫。目前最常用的方法包括局部使用抗生素、類固醇激素或口服抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑等。但由于抗生素存在耐藥性、類固醇激素易誘發(fā)潰瘍病等弊端，其臨床應(yīng)用受到極大限制[13]。眾多研究者更有興趣從中醫(yī)藥中尋找安全、有效的藥物，以改善治療EGFRI相關(guān)性皮疹[14]?！跋钪拱W噴劑”為我院自制外用中藥制劑，含紫草、野菊花等5味中藥，多年的臨床試驗(yàn)證實(shí)該制劑可有效治療EGFRI相關(guān)性皮疹，且未見明顯不良反應(yīng)。本文通過研究該制劑對(duì)角質(zhì)細(xì)胞和炎性巨噬細(xì)胞的作用，從微觀角度闡明該制劑治療EGFRI相關(guān)性皮疹的作用機(jī)理。目前，在靶向藥物相關(guān)皮疹的預(yù)防和治療方面，中西醫(yī)尚無統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)。本課題組前期對(duì)消疹止癢噴劑進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，結(jié)合本次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地研究了該制劑對(duì)此類藥疹的藥理作用及機(jī)制，顯示了中醫(yī)藥在治療靶向藥物相關(guān)皮疹方面具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，值得臨床推廣使用并深入分析。此外，中西藥治療各有優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)西藥治療引起的副作用輔以中藥治療，也為中西醫(yī)如何有機(jī)結(jié)合實(shí)現(xiàn)高效低毒提供了參考。

[1] 應(yīng)松鶴. 抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)回顧性分析與管理建議[J]. 中醫(yī)藥管理雜志, 2016, 24(14): 65-66.

[2] 龍玲, 孫德佳, 葉容. EGFR分子靶向藥物痤瘡樣皮疹中皮膚護(hù)理方法探討[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué), 2012, 21(18): 605-605.

[3] 龍庭鳳, 何黎, 李云霞, 等. EGFRI抗腫瘤靶向藥物皮膚不良反應(yīng)的表現(xiàn)和防治[J]. 皮膚病與性病, 2012, 34(5): 271-273.

[4] 錢軍, 李慧, 秦叔逵. EGFRI皮膚毒性的發(fā)生機(jī)制和處理策略[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2009, 17(6): 1186-1191.

[5] 蘆源, 關(guān)洪全. 小鼠背部慢性皮炎—濕疹模型的初步研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 11(10): 181-182.

[6] 張樹孝, 宋亞麗. 皮質(zhì)類固醇激素外用的副作用及其防治[J]. 中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志, 2002, 8(2): 109-110.

[7] 王利東, 莫建澍, 王彬彬. EGFRIs相關(guān)的藥物性皮疹的中西醫(yī)診治[J]. 中國(guó)腫瘤, 2015, 24(2): 134-138.

[8] 陳琳, 程宗琦, 閆兆威, 等. 消疹止癢噴劑對(duì)皮炎及瘙癢模型小鼠的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(17): 129-133.

[9] 陳喆, 戴媛媛, 湯致強(qiáng). 小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑鹽酸埃羅替尼[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2005, 14(10): 1227-1229.

[10] 周暉, 王芳, 唐旭華, 等. EGFRIs抗腫瘤靶向藥物相關(guān)皮膚不良反應(yīng)及治療進(jìn)展[J]. 皮膚性病診療學(xué)雜志， 2015, 22(4): 328-331.

[11] 吳洪斌. 吉非替尼不良反應(yīng)的臨床表現(xiàn)及其處理[J]. 藥物不良反應(yīng)雜志, 2006, 8(1): 28-30.

[12] 夏磊, 李平. EGFRI治療腫瘤所致皮疹的治療進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志, 2012, 24(7): 695-696.

[13] 陳春霞, 王娟, 何遠(yuǎn)清. 中醫(yī)辨證護(hù)理聯(lián)合LG09方治療EGFR—TKI所致皮疹臨床觀察[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志, 2015, 27(12): 1757-1759.

[14] 王邈, 何俗非, 賈英杰. 以中醫(yī)透邪思想分析EGFR抑制劑療效與其所致皮疹的相關(guān)性[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 27(3): 409-410.

?基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460759)-蒙藥十三味紅花密訣丸治療過敏性鼻炎的實(shí)驗(yàn)機(jī)制研究

Study on the Cytological Mechanism of the Treatment of EGFRI Associated Eruption with Xiao Zhen and Antipruritic Spray

CHENG Zong-qi1,2,CHEN Lin2, YAO Xin2, JIN Yi2
(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China; 2.FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215006，China)

Objective: To explore the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on keratinocyte proliferation and differentiation and the effect on macrophage infiltration.Methods:MTT method was used to observe the different concentrations of Xiaozhen Zhiyang spray on skin keratinocytes HaCaT growth effect; Wound healing and Transwell experiment was used to examine the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on HaCaT and macrophage RAW264.7 exercise ability; Western blotting experiment was used to investigate the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on the proteinic expression of PI3K, AKT, tPA and CD147 in HaCaT cells and MMP-2, MMP-9 in RAW264.7 cells. RT-PCR was used to investigate the effects of Xiaozhen Zhiyang spray on MMP-2 and MMP-9 mRNA levels in RAW264.7 cells. Results: Xiaozhen Zhiyang Spray can dose dependently promote the proliferation of HaCaT cells and inhibit its differentiation.In wound healing and transwell experiment, the migration number and invasive ability of HaCaT and macrophage RAW264.7 decreased with Xiaozhen Zhiyang Spray concentration increased. Xiaozhen Zhiyang Spray can also dose dependently inhibit the expression of proliferation protein PI3K and AKT, and decrease the expression of differentiation protein tPA and CD147. In addition, Xiaozhen Zhiyang spray can significantly inhibit the mRNA and protein expression of MMP2 and MMP9 in RAW264.7. Conclusion: Xiaozhen Zhiyang spray can promote keratinocyte proliferation and reduce the infiltration of macrophage,which is one of the important mechanisms for the treatment of EGFRI associated skin rashes.

Xiaozhen Zhiyang Spray; HaCaT; RAW264.7; Proliferation and differentiation; Migration and invasion

2015年度江蘇省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(YB2015175)-基于EGFR信號(hào)通路研究“消疹止癢噴劑”對(duì)EGFRI相關(guān)性皮疹的作用機(jī)制；蘇州市2014年度科技發(fā)展計(jì)劃(SYSD2014144)-消疹止癢噴劑治療腫瘤患者靶向藥物治療相關(guān)性皮疹的臨床療效及其機(jī)制研究

程宗琦，男，主任藥師，從事中藥藥劑學(xué)與藥事管理研究。

R751

B

1006-3250(2017)08-1078-07

2017-02-18