婁菲菲，方 超，潘利敏，王月華△，丁英鈞，郭 帥，李 英(. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 05008； . 河北省滄州市中西結(jié)合醫(yī)院，滄州 0600； . 河北省中醫(yī)院，石家莊 0500； . 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 05000)

【實(shí)驗(yàn)研究】

腎絡(luò)通對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞VEGF和Flt-1的影響?

婁菲菲1，方 超2，潘利敏3，王月華1△，丁英鈞4，郭 帥1，李 英1
(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 050081； 2. 河北省滄州市中西結(jié)合醫(yī)院，滄州 061001； 3. 河北省中醫(yī)院，石家莊 050011； 4. 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200)

目的:探討腎絡(luò)通對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR1/Flt-1)的影響。方法:將12只SPF級(jí)雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和低、中、高劑量中藥組。對(duì)照組給予生理鹽水，處理組給予不同劑量的腎絡(luò)通中藥灌胃，各組均在灌胃3 d后心臟無菌取血制備中藥血清，小鼠足細(xì)胞的培養(yǎng)分為空白對(duì)照組、高糖組、正常鼠血清對(duì)照組和低、中、高劑量中藥血清組，刺激24 h后采用免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)、免疫印跡(western blot)、熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)法觀察VEGF、Flt-1表達(dá)的變化。結(jié)果：VEGF、Flt-1在高糖組和正常鼠血清組小鼠足細(xì)胞均可見陽(yáng)性表達(dá)，中藥血清組的足細(xì)胞VEGF、Flt-1蛋白和mRNA均較高糖組和正常鼠血清組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：腎絡(luò)通可抑制高糖環(huán)境下足細(xì)胞VEGF、Flt-1的表達(dá)，減輕足細(xì)胞的損傷，保護(hù)腎功能。

糖尿病腎??；中藥；足細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者重要的并發(fā)癥之一，以糖尿病為原發(fā)病的慢性腎臟病患者罹患更高的死亡率、心血管事件和腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)[1]，DN現(xiàn)已成為導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的重要病因。

前期研究中，我們以益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)為DN的治療大法，研究證實(shí)該法通過對(duì)DN大鼠TGF-β/Smads、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素-醛固酮(RASS)系統(tǒng)、足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白[2]的影響發(fā)揮對(duì)DN的治療作用。本研究繼以高糖環(huán)境下培養(yǎng)的足細(xì)胞為研究對(duì)象并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平觀察腎絡(luò)通對(duì)高糖刺激足細(xì)胞VEGF及Flt-1表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠12只，體質(zhì)量200～220 g(動(dòng)物合格證編號(hào)1404079)，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物及細(xì)胞

腎絡(luò)通組成：地龍12 g，鱉甲15 g，丹參15 g，大黃6 g，僵蠶10 g，烏梢蛇10 g，水蛭3 g，黃芪20 g，玄參15 g，熟地15 g，山萸肉10 g，均為免煎顆粒(廣東一方制藥有限公司)。中劑量中藥組為臨床劑量，低、高劑量分別為臨床的半量和2倍用量，按Meeh-Rubner公式[3-4]折算。永生化小鼠足細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗小鼠VEGF多克隆抗體，Affitiny AF5131(英國(guó)EterLife公司)；兔抗小鼠Flt-1多克隆抗體，Affinity AF6204(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)； HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，Maibio HSA0003(上海麥約爾生物技術(shù)有限公司)。表1顯示，VEGF、Flt-1、GAPDH引物由廣州復(fù)能基因有限公司合成；Real-time PCR試劑盒，Takara公司；轉(zhuǎn)移電泳儀，北京六一儀器廠；PCR擴(kuò)增儀，西安天隆科技有限公司；Real-time PCR儀，美國(guó)Stratagene Mp3005p。

2 方法

2.1 分組與血清制備

按隨機(jī)數(shù)字表法將12只SD大鼠分為正常對(duì)照組和低、中、高劑量中藥血清組，適應(yīng)性飼養(yǎng)24 h后，每只大鼠每12 h灌胃1次，連續(xù)給藥3 d后心臟無菌取血制備藥物血清。

2.2 小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 將凍存管取出后迅速放入37 ℃水浴箱中，勿使水面沒過凍存管口以免造成細(xì)胞污染，待凍存液溶解后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 小鼠足細(xì)胞在底面積75 cm2的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，加入完全培養(yǎng)基，包括10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、10U/ml小鼠重組γ-IFN、雙抗100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素(P/S)。將細(xì)胞接種均勻后置于33 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中增殖，細(xì)胞密度約80%時(shí)傳代，在無γ-IFN的培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，待細(xì)胞分化成熟后血清饑餓24 h。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(Normal Control，NC)、高糖組(High Glucose，HG)、正常鼠血清組(Normal Rat，NR)、低劑量中藥血清組(Low dose of drug，LD)、中劑量中藥血清組(Normal dose of drug，ND)、高劑量中藥血清組(High dose of drug，HD)。NC組細(xì)胞培養(yǎng)基為D-glucose 5.5 mmol/L+5%FBS，HG組培養(yǎng)基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS，NR組培養(yǎng)基為D-glucose 30mmol/L+5%FBS+5%正常鼠血清，LD組培養(yǎng)基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS+5%低劑量中藥血清，ND組培養(yǎng)基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS+5%中劑量中藥血清，HD組培養(yǎng)基為D-glucose 30 mmol/L+5%FBS+5%高劑量中藥血清。刺激24 h后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué) 將細(xì)胞接種于鋪有載玻片的24孔板，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌后空氣干燥，于玻片上滴加預(yù)冷的4%多聚甲醛200～300 μL，4℃過夜。次日用蒸餾水洗滌玻片后用PBS浸泡5 min，再將玻片放入3% H2O2去離子水中，室溫30 min，0.3%Triton X-100通透30 min，10%BSA封閉，室溫10 min。將兔抗鼠VEGF多克隆抗體(Affitiny AF5131 1∶100)、兔抗鼠Flt-1多克隆抗體(Affinity AF6204 1∶100)分別滴加于玻片上， 4 ℃過夜。次日取出玻片用PBS洗滌，隨后將HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Maibio HSA0003)滴加于載玻片細(xì)胞面，室溫避光30 min。加入顯色液反應(yīng)后蒸餾水沖洗，蘇木素染1 min，充分沖洗后置于不同濃度的乙醇中梯度脫水，中性樹膠封片后光鏡下觀察VEGF、Flt-1的表達(dá)情況。

2.3.2 免疫印跡 取出足細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌，吸干PBS加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后將細(xì)胞混懸液收集， 4 ℃、12000 rpm/min離心10 min，吸取上清即為細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，蛋白上樣量40 μg，濃縮膠40V，分離膠60V恒壓進(jìn)行電泳，隨后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印2 h，結(jié)束后用 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。滴加兔抗鼠VEGF多克隆抗體(Affitiny AF5131 1∶100),兔抗鼠Flt-1多克隆抗體(Affinity AF6204 1∶100)，4 ℃過夜。次日洗膜后用山羊抗兔二抗室溫孵育60 min。TBST洗膜后放入Image Quant Las mini成像系統(tǒng)， Image J進(jìn)行灰度分析，以對(duì)照組為l，計(jì)算余組表達(dá)量。

2.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 提取細(xì)胞總RNA在培養(yǎng)瓶中加入Trizol 1ml，15 min后將細(xì)胞收集至EP管中，每管加入200 μL三氯甲烷混勻，隨后4℃12000 rpm/min離心20 min，取上層水相移至新的EP管后，加入等體積異丙醇混勻后冰上靜置15 min。4℃12000 rpm/min離心20 min，棄上清后干燥，75%無水乙醇lml充分洗滌RNA沉淀再次離心，棄上清后室溫干燥，加入適量1‰ DEPC水溶解RNA，并用槍輕柔吹打混勻，對(duì)RNA樣品進(jìn)行品質(zhì)鑒定?；靹騊CR Mix并將室溫孵育1 h。表1顯示，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)后記錄CT值。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-△△CT法進(jìn)行分析，以對(duì)照組為1，計(jì)算其他各組的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)VEGF、Flt-1

圖1、2顯示，顯微鏡下觀察VEGF、Flt-1主要在足細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，在正常組的細(xì)胞漿內(nèi)少量表達(dá)；高糖組、正常鼠血清組在細(xì)胞漿、核周均可見陽(yáng)性表達(dá)，2組表達(dá)量相近。中藥組胞漿中的表達(dá)均較高糖組、正常鼠血清組低，且中劑量中藥組VEGF、Flt-1的表達(dá)較弱。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)VEGF的表達(dá)(×200)

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) Flt-1 的表達(dá)(×200)

3.2 免疫印跡法檢測(cè)VEGF、Flt-1蛋白表達(dá)量

圖3、4顯示，高糖組、正常鼠血清組VEGF表達(dá)明顯升高，2組與空白對(duì)照組和中劑量中藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥組較高糖組、正常鼠血清組VEGF表達(dá)量降低，且用藥劑量與VEGF表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。Flt-1與VEGF趨勢(shì)一致，高糖和正常鼠血清組均出現(xiàn)高表達(dá)，中藥組表達(dá)量降低。

圖4 免疫印跡檢測(cè)VEGF和 Flt-1蛋白表達(dá)量

3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)VEGF、Flt-1的mRNA表達(dá)量

圖5顯示，高糖組和正常鼠血清組VEGF mRNA表達(dá)量均較空白對(duì)照組和中藥組高(P<0.05)。中藥組較高糖組和正常鼠血清組VEGF表達(dá)下調(diào)，且藥物劑量與VEGF呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Flt-1 mRNA表達(dá)趨勢(shì)與VEGF大致一致，中藥組較高糖組和正常鼠血清組顯著降低，說明劑量越大表達(dá)量越低。

表1 VEGF FLT-1 GAPDH基因序列

4 討論

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VEGF 和 Flt-1的mRNA表達(dá)量

足細(xì)胞是腎小球血管壁的主要成分之一，對(duì)于維持血管壁的完整性至關(guān)重要。足細(xì)胞的損傷會(huì)導(dǎo)致腎小球高壓力、高濾過，加速蛋白尿的產(chǎn)生和腎臟病的進(jìn)展。微血管病變是DN發(fā)病及病情進(jìn)展的重要因素，VEGF是體內(nèi)最具活力的血管生長(zhǎng)因子，在DN微血管病變中的意義重大，其在腎臟內(nèi)主要由足細(xì)胞分泌，并且在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞中均有一定表達(dá)。Flt-1、Flk為VEGF的特異性受體，其中Flt-1參與細(xì)胞的增殖和分化過程，全長(zhǎng)7680 bp位于13q12號(hào)染色體上，分子量約180KD，由7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和酪氨酸激酶區(qū)構(gòu)成，可結(jié)合于VEGF121、VEGF165[5]。VEGF過表達(dá)并通過旁分泌途徑對(duì)酪氨酸激酶受體Flt-1發(fā)揮正向調(diào)控作用，二者結(jié)合后才能激活一系列信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6]，最主要的是可以增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，并可能會(huì)使足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、足突融合，使腎小球?yàn)V過屏障受損，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生，加速DN的進(jìn)展[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在血管生成過程中可激活Notch信號(hào)通路。John C. Chappell等[10]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lt-1作為Notch信號(hào)通路的上游，通過調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)可以在血管形成的過程中介導(dǎo)重要的VEGF-Notch通路反饋環(huán)，F(xiàn)lt-1調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)功能的缺失會(huì)使Notch信號(hào)過高表達(dá)。Flt-1在此信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，其缺失會(huì)使信號(hào)通路出現(xiàn)紊亂，且Flt-1基因敲除后會(huì)導(dǎo)致靜脈出現(xiàn)畸形。

由于DN發(fā)病率的升高，越來越多的患者因長(zhǎng)期血糖控制欠佳進(jìn)展至終末期腎臟病，遠(yuǎn)期預(yù)后不良。中醫(yī)藥對(duì)于DN治療有一定的優(yōu)勢(shì)，臨床常能取得較好療效。我們認(rèn)為，DN的基本病機(jī)是氣虛無力運(yùn)血而致血瘀，陰虛火旺、煎熬津液、津虧液少則血液黏稠不暢而致“陰虛血瘀”，病久不愈深伏于腎絡(luò)漸成微小癥積，致使腎體受損、腎用失司導(dǎo)致DN的發(fā)生。結(jié)合“病久必瘀、病久入絡(luò)”的中醫(yī)學(xué)理論，提出該病位在絡(luò)，“瘀血癥積阻于腎絡(luò)”可能是病機(jī)之關(guān)鍵，同時(shí)結(jié)合DN氣陰兩虛的基本病機(jī)，經(jīng)過臨證的反復(fù)篩選確定了一個(gè)相對(duì)固定治療DN的基本方腎絡(luò)通，以消癥通絡(luò)為主兼以益氣養(yǎng)陰。其中黃芪、玄參益氣養(yǎng)陰，地龍、僵蠶、烏梢蛇、鱉甲等消癥通絡(luò)。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)[2、11-13]中，我們運(yùn)用腎絡(luò)通治療早期DN患者，發(fā)現(xiàn)其化驗(yàn)指標(biāo)、臨床癥狀、體征和生存質(zhì)量都得到顯著改善。本研究在前期的基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，模擬DN患者體內(nèi)的高糖環(huán)境，觀察腎絡(luò)通對(duì)足細(xì)胞VEGF和Flt-1表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)其對(duì)于早期DN足細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，高糖組和正常鼠血清組VEGF、Flt-1高水平表達(dá)，而在中藥組中顯著降低，預(yù)期進(jìn)一步可降低血管通透性，改善腎小球高濾過，從而減輕足細(xì)胞的損傷和蛋白尿的產(chǎn)生，起到保護(hù)腎功能、改善預(yù)后的作用。

[1] MARIA L GONZALEZ SUAREZ, DAVID B THOMAS, LAURA BARISONI, et al. Diabetic nephropathy: Is it time yet for routine kidney biopsy [J]. World J Diabetes, 2013, 4(6): 245-255.

[2] 王月華，潘利敏，方超,等.腎絡(luò)通對(duì)糖尿病腎病大鼠裂孔膜蛋白的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2014,20(11)：1496-1498.

[4] HAI LU, JIANMING JIANG, GUOPING XIE, et al. Effects of an aqueous extract of Eucommia on articular cartilage in a rat model of osteoarthritis of the knee [J].Exp Ther Med, 2013,6(3): 684-688.

[5] SHIBUYA M. Angiogenesis vascular endothelia growth factor and it receptors [J].Human Cell, 1999, 12(1):17-24.

[6] 葉仁群，謝嘉嘉，林國(guó)彬，等. 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)早期糖尿病腎病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體Flt-1的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2009,10(2)：137-139.

[9] ADVAIN A. Vascular endothelial growth factor and the kidney: something of the marvelous[J]．Curr Opin Nephrol Hypertens, 2014,23(1): 87-92．

[10] JOHN C , CHAPPELL, KEVIN P,et al. Flt-1(VEGFR-1) is essential for the VEGF-Notch feedback loop during angiogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013,33(8): 1952-1959.

[11] 張江華，陳志強(qiáng)，趙雯紅，等．益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥對(duì)早期糖尿病腎病大鼠24 h尿蛋白及nephrin、podocin基因表達(dá)的相關(guān)性分析[J]．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(10): 671-675．

[12] 張江華，陳志強(qiáng)，趙雯紅，等．益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥對(duì)早期糖尿病大鼠腎組織Podocin 基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2014,34(6): 3044-3046．

[13] 陳志強(qiáng)，方敬，王月華，等.益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥治療早期糖尿病腎病的臨床觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015,16(11):962-964.

Effects of Shentongluo on VEGF and Flt-1 in Podocytes Cultured with High Glucose

LOU Fei-fei1, FANG Chao2, PAN Li-ming3, WNAG Yue-huang1△,DING Ying-jun4, GOU Shuai1, LI Ying1
(1.No.3HospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050081，China; 2.CangzhouHospitalofIntergratedTraditionalChineseandWesterMedicine,Hebei,Congzhou061001,China; 3.TraditionalChineseHospitalofHebeiProvince,Shijiazhang050011,China; 4.CollegeofTraditionalChineseMedicine,Shijiazhuang050200,China)

Objective: To observe the effect of Shen Luo Tong on diabetic nephropathy VEGF and FLT-1. Method: 12 healthy SPF male rats were randomly divided into the control group and experimental groups with six rats in each group. The control group was given normal saline through gavage while the experimental groups were given different doses of the traditional Chinese medicine through gavage for 3 days. Then the rats were sacrificed to collect blood samples from heart. The culture podocytes of rats were divided into the control group, high glucose group, normal rat serum group and another three serum groups were treated by different doses of Chinese medicine. After stimulated for 24hours, the expression of VEGF and Flt-1 were observed by the method of immunocytochemistry、 western blot and real-time PCR.Results: The protein and mRNA expression of VEGF and Flt-1 in normal rat serum group and high glucose group can be clearly observed as positive. The expression in Chinese medicine serum stimulated group was lower compared to high glucose group and normal rat serum group (the difference has statistical significance). Conclusion: The expression of VEGF and Flt-1 of podocyte can be suppressed by Shen Luo tong which can contribute to protect podocytes from injury and renal dysfunction.

Diabetic nephropathy; Traditional Chinese medicine; Podocyte; Vascular endothelial growth factor

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202829)

婁菲菲(1988-)，女，河北滄州人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合腎臟病的臨床與基礎(chǔ)研究。

△通訊作者：王月華(1973-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事慢性腎臟病的臨床與基礎(chǔ)研究， E-mail:wangyuehua@medmail.com.cn。

R587.1

B

1006-3250(2017)08-1074-04

2017-01-10