王翠翠陳建玲唐子華邱世偉張翠李亮郭維維楊仕明王金福

1浙江大學紫金港校區(qū)，生命科學學院，細胞與發(fā)育研究所（杭州310058）

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻喉研究所（北京100853）

·基礎研究·

iPSCs定向分化的內(nèi)耳毛細胞與支持細胞間相互作用的研究

王翠翠1陳建玲1唐子華1邱世偉2張翠1李亮1郭維維2楊仕明2王金福1

1浙江大學紫金港校區(qū)，生命科學學院，細胞與發(fā)育研究所（杭州310058）

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻喉研究所（北京100853）

目的利用誘導多能性干細胞定向分化的內(nèi)耳毛細胞和支持細胞探究這兩種體外誘導分化細胞之間的相互作用。方法首先，利用細胞單層貼壁兩步誘導法將三株iPS細胞（野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株）向內(nèi)耳祖細胞及內(nèi)耳毛細胞誘導分化，探究iPSCs定向分化內(nèi)耳毛細胞的過程中是否有支持細胞的產(chǎn)生；其次，通過細胞免疫化學的方法探究體外分化的內(nèi)耳毛細胞和支持細胞間的相互作用;最后，將表達綠色熒光蛋白（EGFP）的上皮樣內(nèi)耳祖細胞以圓窗膜穿刺的方法移植到白化榮昌豬的內(nèi)耳中觀察分析移植細胞在體內(nèi)的遷移、分化以及在體內(nèi)形成的聯(lián)系。結(jié)果三株iPS細胞誘導分化為內(nèi)耳毛細胞的過程中均有一部分細胞分化為支持細胞；對分化細胞進行E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的免疫熒光檢測結(jié)果顯示，E-cadherin、N-cadherin和ZO-1在支持細胞-支持細胞連接和支持細胞-毛細胞連接間都有表達；移植4周后，耳蝸免疫組織化學結(jié)果顯示，三株不同來源的移植細胞均有少量細胞成功遷移到了毛細胞受損部位—柯底氏器，并表達毛細胞標志性蛋白MYO7A。移植細胞之間以及移植細胞與宿主細胞之間有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達。結(jié)論iPSCs誘導分化的內(nèi)耳毛細胞和支持細胞在體內(nèi)、外均能形成鈣粘連接和緊密連接。這些研究結(jié)果對毛細胞取代法治療耳聾策略的完善與發(fā)展有一定的科學意義。

耳聾;誘導多能性干細胞（iPSCs）;毛細胞;支持細胞;細胞間連接

Fund projects：the grants from National Basic Research Program of China(2014CB541705);Chinese National Science Foundation(81570932);Strategically Guiding Scientific Special Project from ChineseAcademy of Sciences(XDA04020202-23);National Development Program of Important Scientific Instrument(2013YQ030595);Opening Foundation of the State Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals andApplication(SMFA12K02);TZ-1Application Program(KYTZ01-0901-FB-003).

Disclosure of potential conflicts of interest:Authors indicate no potential conflicts of interest.

耳聾多數(shù)情況下由環(huán)境因素引起，比如頻繁暴露在高強度的聲音環(huán)境中、病毒感染和耳毒性藥物等等。由內(nèi)耳毛細胞和神經(jīng)細胞的缺失或損傷而導致的耳聾被稱為感音性耳聾，這是聽力損傷中最常見的一種，影響著全世界數(shù)以百萬計的人[1]。成體哺乳動物的耳蝸毛細胞屬于終末分化細胞，不具有再生修復能力，故由因其損傷引起的感音神經(jīng)性耳聾通常是不可逆的[2]。目前，針對感音性耳聾病人的常規(guī)療法主要是加裝助聽器和植入人工耳蝸，但由于毛細胞的不可再生性，這些手段并不能從病理上根治耳聾。近年來干細胞技術(shù)的發(fā)展為耳聾的治療提供了一個嶄新的更具前景性的方向[3,4]。胚胎干細胞（ESCs）和誘導多能性干細胞（iPSCs）在體外已經(jīng)被成功誘導成內(nèi)耳毛細胞樣細胞[5,6]。近來有研究表明基因突變導致毛細胞損傷的耳聾病人來源的特異性iPSCs經(jīng)基因校正后能產(chǎn)生形態(tài)和功能均正常的內(nèi)耳毛細胞樣細胞[7,8]。這種把誘導多能干細胞（iPS）技術(shù)和基因校正技術(shù)結(jié)合的研究將為毛細胞取代法治療感音性耳聾提供無限可能。

耳蝸螺旋器（Organ of Corti）是感受聲音刺激的聽覺感受器，主要由毛細胞和支持細胞組成。毛細胞不能直接附著在基底膜上，而是由支持細胞所依托和包繞，這說明毛細胞在機械和生理很大程度上由支持細胞維持[9]。不同于毛細胞僅僅是附著在基底膜的表面，支持細胞可以橫跨整個基底膜。支持細胞之間以及支持細胞和毛細胞之間通過鈣粘連接和緊密連接建立起聯(lián)系[10,11]，支持細胞之間還可以通過間隙連接進行離子交換[12]。支持細胞在感覺上皮發(fā)揮著重要的作用，不僅可以維持感覺器官結(jié)構(gòu)的完整性，而且可以維持上皮細胞的生存環(huán)境使毛細胞可以正常發(fā)揮功能[13]。支持細胞在非哺乳動物毛細胞損傷后的感覺修復方面也發(fā)揮了重要的作用。在非哺乳動物中，支持細胞利用有絲分裂再生和非有絲分裂再生兩種機制來代替受損的毛細胞[13]。某些情況下，支持細胞作為祖細胞可進入細胞周期，持續(xù)分裂產(chǎn)生出成熟的毛細胞和支持細胞，以替代消失的毛細胞；其他情況下，支持細胞還可以不通過有絲分裂直接轉(zhuǎn)分化為毛細胞。相比之下，在哺乳動物和人類的前庭系統(tǒng)，在毛細胞損害后出現(xiàn)非常有限的祖細胞分裂為再生的毛細胞，而在耳蝸系統(tǒng)，毛細胞不可再生。

因此，深入了解iPSCs誘導分化的內(nèi)耳毛細胞與支持細胞之間的相互作用關系是iPSCs用于毛細胞功能修復研究的重要前提條件。本文中，我們采用三株iPS細胞（野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株）進行內(nèi)耳毛細胞的誘導分化。首先，鑒定了在iPSCs定向誘導分化內(nèi)耳毛細胞的過程中同時產(chǎn)生了支持細胞。其次，通過檢測鈣粘連接蛋白（E-cadherin、N-cadherin）和緊密連接蛋白（ZO-1）的存在與分布初步確定體外誘導分化的內(nèi)耳毛細胞與支持細胞之間的關系。最后，我們將表達EGFP的上皮樣祖細胞通過圓窗膜穿刺的方法移植到白化榮昌豬的內(nèi)耳中觀察分析細胞的遷移、分化以及細胞連接。

1 材料和方法

1.1實驗細胞株和動物模型

所有的實驗過程包括涉及到的動物都通過了杭州市浙江大學倫理審查委員會的批準。由浙江省衛(wèi)生局批準，并且經(jīng)過浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院倫理委員會同意，我們成功采集到正常非耳聾患者、MYO7A雜合雙突變耳聾病人的及其父母的尿液。C-iPSCs由正常非耳聾患者（MYO7AWT/WT）的尿液細胞經(jīng)重編程誘導生成；P-iPSCs由MYO7A雜合雙突變耳聾病人（MYO7A c.1184 G＞A和MYO7A c.4118 C＞T）的尿液細胞經(jīng)重編程誘導生成；CP-iP?SCs是利用 CRISPR-Case9技術(shù)將 P-iPSCs中c.4118C＞T突變位點校正之后得到的細胞株[7]。

Mitf-M基因突變的白化榮昌豬是由中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻喉研究所提供，豬齡8周左右，體重約10Kg。

1.2實驗方法

1.2.1 iPS細胞向內(nèi)耳祖細胞及進一步向內(nèi)耳毛細胞誘導分化

本研究中，我們利用細胞單層貼壁兩步誘導法[6]，首先用 FGF3和 FGF10處理人iPS細胞10-12天，使其分化為內(nèi)耳上皮樣祖細胞。在第二步的向毛細胞方向誘導過程中，我們將細胞接到用laminin包被過的細胞爬片上，用添加了全反式視磺酸和EGF的雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)20天，這種誘導方法已經(jīng)證實可以產(chǎn)生具有靜纖毛束和電生理特性的毛細胞樣細胞[15]。

1.2.2內(nèi)耳祖細胞、內(nèi)耳毛細胞的基因表達檢測

使用Trizol試劑（TaKaRa）提取待檢測樣本的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Fermentas）從2μg總RNA合成cDNA，用作聚合酶鏈反應（PCR）中的模板。推薦的引物和產(chǎn)物大小見表1。使用瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像分析系統(tǒng)分析反應產(chǎn)物。使用Im?age J軟件對帶強度進行半定量分析。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real time-PCR

1.2.3細胞免疫熒光

待測樣品用4%多聚甲醛室溫下固定15min，0.01M PBS洗滌3次，每次5min；0.25%TritonX-100室溫下孵育樣品10min，0.01M PBS洗滌3次，每次5min；1%牛血清白蛋白封閉1h。加入一抗(an?ti-PAX8，1：100，Abcam；anti-PAX2，1：250，Abcam；anti-Nestin，1：250，Abcam；anti-SOX2，1：900，Ab?cam；anti-ATOH1，1：500，Abcam；anti-BRN3C，1：50，Abcam；anti-Myosin 7a，1：500，Abcam；anti-Espin，1:200，Santa Cruz；anti-p27 Kip1，1：100，R&D System；anti-ZO-1，1：100，Thermos Fisher；an?ti-E-cadherin，1:50，BD Biosciences；anti-N-cad?herin，1:50，BD Biosciences)4℃孵育過夜。0.01M PBS洗滌3次，每次5min。加入1:400二抗（Alexa Flour 594，Alexa Flour 488，Alexa Flour 405，Jack?son）避光室溫孵育1h。0.01M PBS洗滌3次，每次5min。加入DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚;Beyo?time），避光室溫作用1min，0.01M PBS洗滌5min。封片，進行共聚焦掃描成像。

1.2.4 穩(wěn)定表達 EGFP的上皮樣祖細胞（EGFP-OEPs）的制備及移植

慢病毒感染的方法使iPS細胞穩(wěn)定表達熒光標記蛋白EGFP，得到穩(wěn)定的EGFP-iPS細胞株；由EGFP-iPS誘導分化了12天的內(nèi)耳祖細胞利用差異消化法去除祖細胞中較早消化下來的神經(jīng)祖細胞（ONPs)，收集之后消化下來的上皮樣內(nèi)耳祖細胞（OEPs）用DMEM/F12配制成1×105個/μl的細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?。對動物的右耳進行手術(shù)，暴露圓窗，將提前準備好的EGFP-OEPs細胞懸液輕輕吹打均勻，吸入10μl于微量進樣器中，刺穿圓窗膜將細胞懸液緩慢注入耳蝸鼓階，用明膠海綿填塞圓窗龕，逐層縫合切口，碘伏消毒傷口。

1.2.5組織學切片免疫化學分析

榮昌豬經(jīng)4%多聚甲醛灌注后，解剖內(nèi)耳取出耳蝸；將耳蝸浸泡在4%多聚甲醛中固定過夜；10%EDTA常溫脫鈣4周；0.01M PBS緩沖液漂洗后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中4℃脫水過夜；0.01M PBS緩沖液漂洗后浸泡在OCT包埋劑中4℃過夜后進行冷凍切片。0.01M PBS緩沖液漂洗三遍，每遍15min，洗去OCT包埋劑，5%BSA室溫封閉1h，加入一抗（anti-EGFP,1：3000,Abcam;anti-Myosin VIIa,1：500，Abcam;anti-ZO-1,1：100，Thermos Fisher;anti-E-cadherin,1:50，BD Biosciences;an?ti-N-cadherin,1:50，BD Biosciences）4℃孵育過夜。0.01M PBS洗滌3次，每次15min。加入1:400二抗（Alexa Flour 594，Alexa Flour 488，Alexa Flour 674，Jackson）避光室溫孵育1h，0.01M PBS洗滌3次，每次5min。加入DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚;Be?yotime，），避光室溫作用1min，0.01M PBS洗滌5min。封片，進行共聚焦掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 iPS細胞向內(nèi)耳祖細胞及進一步向內(nèi)耳毛細胞誘導分化

三株不同來源的iPS細胞通過單層貼壁誘導分化的方法，在FGF3和FGF10同時存在的內(nèi)耳祖細胞誘導分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)12天后進行基因檢測和免疫熒光檢測。RT-PCR分析顯示，Pax2以及內(nèi)耳早期發(fā)育特異性基因（如Pax8，Dlx5，Six1，Eya-1和GATA3）在誘導細胞中均表達（圖1A）；三株細胞分化來的內(nèi)耳祖細胞在基因表達方面并無明顯差異（圖1B，P＞0.05）。對內(nèi)耳祖細胞標志性基因PAX8和PAX2（圖1C），PAX8和SOX2（圖1D），PAX8和Nestin（圖1E），進行免疫共標檢測，結(jié)果表明，三株iPS細胞均能誘導分化為內(nèi)耳祖細胞。

圖1 內(nèi)耳祖細胞檢測結(jié)果。（A）C-iPS細胞株，P-iPS細胞株，CP-iPS細胞株來源的內(nèi)耳祖細胞的標志性基因PAX2，PAX8，GATA3，EYA1，SIX1和DLX5的RT-PCR檢測。GAPDH的表達量作為對照。（B）對三株來源的內(nèi)耳祖細胞的標志性基因的表達進行量化分析，GAPDH的表達量作為對照。誤差線代表方差（n=3）。（C-E）三株iPS細胞株來源的內(nèi)耳祖細胞標志性基因PAX8和PAX2（C），PAX8和SOX2（D），PAX8和Nestin（E）的免疫共標檢測。比例尺為10μm。Fig.1 Identification of otic progenitors differentiated from human iPSCs.(A)RT-PCR analysis of the expression of early otic progenitor marker genes PAX2,PAX8,GATA3,EYA1, SIX1,and DLX5 in cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs.(B)The relative gene expression levels were quantified and plotted.The housekeeping gene GAPDH was used as an internal reference.Error bars represent the S.D.(n=3). (C-E)Co-expression of otic markers PAX8+PAX2(C), PAX8+SOX2(D),PAX8+NES(E)in otic progenitors derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs.Scale bars=10 μm.Nuclei were stained with DAPI(blue).

收集OEPs并在補充有EGF和全反式視黃酸的雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后進行基因檢測和免疫熒光檢測。RT-PCR分析顯示，在誘導的毛細胞樣細胞中表達毛細胞轉(zhuǎn)錄因子ATOH1和BRN3C、早期毛細胞結(jié)構(gòu)蛋白MYO7A以及毛束發(fā)育所需的蛋白質(zhì)ESPN（圖2A）；三株細胞分化來的內(nèi)耳毛細胞在基因表達方面并無明顯差異（圖2B，P＞0.05）。我們對內(nèi)耳毛細胞標志性基因BRN3C和ATOH1（圖2C），BRN3C和MYO7A（圖2D），BRN3C和ESPN（圖2E）進行免疫共標檢測，結(jié)果表明，三株iPS細胞均有向內(nèi)耳毛細胞分化的能力。

圖2 內(nèi)耳毛細胞檢測結(jié)果。（A）C-iPS細胞株，P-iPS細胞株，CP-iPS細胞株來源的內(nèi)耳毛細胞的標志性基因MYO7A、ATOH1、BRN3C和Espin以及支持細胞的標志性基因p27kip1的表達情況。GAPDH的表達量作為對照。（B）對三株來源的內(nèi)耳毛細胞和支持細胞的標志性基因的表達進行量化分析，GAPDH的表達量作為對照。誤差線代表方差（n=3）。（C-E）三株iPS細胞株來源的內(nèi)耳毛細胞標志性基因BRN3C和ATOH1（C），BRN3C和MYO7A（D），BRN3C和ESPN（E）的免疫共標檢測。比例尺為10μm。

2.2 iPS細胞體外誘導分化的內(nèi)耳毛細胞樣細胞和支持細胞間的相互作用

有文獻報道，在內(nèi)耳的發(fā)育過程中，內(nèi)耳毛細胞和支持細胞來自于同一種前體細胞[16]。因此，我們推測在iPS體外誘導分化為內(nèi)耳毛細胞的過程中有一部分細胞分化為支持細胞。為了證實這一推測，我們將三株不同來源的iPS細胞誘導分化成的內(nèi)耳毛細胞固定后用免疫熒光特異性標記支持細胞的標志性基因p27kip1。免疫標記顯示，分別有13.1%±2.7%、14.1%±2.9%和12.7%±2.7%的細胞表現(xiàn)為p27kip1和myosin7A雙陽性（圖3 A,B），我們將這類細胞視為未完全分化的處于分化初期的毛細胞；分別有7.6%±1.5%、9.1%±0.9%和7.2%± 1.7%的細胞僅表達p27kip1，而沒有表達myosin7A（圖3 C,D），我們將這類細胞視為支持細胞[17]。

圖3 誘導分化的毛細胞體系中MYO7A和p27kip1的免疫熒光檢測。（A）三株來源不同的iPS細胞誘導分化的內(nèi)耳毛細胞樣細胞中MYO7A和p27kip1的共標檢測。比例尺為20μm。（B）三株來源不同的iPS細胞誘導分化的內(nèi)耳毛細胞樣細胞中MYO7A和p27kip1雙陽性細胞在總體細胞所占比例的比較分析。誤差線代表方差(n=3)。（C）三株來源不同的iPS細胞誘導分化的內(nèi)耳毛細胞樣細胞中p27kip1的檢測。比例尺為20μm。（D）三株來源不同的iPS細胞誘導分化的內(nèi)耳毛細胞樣細胞中只表達p27kip1而不表達MYO7A的細胞在總體細胞所占比例的比較分析。誤差線代表方差（n=3）。Fig.3 Detection of MYO7A and p27kip1 expression.(A)The co-expression of MYO7A and p27kip1 in cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs were evaluated by immunochemistry.Scale bars=20 μm.(B)Percentage of MYO7A and p27kip1 double-positive cells in the total cell population derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs.Error bars represent SD(n=3).(C)The expression of p27kip1 in cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs were evaluated by immunochemistry.Scale bars=20 μm.(D)Percentage of p27kip1 positive cells in the total cell population derived from C-iPSCs, P-iPSCs,andCP-iPSCs.ErrorbarsrepresentSD(n=3).

此后，我們探究誘導分化成的毛細胞和支持細胞之間是否存在形態(tài)上的聯(lián)系。E-cadherin和N-cadherin是鈣粘蛋白家族中存在于鈣粘連接中的兩種經(jīng)典的跨膜糖蛋白，ZO-1是檢測緊密連接的一種常用蛋白。于是，本實驗中我們通過特異性檢測E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的存在和分布來判定毛細胞和支持細胞之間在形態(tài)上的關系。結(jié)果表明E-cadherin（圖4A）、N-cadherin（圖4B）和ZO-1（圖4C）在毛細胞-支持細胞之間以及支持細胞-支持細胞之間都存在。

圖4 三株iPS細胞來源的內(nèi)耳毛細胞樣細胞與支持細胞間細胞連接。三株不同來源的內(nèi)耳上皮樣內(nèi)耳祖細胞在lam?inin上誘導分化20天后毛細胞和支持細胞之間E-cad?herin（A）、N-cadherin（B）和ZO-1（C）的表達。其中毛細胞由MYO7A特異性標記，支持細胞由p27kip1特異性標記。比例尺為20μm。Fig.4 Intercellular junctions between hair cell-like cells and supporting cells derived from otic epithelial progenitors.Immunofluorescence of cells induced from otic epithelial progenitors derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs for 3 weeks on laminin showed positive labeling for(A)E-cadherin,(B)N-cadherin and(C)ZO-1 in the junction between hair cell-like cells marked with MYO7A and supporting cells marked with p27Kip1.Scale bars=20 μm.

2.3移植細胞在白化榮昌豬內(nèi)耳中的遷移、分化及細胞間連接

移植四周后，免疫組化結(jié)果顯示，移植細胞大部分以細胞團的形式存在于鼓階，小部分細胞遷移到了中階，其中只有極小部分細胞遷移到了毛細胞損傷部位-柯底氏器（圖5A）。為探究OEPs在耳蝸微環(huán)境中的分化潛能，我們對毛細胞標志物MYO7A進行免疫熒光檢測，結(jié)果表明，遷移到柯式器上的細胞部分呈MYO7A陽性(圖5B)，初步斷定遷移到柯底氏器上的細胞可以成功分化為毛細胞。最后，我們特異性檢測鈣粘連接蛋白E-cadherin和N-cadherin以及緊密連接蛋白ZO-1的表達情況來探究體外已經(jīng)證實過的存在于毛細胞和支持細胞之間的鈣粘連接和緊密連接是否在體內(nèi)依然能夠形成，結(jié)果顯示，移植細胞分化后相互之間依然有E-cadherin（圖6A）、N-cadherin（圖6B）和ZO-1（圖6C）的表達，且少量移植細胞與宿主組織之間也有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達。通過對三株細胞株的比較發(fā)現(xiàn)，三株不同來源的上皮樣祖細胞在內(nèi)耳中的遷移、分化以及E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達和分布方面并沒有明顯的差異。

圖5 移植細胞在白化榮昌豬內(nèi)耳中的遷移和分化。三株不同來源的表達EGFP的上皮樣祖細胞移植到榮昌豬內(nèi)耳四周后，均發(fā)現(xiàn)有細胞遷移到了毛細胞損傷部位-柯式器（A），并且部分細胞向毛細胞方向分化（B）。移植細胞由EGFP的表達顯示，誘導分化的毛細胞由MYO7A特異性標志，藍色標記的細胞核用來顯示耳蝸的結(jié)構(gòu)。比例尺為50μm。Fig.5 Migration and differentiation of OEPs transplanted into the inner ear of Rong-Chang swine.(A)Migration of cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs in the organ of Corti of the albino Rong-Chang swine.Scale bars=100 μm.(B)Differentiation of cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs toward inner hair cells in the organ of Corti.Scale bars=50 μm.Grafted cells were visualized by EGFP expression and differentiated hair cells were marked by MYO7A.Nuclei were stained with DAPI(blue).

圖6 移植細胞在體內(nèi)的連接。三株不同來源的上皮樣內(nèi)耳祖細胞遷移到柯式器上以后分化細胞之間以及移植細胞與宿主細胞之間E-cadherin（A）、N-cadherin（B）和ZO-1（C）的表達。移植細胞由EGFP的表達顯示，誘導分化的毛細胞由MYO7A特異性標志，藍色標記的細胞核用來顯示耳蝸的結(jié)構(gòu)。比例尺為50μm。Fig.6 Formation of Intercellular junctions by cells transplanted into inner ear.Expression of(A)E-cadherin,(B) N-cadherin and(C)ZO-1 in the cell-cell contact formed by cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs in the organ of Corti.Grafted cells were visualized by EGFP expression and hair cells differentiated were marked by MYO7A. Nuclei were stained with DAPI(blue).Scale bars=50 μm.

3 討論

隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，越來越多的科學家嘗試利用干細胞替換損傷的毛細胞[18-20]和聽覺神經(jīng)元[21-25]的方法來治療耳聾。Wei Chen等人將hESCs體外誘導分化成的內(nèi)耳祖細胞移植到成年的耳聾沙鼠模型中，發(fā)現(xiàn)細胞不僅成功分化成了螺旋神經(jīng)元細胞，而且產(chǎn)生了實質(zhì)性的功能恢復，這為將來的基于干細胞取代的聽覺神經(jīng)性耳聾的治療提供了很有前景的發(fā)展方向[6]。毛細胞被看作是耳聾治療的重要靶點，它的取代是聽力恢復的最徹底的治療。然而，幾乎沒有研究表明外源細胞已成功取代受損的毛細胞并改善聽覺功能，這可能是由于外源細胞很難整合進宿主組織。在體內(nèi)，支持細胞可以維持上皮細胞的生存環(huán)境，對毛細胞發(fā)揮功能起著重要的作用。因此，深入了解干細胞體外誘導分化的內(nèi)耳毛細胞樣細胞與支持細胞之間的相互作用關系可能會為外源細胞在宿主組織上的整合提供一定幫助。

在所有的內(nèi)耳感覺上皮中，毛細胞和支持細胞的有序排列對于聽力是必須的。在感覺上皮的表面，毛細胞和支持細胞的質(zhì)膜通過粘附連接和緊密連接相互作用，形成對柯底氏器的結(jié)構(gòu)完整性至關重要的網(wǎng)狀層[11]。粘附連接主要通過機械的連接相鄰的細胞以保持組織的完整性，而緊密連接主要是通過形成一個離子滲透屏障來保證內(nèi)淋巴液和外淋巴液的離子環(huán)境[26]。在網(wǎng)狀層中介導接觸的重要分子之一是鈣粘素，一種參與鈣依賴性細胞間粘附的跨膜糖蛋白家族，這個家族包括E-cad?herin、N-cadherin和P-cadherin。有研究已經(jīng)證明，在成年哺乳動物的柯底氏器上，鈣粘蛋白存在于毛細胞-支持細胞異型連接之間和支持細胞-支持細胞同型連接之間[10,27]。緊密連接由多種蛋白質(zhì)組成，包括 Occluding[28],claudins[29],zonula oc?cludens ZO）家族和其他細胞質(zhì)蛋白。緊密連接蛋白ZO-1存在于支持細胞-毛細胞異型連接和支持細胞-支持細胞同型連接中[11]。于是，我們通過檢測粘附連接蛋白（E-cadherin和N-cadherin）以及緊密連接蛋白（ZO-1）的分布探究體外誘導的毛細胞與支持細胞之間的關系。

為了探究移植的外源細胞能否遷移到柯底氏器中并與宿主細胞建立起聯(lián)系，我們將三株不同來源的上皮樣內(nèi)耳祖細胞移植到白化耳聾榮昌豬的內(nèi)耳中。以往進行的利用細胞取代策略治療耳聾的研究中，大家常選用小鼠，大鼠和其他嚙齒類動物。而在我們這次的研究中，采用小型豬作為動物模型。與傳統(tǒng)耳科研究中使用的嚙齒類動物相比，小型豬的優(yōu)勢在于其與人類基因組的高度同源性，以及其在內(nèi)耳解剖、內(nèi)耳形態(tài)及電生理等方面與人的相似性[32]。本次實驗采用的榮昌豬具有Mitf-M基因突變，可使血管紋發(fā)生病變，耳蝸發(fā)育不良，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和毛細胞數(shù)量減少，從而導致感覺神經(jīng)性耳聾[14]。我們這次研究的主要目標就是探究移植的外源細胞在內(nèi)耳中的遷移、分化以及在柯底氏器中細胞之間建立連接的情況。移植四周后，我們在柯底氏器周圍靠近蓋膜的地方發(fā)現(xiàn)了EGFP標記的細胞，這和以往的研究結(jié)果大體一致[33]。這些結(jié)果表明外源細胞可以從鼓階遷移到中階。然而，只有極少數(shù)量的細胞整合到聽覺上皮組織中。這可能是由于我們的動物模型是一種先天性耳聾模型，其耳蝸病變不是急性損傷，因此不能發(fā)生炎癥反應，并且在微環(huán)境中沒有炎癥細胞因子有效地促進外源細胞與聽覺上皮組織的整合[34]。在整個研究過程中，我們均采用三種不同來源的iPS細胞株同時進行實驗，結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，三株不同來源的iPS細胞誘導分化的支持細胞和內(nèi)耳毛細胞樣細胞之間在體外和體內(nèi)均能形成鈣粘連接和緊密連接，并且在E-Cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達和分布方面并無明顯差異。因此，我們初步推測MYO7A基因突變對于毛細胞和支持細胞間連接沒有明顯影響。當然，在本研究中使用的動物模型不是最佳的，特別是對于源自CP-iPSC的細胞的移植實驗。我們正在尋找MYO7A突變的動物模型，并將探究CP-iPSC來源的細胞對體內(nèi)毛細胞的形態(tài)和功能的恢復效應。

本研究通過一系列實驗得到最終結(jié)論：iPSCs誘導分化的內(nèi)耳毛細胞和支持細胞在體外和體內(nèi)均能形成鈣粘連接和緊密連接。更好的了解干細胞體外誘導分化的毛細胞與支持細胞之間的關系有助于基于毛細胞取代的干細胞治療耳聾的進一步研究和發(fā)展。

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Intercellular Junctions Between Hair Cell-like Cells and Supporting Cells Derived From Human iPSCs

WANG Cuicui1,CHEN Jianling1,TANG Zihua1,QIU Shiwei2,ZHANG Cui1,LI Liang1, GUO Weiwei2,YANG Shiming2,WANG Jinfu1
1 Institute of Cell and Development Biology,College of Life Sciences,Zijingang Campus,Zhejiang University, Hangzhou,Zhejiang 310058,P.R.China
2 Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853,China

WANG Jinfu Email:wjfu@zju.edu.cn

Obiective To examine the relationships between inner ear hair cells and supporting cells from induced pluripotent stem cells(iPSCs).Methods Normal iPSCs derived from a healthy donor(C-iPS),iPSCs with myosin7A mutation derived from a deaf patient(P-iPS)and iPSCs with myosin 7A corrected genetically(CP-iPS)were induced to differentiate into otic progenitors,and then OEPs were isolated from otic progenitors and induced to differentiate into inner ear hair cell-like cells and supporting cells.Immunofluorescence was used to examine in vitro formation of intercellular junctions between the induced hair cell-like cells and supporting cells.Furthermore,EGFP-OEPs derived from three iPSCs were transplanted into the inner ear of albino Rong-Chang swine via round widow to examine the migra-tion,differentiation and intercellular junctions between these cells.Results OEPs derived from iPSCs could be induced into hair cell-like cells and supporting cells simultaneously,and intercellular junctions such as adhering junctions and tight junctions were formed between hair cell-like cells and supporting cells derived from OEPs.After transplantation, the grafted cells could migrate from the scala tympani to the scala media.However,only a limited number of cells were integrated into the native auditory epithelial tissue,and some EGFP-cells integrated into the organ of Corti and expressed the hair cell marker MYO7A,indicating that these exogenous cells had differentiated into hair cell-like cells. Further immunolabeling assays showed production of adhering junction proteins(E-cadherin and N-cadherin)and a tight junction protein(ZO-1)between these differentiated cells and other cells,similar to what was observed in vitro. Conclusions Cell-cell interactions such as adhering junctions and tight junctions between hair cell-like cells and supporting cells derived from iPSCs can be formed not only in vitro but also in vivo.These results may facilitate the development of hair cells replacement-based strategy for deafness.

Deafness;IPSCs;Hair Cells;Supporting Cells;Intercellular Junctions

R764

A

1672-2922（2017）04-489-9

2017-06-21審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.04.020

國家重大基礎研究（973）項目，編號：2014CB541705

王翠翠，碩士，研究方向:干細胞治療感音神經(jīng)性耳聾的臨床基礎研究

王金福，Email:wjfu@zju.edu.cn