鄭堅(jiān)強(qiáng)+韓素娜+時(shí)錦錦+趙楠+彭新榜+司俊玲+許春平

摘要：將1株西方許旺酵母菌株應(yīng)用于降解類β-胡蘿卜素產(chǎn)生香味物質(zhì)的體系中，為生物技術(shù)制備香精香料提供研究基礎(chǔ)，對(duì)其液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定純種液態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件。以西方許旺酵母為試驗(yàn)菌株，采用搖瓶發(fā)酵的方式，研究培養(yǎng)基組分（碳源、氮源、無機(jī)鹽離子）及添加量與發(fā)酵培養(yǎng)條件（溫度、初始pH值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速）對(duì)菌種產(chǎn)雙加氧酶的情況。結(jié)果表明，培養(yǎng)基最優(yōu)組成為10.00 g/L葡萄糖、10.00 g/L 蛋白胨、5.00 g/L酵母粉、0.20 g/L FeSO4、0.45 g/L MgSO4·7H2O、3.00 g/L NaNO3、0.50 g/L KCl；最佳優(yōu)化條件為溫度27.90 ℃、起始pH值為7.21、轉(zhuǎn)速為160.00 r/min、接種量為5.00%，發(fā)酵時(shí)間為72.00 h，此時(shí)酶活性達(dá)到1.23 U/mL，5次中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠；通過響應(yīng)面分析發(fā)現(xiàn)，溫度、起始pH值作用極顯著，溫度和起始pH值交互顯著，客觀反映了微生物的發(fā)酵條件。

關(guān)鍵詞：西方許旺酵母；雙加氧酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0124-07

類胡蘿卜素廣泛分布于自然界中，是很多化合物的前體物質(zhì)，如C13-類胡蘿卜素（非萜類化合物），該化合物包括紫羅酮、二氫大馬酮等，是構(gòu)成茶葉、玫瑰、葡萄酒等的主要香味物質(zhì)[1]。這些化合物香味閾值低，其中很多是強(qiáng)有效的香氣化合物，已經(jīng)引起香精香料行業(yè)的極大關(guān)注[2]。從植物資源中萃取類胡蘿卜素降解的香味物質(zhì)生產(chǎn)成本高，而采用生物技術(shù)制備的香味物質(zhì)是純度高的天然化合物[3]。有學(xué)者利用泥土中的細(xì)菌、絲狀真菌降解類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為單環(huán)、雙環(huán)的單萜，但實(shí)際應(yīng)用很少，還沒有任何一個(gè)單萜類的生物轉(zhuǎn)化已經(jīng)商品化、工業(yè)化生產(chǎn)[4-6]。

目前學(xué)術(shù)研究主要采用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)裂解（降解）類胡蘿卜素，產(chǎn)生香味物質(zhì)[7]。在廣泛的篩選中，發(fā)現(xiàn)真菌、酵母菌具有降解類胡蘿卜素的潛在能力。在以金銀花為主要碳源化學(xué)成分的培養(yǎng)基中，有19種具有降解葉黃素的菌株（或者菌屬）被分離出來，在這些分離得到的菌種中，有2種在發(fā)酵時(shí)可產(chǎn)生揮發(fā)性化合物[8]。Zorn等研究報(bào)道，50多種絲狀真菌、酵母菌能有選擇性地降解β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為香味化合物，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為單萜、倍半萜、三萜、四萜等化合物[9-10]。王樹林等從沙棘汁中分離得到1株可降解β-胡蘿卜素的菌株，并對(duì)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化[11]。麻俊俠等探索適于β-胡蘿卜素降解葡萄球菌生長(zhǎng)的最佳化學(xué)合成培養(yǎng)基配方，試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中的碳源、氮源、礦物質(zhì)、各種生長(zhǎng)因子等進(jìn)行了研究，并確定了它們之間的配比，同時(shí)對(duì)發(fā)酵液的粗酶活進(jìn)行了初步探索[12]。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外對(duì)微生物定向降解類胡蘿卜素產(chǎn)生香味化合物進(jìn)行了初步研究，沒有進(jìn)行工業(yè)化生物降解類胡蘿卜素制備香味化合物生產(chǎn)的報(bào)道。此外，由于篩選的材料不同，導(dǎo)致篩選的菌株不同，菌株與培養(yǎng)基以及富含類胡蘿卜素的原料不同，從而使菌種的發(fā)酵條件不同，導(dǎo)致降解類胡蘿卜素生成的香味物質(zhì)種類和含量有差異。

試驗(yàn)以筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選的西方許旺酵母菌為培養(yǎng)菌株，研究培養(yǎng)基、發(fā)酵條件對(duì)微生物產(chǎn)酶的影響情況，從而分析微生物菌體代謝能力及菌種的產(chǎn)酶效果。提高菌株產(chǎn)氧化酶（雙加氧酶）能力，提高該微生物及其酶降解β-胡蘿卜素生成香味成分的含量。試驗(yàn)?zāi)康脑谟谔岣咴摼戤a(chǎn)雙加氧酶能力，為其后續(xù)在西方許旺酵母降解富含類胡蘿卜素產(chǎn)品（番茄、枸杞等）生成香味物質(zhì)的應(yīng)用中提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試劑β-胡蘿卜素（分析純，美國Sigma公司）；β-紫羅蘭酮（分析純，美國Sigma公司）；葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸銨、硫酸亞鐵、氯化鈉、石油醚、吐溫20、碳酸氫鈉、乳糖、硼酸、麥芽糖、蔗糖，均為分析純；酵母粉、瓊脂粉、蛋白胨、天冬酰胺、麥芽提取物，均為生物試劑。

1.1.2儀器LDZX-75KBS立式蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SPX-160B-2培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；QYC-200搖床（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DGX-8053B干燥箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；UV765紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；CF16RXI離心機(jī)（深圳市瑞鑫達(dá)科教儀器貿(mào)易部）；DK-S18水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；QL-866點(diǎn)動(dòng)儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）等。

1.1.3培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨 5.00 g/L，麥芽提取物3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，瓊脂粉1500～20.00 g/L，β-胡蘿卜素80.00 mg/L，121 ℃，滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，麥芽提取物 3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，K2HPO4 1.50 g/L，KCl 0.50 g/L，121 ℃，滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，麥芽提取物3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，MgSO4 0.50 g/L，NaNO3 3.00 g/L，F(xiàn)eSO4 0.01 g/L，β-胡蘿卜素110.00 mg/L，121 ℃，滅菌20 min。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌體生長(zhǎng)曲線的繪制西方許旺酵母菌種活化2代后，接種于150 mL種子培養(yǎng)基三角瓶中，28 ℃、160 r/min避光培養(yǎng)72 h后作為種子液。按5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量，接入裝有150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，于28 ℃、160 r/min 避光培養(yǎng)，每12 h取樣1次，用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度（D600 nm）。記錄吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。endprint

1.2.2搖瓶培養(yǎng)及菌種代謝產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)在300 mL錐形瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后，向錐形燒瓶中加入 1.0% 活化的菌液，在避光條件下28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)24 h后，將16 mg β-胡蘿卜素、10 g吐溫20溶解在二氯甲烷中，溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸餾除去，抽濾除菌，然后加無菌水稀釋至100 mL，平均加入到錐形瓶中，28 ℃、150 r/min，在避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并且每天對(duì)樣品進(jìn)行分析，剩余的β-胡蘿卜素和代謝物從培養(yǎng)上清液中用二氯甲烷萃取3次，60 ℃水浴蒸發(fā)至1 mL，進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.3目標(biāo)產(chǎn)物GC-MS分析條件色譜條件：毛細(xì)管柱：HP-5MS（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度 240 ℃；升溫程序：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升溫到 160 ℃，保持 2 min，再以8 ℃/min升溫到260 ℃，保持 15 min；載氣（He）恒流模式，流量1 mL/min；進(jìn)樣量2 μL，分流進(jìn)樣，分流比為25 ∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度160 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～455 m/z[13]。

1.2.4β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液的制備避光稱取5 mg β-胡蘿卜素溶于10 mL二氯甲烷中，待β-胡蘿卜素徹底溶解后加入1 g吐溫20進(jìn)行乳化。在避光條件下，將二氯甲烷徹底揮發(fā)干凈，倒入100 mL棕色容量瓶中定容，混合均勻，得到橘黃色清澈的β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液備用。

1.2.5β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別取β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液0、20、40、60、120、180、240、480 μL于棕色容量瓶中加蒸餾水定容至5 mL，以蒸餾水做空白對(duì)照，于450 nm處測(cè)定其吸光度，所得數(shù)據(jù)見圖1，得到β-胡蘿卜素溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系。

β-胡蘿卜素濃度與吸光度之間的線性方程：y=107.04x-0.432 6，決定系數(shù)r2=0.992。式中：y為β-胡蘿卜素濃度（μmol/L）；x為吸光度。

1.2.6粗酶液的制備搖瓶發(fā)酵后得到發(fā)酵液，發(fā)酵液 4 ℃、10 000 r/min、離心20 min。上清液即為粗酶液。

1.2.7β-胡蘿卜素的降解率及酶活性的計(jì)算取5 mL酶液（37 ℃水浴中保溫）并加入500 μL β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液，加入光程1 cm的玻璃比色皿中，以未加β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液的粗酶液作對(duì)照，立刻在450 nm處測(cè)其吸光度，測(cè)完后立即在37 ℃下避光水浴，每隔1 min測(cè)定1次吸光度。酶活性單位定義：在37 ℃、pH值為6.5條件下1 min降解1 μmol β-胡蘿卜素所需的酶量為1個(gè)單位。

β-胡蘿卜素降解率及酶活性的計(jì)算公式：

降解率=原有β-胡蘿卜素含量-現(xiàn)有β-胡蘿卜素含量原有β-胡蘿卜素含量；

酶活性=（C0-Ct）×（5.0+0.5）/5.0×t；

C0=初始β-胡蘿卜素含量（μmol/L）；

Ct=t min后β-胡蘿卜素含量（μmol/L）；

t=時(shí)間（min）。

1.2.8培養(yǎng)基優(yōu)選試驗(yàn)

1.2.8.1培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)（1）碳源篩選：分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉為發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一碳源，碳源濃度均為2%；氮源篩選：分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、（NH4）2SO4為發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一氮源，濃度均為10 g/L。葡萄糖添加量篩選：分別以5.00、10.00、1500、20.00、25.00、30.00 g/L 葡萄糖量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)；酵母粉添加量篩選：分別以3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00 g/L酵母粉量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)；蛋白胨篩選：分別以8.00、9.00、1000、11.00、12.00、13.00 g/L蛋白胨含量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)?；罨蟮奈鞣皆S旺酵母接入已滅菌的裝有150 mL培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，接種量5%（體積分?jǐn)?shù)），28 ℃培養(yǎng)72 h后，測(cè)定西方許旺酵母酶活性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)平均值。在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成。

（2）微量元素單因素試驗(yàn)：微量元素在西方許旺酵母生長(zhǎng)繁殖和代謝過程中起著重要的作用，影響菌株產(chǎn)酶能力。測(cè)定西方許旺酵母酶活性，試驗(yàn)主要考察Fe2+、Mg2+、Na+ 、K+對(duì)菌株產(chǎn)雙加氧酶的影響。FeSO4添加量篩選：分別以 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L FeSO4添加量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)；MgSO4·7H2O添加量篩選：分別以0.40、0.45、0.50、055、0.60 g/L MgSO4·7H2O添加量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)；NaNO3添加量篩選：分別以2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L NaNO3添加量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)；KCl添加量篩選：分別以4.00、4.50、500、5.50、6.00 g/L NaNO3添加量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。通過測(cè)定西方許旺酵母酶活性，研究微量元素的添加量對(duì)西方許旺酵母菌株產(chǎn)酶的影響。在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化微量元素組成。

配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基前，用0.1 mol/L HCl將微量元素成分配制成使用濃度100倍貯液，即每100 mL 0.1 mol/L HCl溶解一定量的FeSO4、MgSO4·7H2O、NaNO3、KCl，每配制 100 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基取100倍貯液1 mL即可。

1.2.9發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)以優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)。培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響：以溫度26.0、27.0、28.0、29.0、30.0 ℃等，于pH值7.0、160 r/min搖床培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響：用0.1 mol/L HCl、NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于 28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)72 h。endprint