周勝杰+路斌+賈婷婷+李連星+張揚(yáng)+劉興+陳成勛+馬志華

摘要：以點(diǎn)帶石斑魚（W池）、大菱鲆（D池）、紅鰭東方鲀（H池）及半滑舌鰨（B池）4個(gè)魚種循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中采集水樣為對象，采用平板分離法及液體培養(yǎng)法定量研究具有除磷能力的細(xì)菌及其特性。結(jié)果表明，4個(gè)系統(tǒng)中共培養(yǎng)16株除磷細(xì)菌；其中皮特不動(dòng)桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌具有較強(qiáng)的除磷能力和效果（皮特不動(dòng)桿菌>創(chuàng)傷弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌）；總除磷能力與細(xì)菌總濃度呈正相關(guān)；4種細(xì)菌去除NH4+-N效果為哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不動(dòng)桿菌>創(chuàng)傷弧菌；其中皮特不動(dòng)桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌具有除TN能力，去除TN的效果為皮特不動(dòng)桿菌>哈夫尼希瓦氏菌=創(chuàng)傷弧菌。

關(guān)鍵詞：循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)；細(xì)菌；除磷；氨氮；總氮

中圖分類號(hào)： S967.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0120-04

通信作者：陳成勛，研究員，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物增養(yǎng)殖學(xué)研究。E-mail：489699261@qq.com。隨著海水集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，餌料投放、養(yǎng)殖密度的提高使水體中營養(yǎng)鹽污染問題突出，為循環(huán)水系統(tǒng)磷處理壓力不斷增加。目前，循環(huán)水系統(tǒng)中除磷工藝主要靠的是微生物的解磷作用。高效的解磷菌可以有效地緩解集約化循化水系統(tǒng)中的除磷壓力。因此，篩選高效的除磷細(xì)菌成為了目前學(xué)者們的主要研究熱點(diǎn)。微生物分解環(huán)節(jié)嚴(yán)重受阻，成為水體系統(tǒng)循環(huán)過程的制約條件，造成水體富營養(yǎng)化甚至污染，引發(fā)出諸多病害、藥殘、食品隱患等問題。當(dāng)前，對養(yǎng)殖水體除磷方式的研究包括物理法、化學(xué)法、植物法（藻類、水草）、微生物學(xué)方法[1-6]，其中對不同養(yǎng)殖種類的集約化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中除磷細(xì)菌的種類及多樣性特征的報(bào)道較少。本研究以點(diǎn)帶石斑魚、大菱鲆、紅鰭東方鲀和半滑舌鰨4種集約化養(yǎng)殖種類的同種循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)作為研究對象，通過分離培養(yǎng)、篩選比較的方式進(jìn)行除磷菌研究，從而尋找循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中除磷能力較高的除磷菌，了解其多樣性特征，為集約化養(yǎng)殖循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池為研究對象，對其中可培養(yǎng)性細(xì)菌進(jìn)行分離提純。

普通可培養(yǎng)性細(xì)菌通用培養(yǎng)基：瓊脂15 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、蒸餾水100 mL，121 ℃高溫滅菌15 min。

無機(jī)磷液體培養(yǎng)基[7]：NH4Cl 0.50 g、檸檬酸鈉5.66 g、維氏鹽溶液50 mL、蒸餾水100 mL，pH值7.0。

維氏鹽溶液：K2HPO4 5.00 g、MgSO4·7H2O 2.50 g、FeSO2·7H2O 0.05 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、鹽度為1.5%的鹵水。

1.2主要儀器設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱（BS-1E型，環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；滅菌鍋（TOMY SX500型，上海麥森醫(yī)療科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD型，蘇凈安泰）；冷凍離心機(jī)（LEGEND MACH 1.6R型，Thermo）；紫外分光光度計(jì)（UVmini-1240型，東莞市塘廈眾和電子儀器設(shè)備商行）；光學(xué)顯微鏡（Leica DM500型，德國萊卡）。

1.3方法將采集到的樣本按10-3、10-4、10-5的濃度稀釋，并取一定量的稀釋液在普通用可培養(yǎng)性細(xì)菌培養(yǎng)基上涂布，24 ℃培養(yǎng)16～18 h。通過低倍顯微鏡觀察菌落外形（例如：菌落形狀、菌落顏色、邊緣是否光滑、邊緣線形狀、內(nèi)部紋理形狀等）將菌落進(jìn)行分類并標(biāo)號(hào)，統(tǒng)計(jì)每1種細(xì)菌菌落的數(shù)目，推算出濃度。將區(qū)分開的菌落通過平板劃線法進(jìn)行充分分離純化（3～4次），要求每一次都由單菌落進(jìn)行劃線。將分離純化后的細(xì)菌通過16S rRNA進(jìn)行測序。

利用無機(jī)磷液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離出的細(xì)菌24 h，測定無機(jī)磷含量變化同時(shí)測定氨氮與總氮的含量變化，計(jì)算其相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)在SPSS 19.0及Excel統(tǒng)計(jì)軟件上進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，細(xì)菌濃度、除磷能力、除氨氮能力和除總氮能力4個(gè)因素間沒有顯著相關(guān)性。而各循環(huán)水養(yǎng)殖池細(xì)菌總濃度與總除磷能力呈正比（r2=0.999）。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌種類鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

DNA分子的制備與分子發(fā)育樹的制作參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

16S rRNA測序的通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送至測序公司（北京金唯智生物股份有限公司）進(jìn)行純化和測序。測序獲得的16S rRNA基因序列長度為890～1 500 bp，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行Blast分析。序列對比采用Clustalx的多序列比對排列，系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega 5.05的鄰接法。

經(jīng)普通培養(yǎng)基平板24 ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)菌落的形態(tài)學(xué)特征（菌落形狀、顏色、邊緣是否光滑、菌落表面是否光滑、菌落紋路形狀等特點(diǎn)）從點(diǎn)帶石斑魚（W池）、半滑舌鰨（B池）、紅鰭東方鲀（H池）、大菱鲆（D池）4個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中分離并獲得16S rRNA基因有效序列的細(xì)菌16株。利用Blast檢索獲得的16S rRNA基因序列相似性最高的模式菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有檢測序列均與GenBank中已有的模式菌株16S rRNA基因序列相似性達(dá)98.0%以上，為已知菌種，其中相似度在99.0%以上的占 81.3%。分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，分離到的可培養(yǎng)細(xì)菌分別屬于變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）2個(gè)門，其中僅農(nóng)研所芽孢桿菌（Bacillus niabensis）屬于厚壁菌門，其余15株細(xì)菌均屬于變形菌門γ-變形菌綱，分別屬于弧菌目（Vibrionales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、交替單胞菌目（Alteromonadales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）4個(gè)目菌株數(shù)分別為7、5、2、1株，分別占43.8%、32.3%、12.5%、6.3%（圖1）。endprint

2.2可培養(yǎng)性細(xì)菌濃度比較

通過平板計(jì)數(shù)法可知，養(yǎng)殖點(diǎn)帶石斑魚的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中凈化池中的細(xì)菌濃度是最大的，養(yǎng)殖大菱鲆的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中的細(xì)菌濃度其次，細(xì)菌濃度最小的是養(yǎng)殖半滑舌鰨的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池。濃度最高的細(xì)菌為Vibrio ponticus，該細(xì)菌與濃度排名第二的約氏不動(dòng)桿菌存在于養(yǎng)殖點(diǎn)帶石斑魚的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中。其中，約氏不動(dòng)桿菌同時(shí)存在于石斑魚和大菱鲆2種循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。細(xì)菌濃度較小的是養(yǎng)殖大菱鲆的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池和養(yǎng)殖紅鰭東方鲀的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池，同時(shí)，它們也是含有可培養(yǎng)性細(xì)菌種類最多的凈化池，均含有5種可培養(yǎng)細(xì)菌。在養(yǎng)殖點(diǎn)帶石斑魚的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中分離出4株可培養(yǎng)性細(xì)菌，分別是Vibrio ponticus、約氏不動(dòng)桿菌、農(nóng)研所芽孢桿菌、皮特不動(dòng)桿菌，分離出可培養(yǎng)性細(xì)菌最少的凈化池是養(yǎng)殖半滑舌鰨的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，僅分離出哈維氏菌和副溶血弧菌2種細(xì)菌。濃度最低的可培養(yǎng)性細(xì)菌是存在于養(yǎng)殖點(diǎn)帶石斑魚的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中的皮特不動(dòng)桿菌（表1）。

2.3各細(xì)菌除磷、氨氮以及總氮性能比較

試驗(yàn)表明，在W池、D池、H池、B池中均有除磷能力較強(qiáng)的菌，分別是皮特不動(dòng)桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌，除磷能力分別為44.00%、22.00%、22.30%、2040%，除磷效果為皮特不動(dòng)桿菌>創(chuàng)傷弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中各菌株濃度與其除磷、除氮能力顯著相關(guān)；凈化池中細(xì)菌總濃度與總除磷能力顯著相關(guān)。除磷能力強(qiáng)的菌株對除NH4+-N有較強(qiáng)能力，去除NH4+-N能力分別為57.90%、73.90%、33.40%、73.80%；去除NH4+-N效果為：哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不動(dòng)桿菌>創(chuàng)傷弧菌；其中皮特不動(dòng)桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌具有去除TN的能力，去除率分別為5920%、19.10%、19.10%；去除TN的效果為皮特不動(dòng)桿菌>哈夫尼希瓦氏菌=創(chuàng)傷弧菌。約氏不動(dòng)桿菌同時(shí)存在于點(diǎn)帶石斑魚和大菱鲆養(yǎng)殖系統(tǒng)中，但是其除磷和去除 NH4+-N及TN的能力均有顯著差異（表1）。

3討論

本研究分離出16株細(xì)菌，分別為4株不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、7株弧菌屬（Vibrio）、1株假單胞菌屬（Pseudomonas）、2株希瓦氏菌屬（Shewanella）、1株克呂沃爾菌屬（Kluyvera）、1株芽孢桿菌屬（Bacillus），目前發(fā)現(xiàn)的聚磷菌有圓褐固氮菌、枯草芽孢桿菌、硝化桿菌屬、亞硝化桿菌屬、單胞菌屬、假單胞菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、棒狀桿菌屬、有色桿菌屬、微球桿菌屬、分支桿菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬等[9-13]。

測試結(jié)果表明，在生物濾池內(nèi)的所有細(xì)菌中，濃度最大的細(xì)菌并不是除磷、除氮能力最好的細(xì)菌，Shewanella seohaensis在養(yǎng)殖大菱鲆的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中占51.50%，但其實(shí)際除磷、除氮能力只有19.00%、0.00%。Wagne等發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬具有較好的除磷能力，但是對EBPR活性污泥中的不動(dòng)桿菌屬進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量少于活性污泥微生物種群總量的10%[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中點(diǎn)帶石斑魚養(yǎng)殖密度高對飼料的需求量較大，對水體潔凈度要求較低，水體中氮、磷含量較高[17-19]，Chrzanowski等發(fā)現(xiàn)氮、磷可促進(jìn)細(xì)菌生長，增加細(xì)菌的種群密度和均勻度，但優(yōu)勢種群豐度會(huì)降低[20-21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，點(diǎn)帶石斑魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中細(xì)菌的濃度是4種養(yǎng)殖池中最大的，且可培養(yǎng)性細(xì)菌種類較多，系統(tǒng)中細(xì)菌種類及密度跟所養(yǎng)殖的魚種類密切相關(guān)。

微生物的群落結(jié)構(gòu)與多樣性主要受外界環(huán)境影響。養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物不僅受水體中的餌料、排泄物、溫度、光照等因素影響，而且有研究表明其與腸道微生物有著密切的聯(lián)系。Leamaster等研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水鹽度會(huì)影響魚腸道菌群落結(jié)構(gòu)[22-25]，同時(shí)張皓等發(fā)現(xiàn)在同種養(yǎng)殖環(huán)境中魚的種類不同會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不同[26]，凌澤春等發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖魚類腸道微生物菌群與水體中菌群有一定的關(guān)系[27]，本研究發(fā)現(xiàn)4種魚類的養(yǎng)殖環(huán)境均相同（循環(huán)水系統(tǒng)、水源、飼料、溫度、光照等），而細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性明顯不同，有可能是受養(yǎng)殖產(chǎn)品的影響，說明養(yǎng)殖魚類對水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的影響作用。進(jìn)一步證明了養(yǎng)殖魚種與養(yǎng)殖水體中群落存在著相互作用關(guān)系。

在石斑魚循環(huán)水系統(tǒng)中提取出的皮特不動(dòng)桿菌，經(jīng)分離培養(yǎng)鑒定為1株聚磷細(xì)菌，除磷能力高于其他3株細(xì)菌，除磷率達(dá)到44.00%，是1株高效除磷細(xì)菌。在養(yǎng)殖環(huán)境中，可以通過溶磷作用將環(huán)境中的不溶或難溶性磷（磷酸三鈣等）轉(zhuǎn)化為可溶性磷[28]，并通過聚磷作用將無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為有機(jī)磷，從而為養(yǎng)殖環(huán)境中浮游動(dòng)植物提供營養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境。

本試驗(yàn)樣本來自循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的凈化池，水中含有較高的磷元素，通過細(xì)菌分離、純化得到了16株可培養(yǎng)性細(xì)菌，經(jīng)過液體定量培養(yǎng)基對細(xì)菌的除磷能力研究，結(jié)果顯示循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中可培養(yǎng)菌均有一定的除磷能力。試驗(yàn)表明，在W池、D池、H池、B池中均有除磷能力較高的菌，分別是皮特不動(dòng)桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌，除磷率分別為44.00%、22.00%、22.30%、20.40%。

經(jīng)測定半滑舌鰨和大菱鲆的養(yǎng)殖系統(tǒng)中可培養(yǎng)細(xì)菌的濃度及總除磷能力均相近。半滑舌鰨和大菱鲆均屬于鲆鰈類，其食性及生存方式相近，故在同等密度飼養(yǎng)及等量投喂餌料時(shí)，水體中無機(jī)鹽成分和濃度相似，其細(xì)菌濃度和總除磷除氮能力也相近[29-30]。試驗(yàn)結(jié)果表明，除磷性能好的菌株對氨氮和總氮有較好的清除能力，細(xì)菌的除磷和除氮可能是同時(shí)進(jìn)行的。關(guān)于除磷脫氮之間的相互作用還有待于進(jìn)一步探究。

4結(jié)論

（1）循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)凈化池中的細(xì)菌總濃度：點(diǎn)帶石斑魚>大菱鲆>紅鰭東方鲀>半滑舌鰨，這可能跟不同魚類的消化吸收能力不同有關(guān)。共分離出16株可培養(yǎng)細(xì)菌。endprint

（2）試驗(yàn)表明在B池、D池、H池、W池中均有除磷能力較強(qiáng)的菌，分別是皮特不動(dòng)桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌，除磷效果為皮特不動(dòng)桿菌>創(chuàng)傷弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌。

（3）發(fā)現(xiàn)4株除磷能力強(qiáng)的菌株對除NH4+-N也有較強(qiáng)能力，去除NH4+-N效果為哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不動(dòng)桿菌>創(chuàng)傷弧菌；同時(shí)具有較好的除TN能力，個(gè)別細(xì)菌（副溶血弧菌）除外，去除TN的效果為皮特不動(dòng)桿菌>哈夫尼希瓦氏菌=創(chuàng)傷弧菌。

（4）發(fā)現(xiàn)皮特不動(dòng)桿菌不僅具有反硝化功能及溶磷功能，在本研究中發(fā)現(xiàn)還是1株高效除磷細(xì)菌。

（5）養(yǎng)殖產(chǎn)品對養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物有一定的影響作用，該研究結(jié)果為集約化工廠化養(yǎng)殖水體的治理提供了有效的菌種資源信息，同時(shí)為反硝化除磷技術(shù)的應(yīng)用推廣提供了理論依據(jù)。

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